Nel manoscritto, descriviamo l'uso di un'analisi del reporter di fluorescenza basati su lievito per identificare componenti cellulari coinvolti nel traffico e uccidere i processi dei citotossici una subunità della ricina di tossina della pianta (RTA).
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Articolo metodologico
Un'analisi del Reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (RTA) tratta di lievito
In questo articolo
Sommario
Abstract
Batterica e centrale un / tossine B sfruttano le naturali vie di traffico nelle cellule eucariotiche per raggiungere i loro target intracellulare nel citosol e infine uccidere. Un / tossine B consistono generalmente di un enzimaticamente attivo Asubunit (ad es., tossina ricina un (RTA)) e uno o più celle, associazione Bsubunit(s), che sono responsabili di tossina vincolante a specifici recettori di superficie di cella. La nostra attuale conoscenza di come A / B tossine sono in grado di efficientemente inebrianti cellule ha aiutate gli scienziati per comprendere i meccanismi cellulari fondamentali, come endocitosi e proteina intracellulare in cellule eucariotiche superiori. Da un punto di vista medico, allo stesso modo è importante identificare le rotte del narcotraffico tossina principali per trovare soluzioni adeguate di trattamento per i pazienti o per eventualmente sviluppare applicazioni basate su tossina terapeutiche per la terapia del cancro.
Dall'analisi del genoma della A / tossina B traffico in cellule di mammifero è complesso, lungo e costoso, parecchi studi sulla A / trasporto di tossina B sono stati effettuati nell'organismo modello lievito Saccharomyces cerevisiae. Pur essendo meno complessi, fondamentali processi cellulari in lievito e cellule eucariotiche superiori sono simile e molto spesso i risultati ottenuti in lievito possono essere trasferiti alla situazione dei mammiferi.
Qui, descriviamo un'analisi del reporter di veloce e facile da usare per analizzare il traffico intracellulare di RTA in lievito. Un vantaggio essenziale del nuovo test è la possibilità di indagare non solo RTA retrò-traslocazione dal reticolo endoplasmatico (ER) nel citosol, ma piuttosto di endocitosi e retrograda tossina trasporto dalla membrana plasmatica in ER. Il test si avvale di un plasmide del reporter che permette la misura indiretta della tossicità di RTA attraverso l'emissione di fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP) dopo la traduzione in vivo . Poiché RTA previene efficacemente l'inizio della biosintesi della proteina da depurinazione rRNA 28S, questo test consente l'identificazione delle proteine della cellula ospite coinvolti nel trasporto intracellulare di RTA attraverso la rilevazione dei cambiamenti nell'emissione di fluorescenza.
Introduzione
Pazienti affetti da infezioni da batteri che producono la tossina rappresentano un grave onere medico e finanziario per ogni sistema di assistenza sanitaria sociale, in particolare quanto efficaci trattamenti terapeutici sono ancora in gran parte mancante. Per sviluppare nuove strategie terapeutiche, i meccanismi complessi intossicazione della medicamente relativi A / tossine B come la tossina del colera, produttore della tossina Shiga o ricina ha bisogno di essere compresa a livello molecolare, basato sul romanzo saggi potente che devono essere implementati.
Negli ultimi anni, diversi studi ha tentato di analizzare A / trasporto di tossina....
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Protocollo
Nota: Una panoramica del flusso di lavoro sperimentale generale è raffigurata nella Figura 1.
Attenzione: RTA è altamente tossico per gli esseri umani. È necessaria l'autorizzazione del laboratorio di sicurezza S2 (livello di biosicurezza 2 equivalente). Si prega di indossare guanti durante l'intero esperimento.
1. eterologhi di sua etichetta RTA in Escherichia coli
- Trasformare le cellule di Escherichia coli con l'espressione del plasmide pET24-RTA(sua) 6 o il vettore vuoto pET24a(+) utilizzando protocolli standard elettroporazione<....
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Risultati
Il flusso di lavoro generale del protocollo descritto in questo manoscritto è illustrata nella Figura 1, approssimativamente che riassume i singoli passaggi per successo RTA purificazione e il successivo esperimento di analisi del reporter GFP. Una descrizione più dettagliata di ogni singolo passaggio può essere trovata nel protocollo. La figura 2 illustra il risultato previsto di una purificazione di RTA successo da cromatografi.......
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Discussione
Quando si esegue il protocollo di cui sopra, si consiglia i seguenti suggerimenti per ottenere un risultato di successo dell'esperimento.
Per l'espressione della proteina eterologa, è importante non superare la concentrazione di IPTG di 1 mM. Concentrazioni di IPTG > 1 mM inibire indotta da promotore espressione di RTA e piombo per abbassare i rendimenti di tossina. Inoltre, le cellule non vanno coltivate a temperature superiori a 28 ° C per impedire la formazione del corpo di inclusione, .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Parti di questo studio sono state gentilmente sostenuta da una sovvenzione del Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ceppi batterici e di lievito | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000< | |
| em>S. cerevisiae BY4742 mutanti da delezione | Dharmacon | YSC1054 | intera collezione |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Plasmidi utilizzati in questo protocollo | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Nome | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | enzima litico per parete cellulare rimozione |
| LB brodo medio | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar è stato aggiunto per la produzione di piastre |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Solfato di ammonio | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Lievito drop-out mix supplemts senza leucina | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucosio | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinosio | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitolo | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galattosio | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | ||
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGINA righello prestained | Fermentas | 26616 | scala proteica utilizzata per l'analisi occidentale |
| Name | >Company | Numero di catalogo | Comments |
| >Materiale per la purificazione RTA, la desalinizzazione e le misure con lettore | |||
| Spettrofotometro Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | vecchio modello, altri modelli disponibili | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | vecchio modello, non più disponibile |
| & Auml; KTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Prodotto fuori produzione e sostituito |
| Colonna HisTRAP HP | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| Colonna di desalinizzazione HiTRAP | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Filtro sterile Midisart | Sartorius | 16534K | 0.2 &; m pori misura |
| BCA kit di dosaggio delle proteine BCA | Pierce | 23225 | |
| 660 nm kit di dosaggio | Thermo Scientific | 22660 | |
| piastre a 96 pozzetti | Thermo Scientific | 260860 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Anticorpi (opzionale) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | anticorpo primario; diluizione 1:1.000 |
| Anti-topo-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | anticorpo secondario, diluizione 1:10.000 |
Riferimenti
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M.
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Ristampe e permessi
