Articolo metodologico

Metodo standardizzato per la sterilizzazione di High-throughput di semi di Arabidopsis

DOI:

10.3791/56587

⸱

17 ottobre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Arabidopsis Biological Resource Center, Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University, 2Department of Molecular Genetics, Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo di questo studio era di determinare gli effetti della sterilizzazione del gas di cloro e candeggina su germinazione del seme di una gamma di Arabidopsis genotipi coltivati in terreno sterile. Sono stati sviluppati protocolli di sterilizzazione ottimizzato per impedire la crescita di contaminanti microbici fornendo al contempo sopravvivenza seme soddisfacente.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis thaliana Piantine (Arabidopsis) spesso bisogno di essere coltivato su terreno sterile. Ciò richiede sterilizzazione seme preventiva per prevenire la crescita di contaminanti microbici presenti sulla superficie del seme. Attualmente, i semi di Arabidopsis sono sterilizzati usando due tecniche di sterilizzazione distinti in condizioni che differiscono leggermente tra i laboratori e non sono state standardizzate, spesso con conseguente sterilizzazione solo parzialmente efficace o nella mortalità eccessiva seme. La maggior parte di questi metodi non sono anche facilmente scalabile per un gran numero di linee di semi diversi genotipi. Come tecnologie per analisi di alto-rendimento di Arabidopsis continuano a proliferare, tecniche standardizzate per la sterilizzazione dei numerosi semi di differenti genotipi sono sempre essenziali per lo svolgimento di questi tipi di esperimenti. È stata valutata la risposta di un certo numero di linee di Arabidopsis a due tecniche di sterilizzazione diversi basato sul tasso di germinazione del seme e il livello di contaminazione del seme con microbi ed altri agenti patogeni. I trattamenti incluso diverse concentrazioni di agenti e tempi di esposizione, combinati per determinare le condizioni ottimali per la sterilizzazione del seme di Arabidopsis di sterilizzazione. Sono stati sviluppati protocolli ottimizzati per due metodi di sterilizzazione diversi: candeggina (fase liquida) e cloro (Cl2) gas (fase gassosa), entrambi con conseguente tassi di germinazione di semi di alta e minima contaminazione microbica. L'utilità di questi protocolli è stato illustrato attraverso la sperimentazione di wild type e mutanti semi con una gamma di potenziali di germinazione. I nostri risultati indicano che semi possono essere efficacemente sterilizzati utilizzando qualsiasi metodo senza mortalità eccessiva seme, anche se sono stati osservati effetti nocivi di sterilizzazione per semi con minore potenziale di germinazione ottimale. Inoltre, un'equazione è stata sviluppata per consentire ai ricercatori di applicare le condizioni di sterilizzazione del gas cloro standardizzato per contenitori ermetici di diverse dimensioni. I protocolli descritti qui consentono sterilizzazione seme facile, efficiente e poco costoso per un gran numero di linee di Arabidopsis.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) è un organismo modello privilegiata per la ricerca di base e applicata in pianta biologia1,2,3. Mentre le condizioni standard per crescita di Arabidopsis sono stati affermati4, l'effetto di sterilizzazione di seme sulla vitalità del seme non è stato rigorosamente testato. Terreni solidi in lastre o scatole sono usato ordinariamente per facilitare la crescita delle piantine di Arabidopsis per molte applicazioni sperimentali, come l'identificazione di mutanti omozigoti letale in una popolazione segregating, osservazione dei fenotipi sparare e radice a presto fasi, isolamento del patogeno-libero tessuto, raccolta di grandi quantità di tessuto semenzale, selezione di piante resistenti alla droga o trasformanti e valutazione di germinazione1,2,3,4 . Semi raccolti da piante coltivate in una serra o camera di crescita occasionalmente sono contaminati da microrganismi e polvere. Crescita delle piantine di Arabidopsis su diversi tipi di terreno sterile richiede sterilizzazione preventiva seme per rimuovere i contaminanti microbici quali funghi e batteri presenti sulla superficie del seme. L'uso di un regime di sterilizzazione efficace seme è fondamentale per un equilibrio di alta germinazione, contaminazione minima e la pianta vigorosa crescita.

I due metodi più comuni utilizzati per la sterilizzazione del seme di Arabidopsis sono basati su candeggina commerciale (fase liquida) e gas di cloro (fase gassosa). Varie procedure sono state impiegate per entrambi fase liquida sterilizzazione1,4,5,6,7,8,9 , sterilizzazione del vapore-fase e 10 di Arabidopsis semi8,10,11,12,13,14,15 ,16. Tuttavia, mentre queste procedure sono state efficaci nell'effettuazione sterilizzazione seme dei genotipi utilizzati, un'analisi dettagliata degli effetti di trattamenti diversi sterilizzazione sui semi di differenti genotipi non è stata segnalata. Pertanto, l'ottimizzazione di queste procedure di sterilizzazione è necessaria per definire le condizioni in cui efficiente sterilizzazione è combinato con alta germinabilità.

Centro di risorse biologiche (ABRC) di The Arabidopsis è posizionata per) sperimentare la vitalità di sementi di una varietà di differenti genotipi nel vantaggio raccolta e b) di adottare le procedure di controllo della qualità applicate internamente e in risposta al feedback degli utenti sulla germinazione del seme. Gli obiettivi degli esperimenti presentati qui erano di determinare gli effetti dei vari metodi di sterilizzazione sulla germinazione dei semi di una gamma di Arabidopsis genotipi. Procedure di sterilizzazione ottimizzato che provocare tassi di germinazione di semi di alta mantenendo la contaminazione da agenti patogeni minimal sono presentate per la sterilizzazione a gas sia candeggina e cloro.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparazione di Murashige e Skoog (MS) medio: 1x

  1. aggiungere 4,31 g di MS basale miscela di sale, 10 g di saccarosio e 0,5 g di 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acido (MES) in un becher contenente 0,8 L di acqua distillata e mescolare per sciogliere. Controllare e regolare il pH a 5.7 utilizzando 1 M di idrossido di potassio (KOH). Aggiungere acqua distillata per fare 1 L.
  2. Dividere i media in due bottiglie da 1 L, 500 mL cadauna. Aggiungere 5 g di agar ad ogni bottiglia. Tenere il coperchio allentato.
  3. Autoclave per 20 min a 121 ° C, 15 psi con un ancoretta magnetica in bottiglia.
  4. Dopo la sterilizzazione in autoclave, mettete le bottiglie in un piatto mescolare a bassa velocità e lasci che il media MS raffreddare a 45-50 ° C (fino a quando la bottiglia può essere tenuta con le mani nude).
  5. a partire da questo passaggio, eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Aggiungere 500 µ l Gamborg ' s soluzione di vitamine per ogni bottiglia e mescolare il mezzo di MS per distribuire uniformemente la soluzione vitamina.
  6. Versare abbastanza media in piastre a coprire circa la metà della profondità della piastra.
  7. Lasciate raffreddare a temperatura ambiente per circa 1 h per consentire l'agar solidificare le piastre.
    Nota: Se le piastre non sono deve essere usato immediatamente, li avvolgono in plastica e conservare a 4 ° C (temperatura del frigorifero). Coperto di piastre, scatole o tubi con agar solidificato possono essere conservati per diverse settimane a 4 ° C in un contenitore ermetico.

2. Sterilizzazione dei semi di Arabidopsis con candeggina

  1. preparare il MS Piastre conformemente al punto 1 del protocollo. Autoclave 100 mL di acqua distillata allo stesso tempo come i Media di MS. Utilizzare questo più tardi come acqua di risciacquo e consente di sospendere i semi per aiutare nella placcatura.
    Nota: Se lo si desidera, miscela di agar 0,8% (p/v) (ad es. phytagar) può anche essere autoclavato in questo passaggio. La miscela di agar può essere sostituito con acqua distillata durante placcatura (passo 2.5.3.). La viscosità supplementare della miscela agar rende più facile ai semi di spazio sulla piastra o pianta in righe se necessario.
  2. Preparare 50% (v/v) di candeggina soluzione da utilizzare per sterilizzare i semi. Per diluire la candeggina, aggiungere 100 mL di candeggina per 100 mL di acqua distillata. Aggiungere 50 µ l di Tween 20 detergente alla soluzione di candeggina.
    Nota: Soluzione di candeggina preparata può essere conservata per fino a un mese, fino a quando viene aperto solo in condizioni di sterilità.
  3. Aliquot 100 semi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
  4. Sterilizzare i semi utilizzando una soluzione di candeggina al 50%.
    1. In una cappa a flusso laminare, aggiungere 500 µ l di soluzione di candeggina al 50% per il tubo del microcentrifuge contenente i semi. Toccare il fondo del tubo di sospendere i semi della soluzione di candeggina.
      Nota: In alternativa, un rotatore o shaker a piattaforma può essere utilizzato per tenere i semi sospesi.
  5. Risciacquare la soluzione di candeggina dal tubo.
    1. Dopo 10 min, rimuovere la soluzione di candeggina dal tubo del microcentrifuge utilizzando una pipetta o un aspiratore dotato di un puntale all'estremità.
    2. Aggiungere 500 µ l di acqua distillata sterile al tubo. Tappare la provetta e invertire per mescolare. Consentire semi a depositarsi sul fondo del tubo. Una volta che i semi sono depositati alla parte inferiore del tubo con attenzione rimuovere la soluzione di candeggina di pipettaggio. Ripetere l'operazione di risciacquo processo 6 volte.
    3. Aggiungere 1 mL di acqua distillata in autoclave al tubo di sospendere i semi.
  6. Piastra semi sterilizzati sulle piastre di MS.
    1. In una cappa a flusso laminare, etichettare il fondo del piatto con il nome e la data corrente MS.
    2. Versare i semi dal tubo del microcentrifuge sulla piastra di MS. Spargere i semi intorno alla piastra di MS utilizzando un'ansa sterile, monouso da inoculo o una pipetta sterile.
      Nota: Se semi devono essere seminati in righe, può essere utilizzata una pipetta con una punta di 200 µ l di individualmente i semi nelle posizioni desiderate. Per migliorare il flusso di semi, alla fine della punta della pipetta può essere tagliata da 3-5 mm utilizzando le forbici. Ogni seme fuori luogo o grappoli di semi può quindi essere riposizionati o separati utilizzando un'ansa da inoculo monouso sterile.
    3. Mettere la piastra di MS sul retro della della cappa a flusso laminare con il coperchio chiuso a metà. Permettere all'acqua in eccesso di evaporare dalla piastra MS.
    4. Mettere il coperchio sulla piastra di MS. Guarnizione piastra MS avvolgendo la piastra con carta microporosa chirurgica nastro (vedere la Tabella materiali).

3. Sterilizzazione del seme di Arabidopsis con Gas di cloro

  1. preparare il MS Piastre conformemente al punto 1 del protocollo. Autoclave 100 mL di acqua distillata allo stesso tempo come la MS Media; Questo verrà utilizzato in seguito per aiutare sospendere i semi per aiutare nella placcatura.
    Nota: Se lo si desidera, miscela di agar 0,8% (p/v) (ad es. phytagar) può anche essere autoclavato in questo passaggio. La miscela di agar può essere sostituito con acqua distillata durante placcatura (passo 3.6.2.). La viscosità supplementare della miscela agar rende più facile ai semi di spazio sulla piastra o pianta in righe se necessario.
  2. Prima di iniziare la sterilizzazione, calcolare la quantità di candeggina e acido cloridrico (HCl) per produrre gas di cloro necessaria.
    1. Calcolare la quantità di HCl necessari per produrre il 6.1% Cl 2 necessaria per la sterilizzazione.
    2. Utilizzare la seguente formula:
      figure-protocol-1
      con 7.000 mL come il volume del contenitore di sterilizzazione e 6.1% Cl 2; il volume di HCl è calcolato per essere 3ml.
      Nota: Un foglio di calcolo programmato per effettuare il calcolo per diversi volumi del contenitore e % Cl 2 viene fornito come supplementare nella tabella 1.
  3. Aliquot 100 semi in microcentrifuga 0,5 mL. Chiudere i tappi per ciascun flaconcino, posizionare le fiale in un rack di plastica e mettere da parte.
    Nota: Finché sono memorizzati in opportune condizioni, semi possono essere memorizzati per un periodo prolungato di tempo a questo punto. Condizioni di conservazione possono essere trovate nella sezione 3.3.2 del protocollo di Rivero e colleghi 4. piastra a 96 pozzetti formato può essere utilizzato anche.
  4. Preparare i materiali necessari per eseguire la sterilizzazione del gas cloro.
    1. Ottenere candeggina e HCl dalle loro posizioni di archiviazione.
    2. Taglio una striscia di paraffina grande film (Vedi la Tabella materiali) da utilizzare nel passaggio 3.5.3. per sigillare il contenitore per sterilizzazione.
    3. Inserire il contenitore di plastica con coperchio in cui la sterilizzazione si svolgerà all'interno di una cappa aspirante. Aprire i tappi su tutti i flaconi di seme e dispongono la cremagliera di seme intero all'interno del contenitore di plastica.
  5. Eseguire la sterilizzazione del gas di cloro a temperatura ambiente.
    Attenzione: Lavorare con candeggina e acido separatamente. Non lasciare una bottiglia non livellata per ridurre il rischio di fuoriuscite. Utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) compresi guanti e un camice da laboratorio. Se candeggina o acido spruzza su guanti, cambiare i guanti prima di maneggiare altri materiali. Rimuovere sempre i guanti nella cappa fumi in caso di contaminazione di candeggina o acido.
    1. Mettere un becher da 250 mL all'interno del contenitore e aggiungere 100 mL di candeggina.
      Nota: La reazione tra HCl e candeggina richiede almeno 22 volumi eccesso di candeggina. La reazione si consuma l'HCl e candeggina rilasciando gas 2 Cl con acqua e cloruro di sodio (NaCl) come sottoprodotti. Utilizzando un grande eccesso di candeggina consente il consumo di ulteriori HCl durante il periodo di ventilazione, che diminuisce la quantità di sodio bicarbonato (NaHCO 3) necessari per neutralizzare la soluzione per lo smaltimento.
      Attenzione: Il contenitore dovrebbe essere almeno due volte il volume totale di liquido di candeggina + HCl. Questo impedisce spruzzi evasione Becher durante il passaggio successivo, che possono danneggiare i semi, candeggina vestiti o bruciare la pelle esposta.
    2. Aggiungere 3 mL di HCl per il becher contenente candeggina.
      Attenzione: La reazione iniziale produce bolle, soprattutto alle concentrazioni di gas superiore a 6,1%. Un camice a maniche lunghe è necessario per questo passaggio.
    3. Chiudere il contenitore per sterilizzazione e sigillare con pellicola di paraffina immediatamente.
    4. Monitorare il contenitore per sterilizzazione durante il tempo di sterilizzazione per garantire l'accumulo di gas; l'accumulo di gas di cloro deve essere visibile come una debole foschia giallo all'interno del contenitore.
      Attenzione: Controllare periodicamente il contenitore di sterilizzazione per assicurare che la pressione all'interno non ha disarcionato il coperchio o pellicola di paraffina. Se il coperchio è venuto disarcionato o il film di paraffina si è allentato, chiudere il coperchio e avvolgere attentamente il contenitore con un ulteriore strato di pellicola paraffina.
    5. h dopo l'1-sterilizzazione periodo, aprire il contenitore di rimozione della pellicola di paraffina e aprendo il coperchio su un angolo. Consentire il contenitore sfogare per 3 ore per completare la reazione ed eliminare il gas cloro.
    6. Chiudere i tappi di tutte le provette microcentrifuga nel rack seme.
      Nota: Semi sterilizzati possono essere memorizzati fino a tempo di placcatura, purché essi sono immagazzinati in condizione asciutta.
    7. Rimuovere il rack di seme e posizionarlo in una cappa a flusso laminare.
    8. Neutralizzare la reazione del gas cloro
      1. aggiungere 1,5 g NaHCO 3 polvere lentamente per il becher contenente la soluzione di candeggina/HCl e mescolare con una bacchetta di vetro per sciogliere il NaHCO 3 nella soluzione. Continuare ad aggiungere NaHCO 3 fino a quando hanno smesso di bolle di gas di anidride carbonica (CO 2) formando.
        Attenzione: Aggiungere lentamente per evitare schizzi. Uso dei DPI appropriati, compresi i guanti e un camice da laboratorio.
      2. Verificare il pH della soluzione utilizzando strisce pH o un pH-metro. Aggiungere ulteriori NaHCO 3 se necessario fino a quando il pH della soluzione è neutro (pH 7.0). A questo punto la soluzione può essere rimosso dalla cappa fumi e smaltita secondo le linee guida di smaltimento tutti.
        Attenzione: Se durante lo smaltimento è notato alcun odore, quindi la soluzione dovrebbe immediatamente essere rinviata per la cappa.
  6. Piastra semi sterilizzati sulle piastre di MS.
    1. In una cappa a flusso laminare, etichettare il fondo del piatto con il nome e la data corrente MS.
    2. Aggiungere 500 µ l di acqua distillata sterile per ogni tubo del microcentrifuge per sospendere i semi. Versare semi verso la piastra di MS e spargere i semi in modo uniforme intorno alla piastra utilizzando un'ansa sterile, monouso da inoculo o una pipetta sterile.
    3. Mettere la piastra di MS sul retro della della cappa a flusso laminare con il coperchio chiuso a metà. Permettere all'acqua in eccesso di evaporare dalla piastra MS.
    4. Mettere il coperchio sulla piastra di MS. Sigillare la piastra MS avvolgendo la piastra con nastro chirurgico di carta microporosa.

4. Crescita di Arabidopsis sulle piastre di MS

  1. posizionare le piastre con il coperchio sulla parte superiore per tre giorni a 4 ° c e umidità ambiente.
    Nota: Questo processo si chiama stratificazione e serve per sincronizzare la germinazione dei semi individuali.
  2. Le piastre di trasferimento per l'ambiente di crescita.
    1. Mantenere temperatura a 23 ° C e intensità della luce a 120-150 µmol/m 2 s con luce di 16 h / 8h scuro fotoperiodo. Collocare i piatti piatto nell'ambiente crescere con il coperchio sulla parte superiore così le radici si sviluppano nel terreno.
  3. Let crescono le piantine sulle piastre per 8 giorni.
    Nota: Un periodo di crescita di 8 giorno permette tardi germinare semi di germinare. Piastre possono essere segnati prima di 8 giorni se tutti i semi hanno germinato.
  4. Punteggio ottenuto i tassi di germinazione.
    1. Record il numero di semi che hanno germinato e che non hanno germinato. Tasso di germinazione viene calcolato dividendo il numero di semi germinati per il numero totale di semi sul piatto.
      Nota: Germinazione viene conteggiato quando la radichetta ha proiettato fuori il cappotto di seme e i due cotiledoni sono visibili.
    2. Anche contare il numero di semi colpiti da muffa per determinare l'efficacia delle condizioni di sterilizzazione.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Semi di Arabidopsis raccolti da una camera aperta del campo, serra o crescita a volte sono contaminati da vari microrganismi come batteri e funghi1,4. Così, germinazione di semi sul terreno sterile può essere particolarmente impegnativo a causa della contaminazione delle piastre, soprattutto quando la fornitura di sementi è limitato. Il protocollo ottimizzato per la sterilizzazione a gas candeggina e il cloro, i cui risultati sono presentati qui di seguito, riduce al minimo questo problema e preserva la vitalità dei semi richiesto per le applicazioni ad alta velocità.

Effetti di sterilizzazione di candeggina sulla germinazione dei semi di Arabidopsis Col-0

Bleach è l'agente più comunemente utilizzato per la sterilizzazione di seme in numerose specie di piante. La concentrazione ottima dell'agente di sterilizzazione e il tempo di esposizione varia tra specie. Diversi protocolli sono stati impiegati con candeggina per la sterilizzazione di Arabidopsis semi1,4,5,6,7,8,9 , 10. quattro differenti concentrazioni di candeggina con cinque tempo di esposizione diversi periodi sono stati testati e i risultati sono presentate in Figura 1. I trattamenti sono stati applicati ai semi di Columbia selvaggio-tipo (Col-0). L'effetto della concentrazione di candeggina sulla germinazione dei semi di Col-0 varia a seconda del tempo di sterilizzazione, come dimostrato da un'interazione significativa fra concentrazione di candeggina e tempo di sterilizzazione (Figura 1, P < 0.001, ANOVA-analisi della varianza).

Negli esperimenti con tempi di sterilizzazione tra 5 e 10 min, trattamenti con tutte le concentrazioni di candeggina provocato ugualmente alta germinabilità dei semi Col-0 (Figura 1). Tariffe alta germinazione inoltre sono state osservate per le concentrazioni di candeggina per uso domestico del 40% e 50% per tutti i tempi di sterilizzazione. Trattamenti con candeggina 80% e 100% per periodi più lunghi di 10 min ha provocato una significativa diminuiscono del tasso di germinazione rispetto ai tempi di immersione totale (P < 0.01, ANOVA). Inoltre, per l'80% e il 100% di candeggina trattamenti per 20 min, germinazione è stata significativamente diminuita rispetto al corrispondente 40% e 50% candeggina trattamenti (P < 0.001, ANOVA).

Semi vari livelli di candeggio e avvizzimento quando usando candeggina alte concentrazioni per 15 min o più visualizzati. In aggiunta alla relativamente alta (fino a 32%) mortalità seme, semi germinati sterilizzati in queste condizioni spesso ha mostrate i difetti di crescita, si riflette in un fallimento dei cotiledoni e ipocotili per spiegare e allungare, con conseguente arresto dello sviluppo. Maggior parte dei trattamenti (14 su 20) erano completamente privo di muffa, con conseguente muffa livello media complessiva di 0,21% ± 0,003 (tabella 1).

Un trattamento con candeggina al 50% e un tempo di macerazione di 10 min è stato selezionato come il miglior regime di sterilizzazione perché combinato alto tasso di germinazione con buona inibizione di sviluppo del patogeno superficiale. Questo trattamento è stato selezionato per testare l'effetto di sterilizzazione di candeggina su diverse linee mutanti come descritto di seguito.

Effetti della sterilizzazione del gas di cloro sulla germinazione dei semi di Col-0

Per ottimizzare le condizioni di sterilizzazione del gas di cloro, tre differenti concentrazioni di gas di cloro sono state usate per sterilizzare semi Col-0 per due periodi di tempo (tabella 2). La concentrazione di gas è stata calcolata in base il volume di HCl concentrato e il volume del contenitore di sterilizzazione usando la seguente equazione:

figure-results-1

Questa equazione è stata derivata utilizzando la legge dei gas perfetti assumendo 12,3 M HCl, una temperatura di 23 ° C e pressione atmosferica standard di 101,3 kPa.

L'effetto della concentrazione di gas di cloro sulla germinazione dei semi di Col-0 è stato indicato per dipendere dal tempo di sterilizzazione, come indicato da un'interazione significativa fra il tempo e i fattori di concentrazione (Figura 2A, P < 0.01, ANOVA) . Concentrazione di gas di cloro ha avuto alcun effetto significativo sulla germinazione dei semi di Col-0 sottoposto a sterilizzazione 1 h. Con questo tempo di sterilizzazione, tutte le concentrazioni di gas di cloro promosso allo stesso modo alti livelli di germinazione, superiore all'85% (P > 0,05, ANOVA). D'altra parte, una sterilizzazione h-lungo 3 ha provocato una diminuzione significativa del tasso di germinazione per la più alta concentrazione di gas di cloro, confrontato con le due concentrazioni più basse di gas (P < 0,05, ANOVA). Questi risultati indicano che i trattamenti di semi di Arabidopsis con una qualsiasi delle concentrazioni del gas di cloro testata per 1 h, o con le concentrazioni di gas inferiore al 16,5% per 3 h, sono ugualmente efficaci nel preservare la vitalità del seme dal momento che i tassi di germinazione erano sempre maggiori al 82%. Tuttavia, semi per 3 h con 16,5% gas di sterilizzazione è stato dannoso per la germinazione dei semi.

Anche l'incidenza di muffa era dipenda sulla concentrazione di gas e tempo di esposizione. Crescita di muffa efficacemente è stata inibita con concentrazioni relativamente elevate di gas di cloro 6,1% e 16,5% per 1 h-lungo trattamento e con tutte le concentrazioni di gas per 3 h (Figura 2B).

Basato su questi risultati, un trattamento con una concentrazione di gas del 6,1% per 1 h (tabella 2) è stato selezionato come la migliore condizione per sterilizzazione a vapore-fase per testare l'effetto di sterilizzazione a gas su diverse linee mutanti, poiché ha combinato (tasso di germinazione alta 85%) con bassissimo livello di contaminazione di muffa (0,02%).

Effetti della sterilizzazione del gas di cloro e candeggina sui semi con diversi potenziali di germinazione

L'analisi statistica ha mostrato che la risposta di germinazione a metodi di sterilizzazione dipendeva il potenziale di germinazione delle linee (Figura 3A, P < 0.01, ANOVA). Sterilizzazione a gas né candeggina né cloro ridotto tasso di germinazione dei semi con elevato potenziale di germinazione (gruppi di 4 e 5). Né il trattamento ha avuto un effetto sul tasso di germinazione già basso del gruppo con il più basso di germinazionepotenziale (gruppo 1). Al contrario, sterilizzazione del gas di cloro ha provocato una riduzione significativa di circa 12-18% (P < 0.01, ANOVA) nella germinazione dei semi con potenziale di germinazione intermedio (gruppi 2 e 3). Candeggina sterilizzazione inoltre è diminuito tasso di germinazione del 13% del gruppo 2, ma esso non ha fatto diminuire il tasso di germinazione del gruppo 3. Anche se non c'era differenza significativa nel tasso di germinazione tra la candeggina e il cloro trattamenti di gas in qualsiasi gruppo di germinazione (Figura 3A, P > 0.442, ANOVA), semi sterilizzati con candeggina hanno avuto un leggermente superiore tasso di germinazione di semi sterilizzati con gas in tutti i gruppi di germinazione.

Trattamenti di sterilizzazione alterati significativamente (P < 0.001, ANOVA) la percentuale di semi colpiti da muffa (Figura 3B). Entrambi sterilizzazione di candeggina e gas di cloro ha provocato meno crescita di muffe (P < 0,05, ANOVA) rispetto a nessuna sterilizzazione. Non c'era differenza nel livello di muffa rilevata tra gas e candeggina sterilizzazione in qualsiasi gruppo (Figura 3B, P > 0,4, ANOVA).

figure-results-2
Figura 1: gli effetti del tempo di concentrazione e sterilizzazione di candeggina sulla germinazione dei semi di Arabidopsis Col-0. I valori sono mezzi ± SD ottenuta da 5 replicazioni indipendenti dell'esperimento. * indica le differenze significative rispetto a 5min ammollo durata per un intervallo di concentrazioni di candeggina (P < 0.01, ANOVA). #indica le differenze significative di 80% e 100% candeggina concentrazioni rispetto al 40% e 50% per un 20 min periodo di tempo (P < 0.01, ANOVA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 2: gli effetti del cloro gas concentrazione e sterilizzazione tempo sui semi di Arabidopsis Col-0. (A) (B) muffa livello e tasso di germinazione. Barre di errore rappresentano mezzi ± SD ottenuta da 5 biologici e tecnici 5 replicazioni dell'esperimento. Significa che non condividono una lettera sono significativamente differenti (P < 0,05, ANOVA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 3: effetti della sterilizzazione del gas di cloro e candeggina sui semi con diversi potenziali di germinazione. (A) (B) muffa livello e tasso di germinazione. Le 100 righe di SALK T-DNA sono state classificate in cinque gruppi secondo la loro germinazione potenziale definiti come il tasso di germinazione in assenza di qualsiasi agente di sterilizzazione. I gruppi sulla base del tasso di germinazione erano come segue: gruppo 1 (0-20%), gruppo 2 (21-50%), gruppo 3 (51-70%), gruppo 4 (71-90%) e gruppo 5 (91-100%). Le linee sono stati scelti in modo casuale e loro germinazione potenziale non dipendeva dal genotipo. I valori sono mezzi ± SD ottenuti da tre repliche indipendenti dell'esperimento. Lettere ("a", "ab", "c", ecc.) sopra ogni valore indicano i raggruppamenti statistici dei mezzi di categoria. Significa che non condividono una lettera sono significativamente differenti (P < 0,05, ANOVA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tempo di sterilizzazione (min)Concentrazione di candeggina (%)
405080100
50.00%0.00%0.00%2.13%
80.00%0.00%0.00%0.00%
100.00%0,50%0.00%0,36%
150.00%0.00%0.00%0.68%
200,19%0.28%0.00%0.00%

Tabella 1: Livello di stampo di candeggina-sterilizzata semi Col-0.

CandegginaHClTempo% Gas di cloro (mol gas totale Cl2/mol)
(mL)(mL)(h)
25112.1
25132.1
100316.1
100336.1
2009116,5
2009316,5

Tabella 2: Cloro (Cl2) gas trattamenti di sterilizzazione sui semi di selvaggio-tipo Columbia utilizzando un contenitore di 7 L.

Supplementare tabella 1: Un foglio di calcolo programmato per effettuare il calcolo per diversi volumi del contenitore e % Cl2. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quando crescere semi di Arabidopsis su terreno sterile, qualche forma di sterilizzazione deve essere applicato. Trattamenti di sterilizzazione di gas sia candeggina e cloro causare inibizione simile di crescita tasso e muffa di germinazione. Nessuno dei due metodi di sterilizzazione causa una riduzione significativa nel tasso di germinazione di semi con alta germinazione potenziale; Tuttavia, candeggina sterilizzazione è consigliata per linee con più basso potenziale di germinazione (20-70%), dovuto la piccola, seppur non significativo, miglioramento nel tasso di germinazione rispetto alla sterilizzazione del gas (Figura 3A).

Semi di Arabidopsis con concentrazioni di candeggina da 40-100% per fino a 10 min di sterilizzazione fornisce percentuali di germinazione soddisfacente e muffa efficace soppressione. Anche se le concentrazioni di candeggina meno del 40% fornire adeguata sterilizzazione per la maggior parte delle partite di sementi, utilizzando una concentrazione di 40% o superiore garantisce una sterilizzazione efficace anche pesantemente contaminati di lotti di sementi. È importante non superare i 10 min di sterilizzazione quando usando candeggina concentrazioni pari o superiori a 80% per evitare difetti di sviluppo del semenzale e semi di alta mortalità.

Il trattamento semi di Arabidopsis con le concentrazioni di gas di cloro del 6,1% e 16,5% per risultati 1H in tassi di germinazione alta e muffa adeguata eliminazione. Concentrazione di gas di cloro basso (2,1%) può essere utilizzato con successo da aumento della durata della sterilizzazione a 3 h.

Quando poche righe devono essere sterilizzati, si consiglia sterilizzazione liquida in una soluzione di candeggina al 50% per 10 min. Per un numero maggiore di righe, sterilizzazione a gas con una concentrazione di gas del 6,1% per 1 h è un'opzione migliore poiché molte linee possono essere sterilizzati in modo facile e veloce con meno manipolazione.

I nostri risultati forniscono condizioni standardizzate per la sterilizzazione sia grande numero di semi di diversi genotipi e i semi con basso potenziale di germinazione. L'unica limitazione di queste tecniche di sterilizzazione è che non possono essere applicati ai semi con tassi di germinazione meno del 20% a causa di mortalità di vasto seme. Metodi alternativi, come sonicazione17, per aumentare il tasso di germinazione in assenza di sterilizzazione potrebbero essere utile in quei casi.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare Gauri Datta per la sua assistenza nella preparazione di materiali sperimentali. Siamo inoltre grati a Bettina Wittler e James Mann per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NSF sovvenzioni DBI-1049341 e MCB-1143813.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette per microcentrifuga da 0,65 mLGeneMateC-3260-5Provetta in cui vengono inseriti i semi di Arabidopsis thaliana per eseguire la sterilizzazione
Provetta per microcentrifuga da 1,7 mLGeneMateC-3262-1Provetta in cui vengono posizionati i semi di Arabidopsis thaliana per eseguire la sterilizzazione
Contenitore in plastica da 7 LSistema1016265438Contenitore in cui viene eseguita
la sterilizzazione a gasHClconcentrato Sigma-Aldrich320331Sostanza chimica utilizzata nel processo di creazione del cloro
gassoso Loop di inoculazione sterile monousoFisher Scientific22-363-603Loop viene utilizzato per spargere o posizionare i semi di Arabidopsis su piastre MS
Gamborg' s soluzione vitaminicaSigma-AldrichG1019Soluzione vitaminica utilizzata nel processo di produzione di terreni MS
Candeggina per uso domesticoCloroxRegular-BleachProdotto chimico utilizzato nel processo di creazione di cloro gassoso e sterilizzazione liquida
MES idratoSigma-AldrichM2933Sostanza chimica utilizzata nel processo di produzione di terreni MS
Nastro chirurgico microporoso3M1530-1Nastro di carta chirurgica microporosa utilizzato per sigillare le piastre MS
Miscela di sali basali Murashige e Skoog (MS)Sigma-AldrichM5524Sostanza chimica utilizzata nel processo di produzione dei media MS
Parafilm MBemis Company#PM996Film di parraffina utilizzato per sigillare il contenitore di sterilizzazione
Piastra di Petri 100 X 15 mm Fisher ScientificFB0875713Piastre di Petri in cui vengono versati terreni MS allo scopo di coltivare strisce indicatrici di pH per Arabidopsis thaliana
Whatman2613991Utilizzato per controllare il pH della soluzione neutralizzata di cloro e bicarbonato di sodio
FitoagarFisher Scientific50-255-212Utilizzato per aiutare nella sospensione dei semi di Arabidopsis nel processo di impiattamento dei semi
Bicarbonatodi sodioSigma-AldrichS5761Sostanza chimica utilizzata nel processo di neutralizzazione della reazione del cloro gassoso
SaccarosioSigma-AldrichS0389Sostanza chimica utilizzata nel processo di produzione di terreni MS
Tween 20Fisher BioReagentsBP337-100Sostanza chimica utilizzata nel processo di sterilizzazione liquida
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgCS70000 (Col-0)Semi di tipo selvatico di Arabidopsis 
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_037606Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_041402CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_059101CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 1
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_063470CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 1
Arabidopsis thaliana sementiABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_072048Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 1
Semidi Arabidopsis thalianaABRC; Ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_072240CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081989CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_084124CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_085049Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_089717CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_107354CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110111CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Arabidopsis thaliana sementiABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_111322CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Semidi Arabidopsis thalianaABRC; Ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_113109CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 1 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_114702C Semi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_114872CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_115657Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_116803CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_039445CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 2 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_039782Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 2 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_043037Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 2
Semidi Arabidopsis thalianaABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_045828Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 2
Arabidopsis thaliana seeds; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_048556CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del gruppo 2
Arabidopsis thaliana seeds; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_049514CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del gruppo 2
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_049725Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_080816CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081176CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 2
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081770Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 2
Arabidopsis thaliana sementiABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_082262Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 2
Semidi Arabidopsis thalianaABRC; Ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_082289Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_082702CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_083630CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_084635Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_085337CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_085656CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 2 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_093049CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 2 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_103332CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Semidi Arabidopsis thalianaABRC; Ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_105336C semi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_105704CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_106388CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_109575Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110580CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110617CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_111424CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_111584CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del gruppo 2
Arabidopsis thaliana seedsABRC; Ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_112097Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seeds: ABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_113339CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Arabidopsis thaliana seeds: ABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_115837CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 2
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_019535Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 3
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_026478CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 3
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_046565CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 3
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_049258Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 3
Arabidopsis thaliana sementiABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_049339Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 3 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; Ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_056307Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 3
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081292C Arabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 3
Arabidopsis thaliana seeds; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081597CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 3
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_083488Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 3
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110573CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 3
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_112793CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 3 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_113658CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 3 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_113904CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 3
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_114673Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 3
Arabidopsis thaliana seeds; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_114709C Arabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del gruppo 3
Arabidopsis thaliana seeds; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_115455CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del gruppo 3
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_013186Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 4
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_018261CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 4
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_062509CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 4 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_080639C Semi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 4
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_088586CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 4
Semidi Arabidopsis thalianaABRC; Ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_096651CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 4
Arabidopsis thaliana seeds: ABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_106900CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 4
Arabidopsis thaliana seeds: ABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110131CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 4
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_111051Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 4
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_111245CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 4
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_113223CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 4 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_121391CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 4 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_125097CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 4
Semidi Arabidopsis thalianaABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_201905Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 4
Arabidopsis thaliana seeds; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_210001CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del gruppo 4
Arabidopsis thaliana seeds; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_000662CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del gruppo 5
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_029335Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 5
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_047760CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del gruppo 5
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_071275CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 5 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_080530Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 5 Semi di
Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_103881CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 5
Semidi Arabidopsis thalianaABRC; Ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110864CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 5
Arabidopsis thaliana seeds: ABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_120294CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 5
Arabidopsis thaliana seeds: ABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_124390CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 5
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_132808Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 5
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_137036CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 5
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_139519CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 5
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_140643CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 5
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_142288CSemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del gruppo 5
Arabidopsis thaliana seedsABRC; Ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_143304Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte del Gruppo 5
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_147597CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 5
Arabidopsis thaliana seedsABRC; ordina tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_209076CArabidopsis seeds utilizzati nei test come parte del Gruppo 5
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081081Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte dei gruppi 5 e 1
Semi di Arabidopsis thalianaABRC; ordinare tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_107487Csemi di Arabidopsis utilizzati nei test come parte dei gruppi 5 e 2

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2002).
  2. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
  3. The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
  4. Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).
  5. Yamada, K., et al. Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome. Science. 302 (5646), 842-846 (2003).
  6. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes. Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).
  7. Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins. PLoS One. 8 (9), e73291(2013).
  8. Podar, D. Plant growth and cultivation. Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).
  9. Xu, W., et al. An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 3, 1273(2013).
  10. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (1998).
  11. Cederholm, H. M., Benfey, P. N. Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development. New Phytol. 207 (3), 683-691 (2015).
  12. Ye, G. N., et al. Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation. Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).
  13. Kuromori, T., et al. A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis. Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).
  14. Fiers, M., et al. The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway. Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).
  15. Stepanova, A. N., Alonso, J. M. PCR-based screening for insertional mutants. Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).
  16. O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome. Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).
  17. López-Ribera, I., Vicient, C. M. Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds. Plant Methods. 13 (31), (2017).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Arabidopsis Seed SterilizationBleach SolutionChlorine GasSeed Germination RateMicrobial ContaminationLaminar Flow HoodFume HoodSterile Distilled WaterMS PlateSeed Stratification

Articoli correlati