Articolo metodologico

Effetti differenziali di farmaci ipolipemizzanti nella modulazione della morfologia delle particelle di colesterolo

DOI:

10.3791/56596

⸱

10 novembre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Plaxgen Inc, 2Millipore Sigma, 3Cytometry Laboratories, Purdue University, 4San Francisco General Hospital, 2M16 Clinical Chemistry, University of California, San Francisco, 5Molecular Medicine Research Institute

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo di questo studio era di valutare in vitro riduzione dei lipidi droga effetti nel modulare la morfologia delle particelle di colesterolo. Confronto di farmaci ipolipemizzanti rivelato variazioni nel loro effetto nel modulare le caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trattamento della dislipidemia pazienti con farmaci ipolipemizzanti conduce ad una riduzione significativa nel livello di lipoproteine a bassa densità (LDL) e un basso a moderato livello di aumento del colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL) nel plasma. Tuttavia, un ruolo possibile di questi farmaci nell'alterare la morfologia e distribuzione delle particelle di colesterolo è capito male. Qui, descriviamo la valutazione in vitro di effetti di farmaci ipolipemizzanti nel modulare le caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo utilizzando il metodo di matrice della placca in combinazione con imaging citometria a flusso. Analisi di immagine delle particelle di colesterolo hanno indicato che la lovastatina, simvastatina ezetimibe e atorvastatina inducono la formazione di particelle a forma di filo lineare e globulare, mentre niacina, fibrati, fluvastatina e rosuvastatina indurre il Formazione di particelle solo a forma globulare. Successiva, molto purificata lipoproteina a bassa densità (VLDL) e particelle di LDL incubate con queste droghe hanno mostrato i cambiamenti nella morfologia e immagine texture di colesterolo sottopopolazioni di particelle. Inoltre, la selezione di 50 campioni di siero ha rivelato la presenza di un livello superiore di lineare a forma particelle di colesterolo di HDL nei soggetti con dislipidemia (media del 18,3%) rispetto ai campioni normali di pari età (una media di 11,1%). Abbiamo anche osservato variazioni considerevoli in effetti ipolipemizzanti di droga sulla riduzione lineare a forma di formazione di particelle colesterolo LDL e HDL in campioni di siero. Questi risultati indicano che farmaci ipolipemizzanti, oltre ai loro effetti ipolipidici cellulo-mediata, direttamente possono modulare la morfologia delle particelle di colesterolo da un meccanismo non-enzimatica dell'azione. I risultati di questi risultati hanno potenziale per informare la diagnosi di aterosclerosi e prevedere la terapia ottimale di riduzione dei lipidi.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numerosi studi clinici hanno dimostrato gli effetti benefici dei farmaci ipolipemizzanti nella riduzione dei livelli plasmatici di colesterolo lipoproteine a bassa densità (LDL) e un basso a moderato livello di aumento del colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL), che previene le incidenze di primarie e secondarie di eventi cardiovascolari avversi correlati aterosclerosi1,2,3,4,5. Le statine, un gruppo di inibitori di HMG-CoA reduttasi enzima, bloccano la sintesi di colesterolo endogeno nel fegato che a sua volta portare ad abbassare livelli circolanti di colesterolo LDL nel sangue6,7. Allo stesso modo, l'effetto di niacina ipolipemizzanti sono mediato da sua inibizione diretta e non competitivo dell'epatocita diacilglicerolo aciltransferasi-2, un enzima del fegato chiave coinvolti nella sintesi di trigliceride8. Comparativamente, ezetimibe riduce il livello del plasma di LDL limitando l'assorbimento del colesterolo esogeno legandosi alla proteina Niemann-Pick C1 1 (NPC1L1) si trova nelle cellule epiteliali del piccolo intestino9. Fenofibrato, un'altra droga di riduzione dei lipidi, riduce sostanzialmente le concentrazioni plasmatiche di trigliceridi e anche moderatamente fa diminuire il colesterolo LDL attraverso le via di recettori proliferator-attivato peroxisome10. Inoltre, acido grasso omega-3 è segnalato per avere l'effetto anti-aterosclerotica grazie alla sua capacità di abbassare i livelli plasmatici di LDL11.

I farmaci ipolipemizzanti, oltre al loro effetto primario sull'abbassamento del colesterolo LDL, hanno un numero di effetti pleiotropici benefici tra cui potenziare il livello di HDL, miglioramento delle funzioni endoteliali, riducendo l'infiammazione e d'inibizione della piastrina le aggregazioni12,13,14. Tuttavia, il meccanismo di fondo di queste droghe in aumento le particelle del colesterolo di HDL e modificare le loro funzioni strutturali non sono completamente capito. Poiché questi farmaci sono ampiamente prescritti per trattare malattie cardiovascolari aterosclerosi (CPV), è essenziale per analizzare ulteriormente il loro possibile ruolo nel determinare le caratteristiche morfologiche e distribuzione delle particelle lipidiche. Il lipidome di plasma umano è costituito da circa 600 lipidi distinti e 22 tipi diversi di molecolari di colesterolo che sono presenti in varie dimensioni, forme, densità e composizioni15,16,17 . Metodi analitici come ultra-centrifugazione, NMR ed elettroforesi del gel di pendenza sono utilizzati per caratterizzare le particelle di LDL e HDL e loro subfractions18,19. Tuttavia, applicazione di questi metodi è limitata agli studi volti a determinare l'effetto delle droghe nel modulare la morfologia e l'assemblaggio delle particelle del lipido. La matrice di base placca citometro a flusso è un'analisi biochimica funzionale sviluppato per rilevazione e visualizzazione del siero derivato del lipido e amiloide placca particelle20. I vantaggi di in vitro metodo descritto in questo studio di imaging consentono l'identificazione del lipido-modulazione degli effetti della droga nell'alterare la morfologia e distribuzione delle particelle di colesterolo in campioni di siero e buffer.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparazione di fluorescente etichettati colesterolo e lipidi droga

Nota: aggregati di colesterolo con etichetta fluorescente e le statine sono state preparate come descritto nel nostro precedente articolo 21. vedere Tabella materiali per i dettagli dei reagenti, imaging citometro a flusso, analizzatori di chimica e software di analisi di dati utilizzati in questo studio.

  1. Solubilizzare il colesterolo liofilizzato con etichetta fluorescente (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) polvere in 1 mL di alcole a 100%.
  2. Centrifugare il campione per 3 min a 2.040 x g e utilizzare i sovranatante contenente aggregati solubili fluorescenza-labeled colesterolo nell'analisi di matrice della placca.
  3. Per la preparazione di farmaci, singolarmente solubilizzare le polveri (2 mg) di simvastatina, lovastatina, atorvastatina, ezetimibe e acido grasso omega-3 in 1 ml di alcole a 100%.
  4. Dopo la centrifugazione per 3 min a 2.040 x g, utilizzare i surnatanti contenenti farmaci nel test.
  5. Allo stesso modo, solubilizzano individualmente le polveri (2 mg) di fluvastatina, rosuvastatina, niacina e fibrato in 1 mL di acqua deionizzata per rendere una soluzione stock di 2 mg/mL.
  6. Dopo la centrifugazione per 3 min a 2.040 x g, utilizzare i surnatanti contenenti farmaci nell'analisi di matrice della placca.

2. Saggio di matrice della placca per la formazione di particelle del colesterolo In Vitro Examining

  1. uso analizzatore di chimica-1 (Vedi tabella materiali) per impostare il saggio di matrice della placca per la formazione di particelle di colesterolo. Eseguire l'analisi in un fondo tondo, piastra a 96 pozzetti associazione povera in proteine usando i reagenti preparati nella sezione 1. Mantenere il volume di reazione finale in ciascun pozzetto a 200 µ l e di eseguire tutte le analisi in triplice copia.
    1. In primo luogo, carico 194,5 µ l di fosfato tampone salino (PBS) in ciascun pozzetto.
    2. Per ciascun pozzetto, aggiungere 2,5 µ l (5 µ g) di ogni soluzione di farmaci ipolipemizzanti e scuotere la piastra per 30 s mettendo sul piatto analyzer-1 reazione chimica per mescolare uniformemente il farmaco in soluzione. Nessun farmaco è aggiunto ai campioni di controllo negativo.
    3. Infine, aggiungere 2 µ l (2 µ g) con etichetta fluorescente colesterolo aggregazione soluzione ad ogni pozzetto e scuotere la piastra per 30 s mettendo sul piatto analyzer-1 reazione chimica.
    4. Incubare la piastra su un agitatore di laboratorio per 2 h a 37 ° C e 200 giri/min.
    5. Dopo l'incubazione, acquisire le immagini delle particelle da imaging citometria a flusso.

3. Catturare immagini di colesterolo particelle utilizzando Imaging citometria a flusso

  1. aprire il modello di acquisizione dati per caricare le impostazioni dello strumento corretto. Fare clic sul " File ", quindi selezionare " Apri modello … " e selezionare il file modello.
  2. Clic " Flush, blocco, carico " a preparare lo strumento per il caricamento del campione.
  3. Quando la " esempio caricare " dialogo viene visualizzata, fare clic su " OK " per caricare 50 µ l dei campioni da ogni ben preparato nella sezione 2 in imaging citofluorimetro.
  4. Clic " eseguire | Installazione " per visualizzare le particelle nell'area di imaging in tempo reale.
  5. Quando le particelle nell'area di imaging sono in buona messa a fuoco, fare clic su " eseguire | Acquisire " di acquisire immagini di ogni oggetto simultaneamente in un modo ad alta velocità per campo scuro (side scatter/SSC), bright field (BF), fluorescenza verde e giallo fluorescenza.
  6. Ripetere i passaggi da 3.2-3.5 per acquisire 5.000-10.000 particelle da ciascun campione.
  7. Analizzare tutti i file di immagine raw utilizzando il software di analisi di immagine per determinare l'intensità di fluorescenza oggetto e variazioni morfologiche.
    1. Clic il " strumenti " pulsante nella parte superiore del software di analisi di immagine, quindi selezionare " Batch file di dati " dal menu a discesa, che aprirà il " batch " finestra.
    2. Nella " batch " finestra, fare clic il " Batch aggiungere " pulsante, che aprirà il " definire un lotto " finestra.
    3. Nel " definire un lotto " finestra, fare clic sul " Aggiungi file " pulsante e selezionare i file di immagine raw, fare clic il " modello " pulsante e selezionare il file di modello di analisi di dati appropriato, quindi selezionare " OK " e " inviare batch " per iniziare l'elaborazione e l'analisi dei file di immagine raw.

4. Placca matrice dosaggio basato su valutazione di farmaci effetto ipolipemizzante sulle particelle di colesterolo purificato

  1. come descritto al punto 2.1, eseguire l'analisi di formazione particelle di colesterolo utilizzando lipoproteine VLDL, LDL e HDL purificata/particelle. Eseguire il saggio di matrice della placca in una piastra a 96 pozzetti.
    1. In primo luogo, caricare tutti i pozzetti con PBS; utilizzare un volume finale di 200 µ l per ogni pozzo.
  2. Per il controllo negativo, aggiungere 4 µ g VLDL, LDL, o proteine/particelle di HDL singolarmente in ogni bene senza farmaci e scuotere la piastra per 30 s.
    1. Per esaminare l'effetto di farmaci ipolipemizzanti, aggiungere 4 µ g VLDL, LDL, o proteine/particelle di HDL individualmente a ciascun bene e scuotere la piastra per 30 s.
    2. Per pozzi aggiunti con 4 µ g VLDL, LDL o HDL, aggiungere 2,5 µ l (5 µ g) di ezetimibe, lovastatina, simvastatina o niacina soluzione e scuotere la piastra per 30 s collocandolo in chimica analyzer-1.
    3. Infine, aggiungere 2 µ l (2 µ g) colesterolo fluorescenza-labeled aggregazione soluzione a tutti i pozzetti e scuotere la piastra per 30 s mettendo sul piatto analyzer-1 reazione chimica.
  3. Incubare la piastra per 2 h in uno shaker di laboratorio impostato a 37 ° C e 200 giri/min.
  4. Acquisire i campioni mediante citometria a flusso imaging seguendo passaggi 3.1-3.5.
  5. Analizzare i file di immagine raw utilizzando software di analisi di immagine, come descritto al punto 3.7.
  6. Nel modello di analisi, utilizzare il seguente schema di gating per l'identificazione di sottopopolazioni di particelle di colesterolo.
    1. Su un terreno di numero di pixel del canale verde saturo (asse x) e campo scuro canale numero di pixel saturi (asse y), respingere gli oggetti con uno o più pixel saturi o canale.
    2. Stampare oggetti/particelle senza saturi pixel utilizzando intensità del canale verde (asse x) e l'intensità SSC (asse y): oggetti rientrano in una delle tre regioni (VLDL, LDL, HDL) basate sul loro canale verde e intensità di SSC.
      Nota: Questi cancelli sono stati creati sulla base dei dati generati da esperimenti di controllo effettuati utilizzando VLDL, LDL e HDL particelle/proteine purificate senza la droga.
  7. Per determinare l'effetto di riduzione dei lipidi droga per ciascun campione, calcolare le concentrazioni di particelle della lipoproteina totale, come pure la percentuale di ogni sottopopolazione (VLDL, LDL, HDL) come descritto nel passo 6.5.
    1. Calcola la particella concentrazioni (particelle/mL) utilizzando la seguente equazione:
      figure-protocol-1
      Nota: The VLDL, LDL e HDL gating regioni nella fluorescenza dot-trama rilevare ~ 80% di loro rispettive sottopopolazioni ed il restante ~ 20% delle particelle si sovrappongono con le altre regioni gating.

5. Misura delle concentrazioni nel lipido in campioni di siero

  1. per la determinazione delle concentrazioni di LDL, HDL, colesterolo e trigliceridi di analizzatore di chimica-2, utilizzare campioni di siero ottenuti da soggetti normali e dislipidemia di pari età.
  2. Definire anormale concentrazione di LDL, HDL, colesterolo e trigliceridi basati sulla loro concentrazione identificato oltre i valori di riferimento superiore e inferiore in campioni di siero.
  3. Seguire le raccomandazioni di valore normale di riferimentoDED dal produttore del reagente: (4-200 mg/dL) di colesterolo, HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) e trigliceridi (9-200 mg/dL).
  4. Identificare i campioni di siero che hanno un valore anormale come sia inferiore al valore di riferimento inferiore o sopra il riferimento più alto rapporto di colesterolo e trigliceridi e li usa per lo screening in presenza ed assenza di farmaci ipolipemizzanti.

6. Analizzando l'effetto delle droghe sulla formazione di particelle di colesterolo in campioni di siero

  1. uso la chimica analyzer-1 per impostare il saggio di matrice della placca per la formazione di particelle di colesterolo nel siero. Eseguire l'analisi in un fondo tondo, piastra a 96 pozzetti associazione povera in proteine. Utilizzare un volume di reazione finale di 200 µ l/pozzetto ed eseguire tutte le analisi in triplice copia.
  2. , Preparare la piastra caricando i reagenti in un modo graduale.
    1. Preparare i pozzetti di controllo.
    2. Carico 193 µ l di PBS in ciascun pozzetto.
    3. Aggiungere 2,5% (v/v) siero del paziente (campione di sola siero per pozzetto) e scuotere la piastra per 30 s mettendo sul piatto di reazione chimica analyzer.
    4. Add 2 µ l (2 µ g) di colesterolo fluorescenza-labeled aggregare soluzione in tutti i pozzetti e scuotere la piastra per 30 s collocandolo su un piatto di analizzatore-1 reazione chimica.
  3. Preparare i pozzetti con droghe.
    1. Carico 191 µ l di PBS in ciascun pozzetto.
    2. Aggiungere 2,5% (v/v) siero del paziente (campione di sola siero per pozzetto) e scuotere la piastra per 30 s collocandolo su un piatto di analizzatore-1 reazione chimica.
    3. Add 2 µ l ezetimibe, lovastatina, simvastatina o niacina soluzione (4 µ g) in tutti i pozzetti tranne i pozzetti di controllo negativo. Aggiungere un solo farmaco per pozzetto e scuotere la piastra per 30 s collocandolo su un piatto di analizzatore-1 reazione chimica.
    4. Add 2 µ l di fluorescenza-labeled colesterolo aggregare soluzione (2 µ g) in tutti i pozzetti e scuotere la piastra per 30 s mettendo sul piatto analyzer-1 reazione chimica.
  4. Caricare farmaci solo dopo tutti i pozzetti (controllo e droga trattato) sono stati caricati con i loro rispettivi sieri e aggiungere colesterolo fluorescenza-etichetta alla fine di questo passaggio.
  5. Incubare la piastra per 2 h in uno shaker di laboratorio impostato a 37 ° C e 200 giri/min.
  6. Acquisire i campioni da imaging citofluorimetro seguendo le impostazioni descritte nei passaggi 3.1-3.6.
  7. Utilizzare l'immagine analizzando il software per l'elaborazione di tutti i file di immagine utilizzando lo stesso modello come descritto nei passaggi 3,7 batch.
    1. Eseguire l'analisi dei dati di disegno gates sulla trama come descritto ai punti 4.5 e 4.6.
  8. Per determinare la riduzione dei lipidi droga effetto/risposta (bassa, moderata e alta) per ogni campione, calcolare la concentrazione di particelle della lipoproteina totale, come pure la percentuale del composto totale particelle di VLDL, LDL e HDL sottopopolazioni.
  9. Plot le popolazioni VLDL, LDL e HDL su un istogramma dell'oggetto ' s brillante campo immagine, larghezza sottratto dalla lunghezza (lunghezza - larghezza) e porta in regioni o globulare o lineare: oggetti con (lunghezza - larghezza) ≤ 2 µm rientrano nella regione globulare per calcolare la percentuale di globulare e lineare a forma particelle.
  10. Confrontare la percentuale di globulare e lineare a forma HDL e LDL colesterolo particelle identificate per ogni campione di siero incubato con e senza ogni droga. Tra triplici valori ottenuti per ciascun campione di siero, accettare la percentuale di globulare e lineare a forma di particelle di LDL e HDL che rientrano nell'intervallo ± 2 SD per la determinazione dell'effetto della droga.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saggio di matrice della placca basato su analisi di riduzione dei lipidi droga effetti sulla formazione di particelle di colesterolo:

Per valutare l'effetto delle statine nella modulazione della morfologia delle particelle di colesterolo, aggregati di colesterolo fluorescenti-identificati individualmente sono stati incubati con lovastatina, simvastatina, atorvastatina, rosuvastatina e fluvastatina nel buffer. Tutti questi campioni sono stati acquisiti mediante imaging citometria a flusso per catturare le immagini delle particelle di colesterolo per analisi di morfologia come mostrato in Figura 1 e Figura 2. È interessante notare che, analizzando l'effetto della droga sulla formazione di particelle di colesterolo nel buffer indicato che atorvastatina, simvastatina e lovastatina induce la formazione di una popolazione eterogenea delle particelle di colesterolo visualizzazione di diverse dimensioni e forme, Figura 3a -c. Al contrario, le particelle di colesterolo si formano in presenza di rosuvastatina, fluvastatina, e il controllo negativo (senza farmaco) erano omogenei nella forma e morfologia come mostrato in figura 3d-f. Inoltre, è stato osservato che lovastatina, simvastatina e atorvastatina ha indotto la formazione di particelle di colesterolo che esibiscono entrambi morfologie globulare e lineare del filo, mentre rosuvastatina e fluvastatina ha indotto la formazione di colesterolo particelle con solo morfologia globulare. L'effetto di statine su indurre la formazione di filamenti lineare è stata trovata nell'ordine del 16% per lovastatina, 2% per le simvastatine e 0,2% per atorvastatina.

Per valutare ulteriormente l'effetto di farmaci ipolipemizzanti sulla formazione di particelle, aggregati di colesterolo con etichetta fluorescente individualmente sono stati incubati con ezetimibe, fibrati, niacina e acido grasso omega-3. Come osservato con le statine, queste droghe ha indotto la formazione di particelle di colesterolo con dimensioni eterogenee e forme come visualizzato in Figura 4a-d. Fra loro, ezetimibe ha indotto la formazione di particelle di colesterolo che esibiscono entrambi morfologie globulare e lineare del filo mentre fibrato, niacina e acido grasso omega-3 indotto la formazione di particelle di colesterolo solo a forma globulare. Di conseguenza, l'effetto delle droghe sul filamento lineare a forma di formazione di particelle del colesterolo era nell'ordine del 3% per ezetimibe, 0% per fibrato, 0% per la niacina e 0% per acido grasso omega-3.

L'analisi morfologica ha rivelato ogni particella di strand globulare o lineare a forma di colesterolo è composto di molte particelle più piccole, collegate tra loro. Le dimensioni delle particelle di colesterolo globulare positivo fluorescente identificate sono nella gamma di ~ 2-30 µm2, mentre le dimensioni delle particelle a forma lineare sono nella gamma di ~ 2-60 µm2.

Analizzando l'effetto di farmaci ipolipemizzanti su particelle di LDL e di VLDL purificato:

Per esaminare ulteriormente la formazione di particelle di colesterolo in presenza di lipoproteine, gli aggregati di colesterolo fluorescenti-identificati individualmente sono stati incubati con proteine/particelle purificate di VLDL, LDL e HDL. I risultati hanno mostrato, rispetto all'incubazione con particelle di LDL e HDL, che gli aggregati di colesterolo incubati con proteine VLDL hanno causati la formazione di un numero maggiore di particelle del colesterolo, Figura 5. Inoltre, due principali frazioni delle particelle di colesterolo sono state osservate in popolazioni di VLDL suggerendo loro parziale trasformazione in una frazione di LDL durante l'incubazione con gli aggregati di colesterolo con etichetta fluorescente. L'analisi di immagine delle particelle hanno indicato la presenza di globulare (~ 97%) e di particelle (~ 3%) a forma lineare fra le popolazioni di VLDL, LDL e HDL. Le gamme di dimensione delle particelle globulari sono ~ 2-30 µm2, mentre le gamme di dimensione delle particelle lineare sono ~ 2-60 µm2.

Per esaminare l'effetto della droga ipolipemizzanti sulle particelle purificate, le particelle di VLDL e LDL sono state incubate singolarmente con ezetimibe, lovastatina, simvastatina e niacina. Di conseguenza, rispetto agli esperimenti di controllo senza la droga, l'effetto della droga osservato sulla formazione di particelle di VLDL era più alta in ezetimibe, simvastatina, lovastatina e niacina. Le particelle di LDL incubate con le droghe ha mostrato una singola frazione principale e l'effetto di droga-indotto sulla formazione di particelle era superiore a ezetimibe, simvastatina, lovastatina e niacina, Figura 6.

Variazioni degli effetti ipolipemizzanti droga nell'alterare la distribuzione delle particelle di colesterolo nel siero:

Gli esperimenti precedenti sono stati eseguiti nella soluzione tampone con lipoproteine purificate per valutare l'effetto della droga. Quindi, nel passaggio successivo, l'efficacia di farmaci ipolipemizzanti sulla formazione di particelle di colesterolo è stato esaminato usando 50 campioni di siero raccolti da 25 soggetti con dislipidemia e 25 oggetti normali di pari età. La risposta ai farmaci in ogni campione di siero è stata misurata basata sui cambiamenti nel profilo di formazione di particelle di colesterolo in presenza ed assenza di farmaci. Nell'analisi di matrice della placca, ogni campione di siero è stato proiettato contro ezetimibe, lovastatina, simvastatina e niacina farmaci. I risultati hanno rivelato disparità fra queste droghe nel modulare la distribuzione delle particelle di VLDL, LDL e HDL in campioni di siero, particolarmente il loro effetto sulla riduzione di LDL e aumentando la formazione di particelle del colesterolo di HDL. Tre rappresentanti dei campioni di siero di dislipidemia che esibiscono le uniche risposte ai farmaci ipolipemizzanti sono mostrati nella Figura 7.

Identificazione dell'effetto della droga sulla morfologia modulante del siero derivato le particelle del colesterolo di HDL e LDL:

L'analisi del fenotipo delle particelle di colesterolo del siero ha rivelato la presenza di filamenti lineari e di VLDL a forma globulare, LDL, e sottopopolazioni HDL, confermando così una morfologia simile identificata negli esperimenti eseguiti entrambi nel buffer e con le particelle della lipoproteina purificato come mostrato in Figura 8. Tuttavia, la distribuzione delle sottopopolazioni di particelle di colesterolo a forma globulare e lineare variava ampiamente tra dislipidemia e oggetti normali di pari età. In particolare, le analisi di controllo eseguite senza le droghe hanno mostrato differenze nella distribuzione del filamento lineare a forma di particelle di colesterolo LDL tra dislipidemia (una media di 2,0%) e pari età normale (una media di 1,3%) campioni di siero. Allo stesso modo, un aumento del livello del filamento lineare a forma di particelle di colesterolo di HDL è stata osservata nei campioni di dislipidemia (media del 18,3%) rispetto per la pari età campioni di siero (una media di 11,1%). In correlazione, le analisi eseguite in presenza di farmaci in campioni di siero di dislipidemia hanno mostrati una riduzione significativa nel formazione di particelle a forma lineare del colesterolo HDL per simvastatina (una media di 8,3%), ezetimibe (una media di 11,5%), lovastatina (una media di 11,7%), e nessuna riduzione per la niacina (una media di 18,3%). Inoltre, una diminuzione nella formazione delle particelle di colesterolo LDL a forma lineare è stata osservata nei campioni di siero di dislipidemia quando incubati con i farmaci visualizzati nella tabella 1.

Inoltre, le analisi eseguite in presenza di farmaci in samp di siero di controllo di pari etàLes ha mostrato la riduzione significativa in lineare a forma di particelle di colesterolo di HDL in simvastatina (una media di 5,0%), ezetimibe (media 8,2%), lovastatina (media 8,7%) e niacina (media 10,8%) come illustrato nella tabella 2. Pari età normale siero e dislipidemia campioni espositrici farmaco-indotta riduzione il lineare particelle di colesterolo LDL e HDL sagomate ha mostrato un aumento relativo in particelle di colesterolo a forma globulare (dati non mostrati).

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Figura 1: Diagramma che illustra il processo di visualizzazione in vitro della morfologia di particelle di colesterolo. (a, b) L'aggiunta di farmaci ipolipemizzanti in campioni di siero o di buffer. (c), l'aggiunta di fluorescenza-etichetta solubile colesterolo aggregati ai campioni. (d) acquisizione risultanti campioni per analisi morfologica delle particelle di colesterolo insolubile mediante imaging citometria a flusso. Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: identificazione di due distinte morfologie delle particelle di colesterolo mediante citometria a flusso imaging. (a) le particelle è segregato in popolazioni lineare o globulare, basate su analisi tessiturali delle immagini campo luminoso. In particolare, la dot-trama di dire H omogeneità (asse x) e significa entropia H (asse y) contiene due regioni con cancello per la rilevazione globulare (rosso) e strand lineare a forma di particelle del colesterolo (blu). (b) immagini visualizzati da morfologia delle particelle a forma globulare identificati nella popolazione 1. (c) immagini di strand lineare a forma di particelle identificate nella popolazione 2. (d) la distribuzione di tutte le particelle di colesterolo positivo fluorescente utilizzato per determinare la loro concentrazione e sottopopolazioni di visualizzazione istogramma. Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: visualizzare l'effetto delle statine nella modulazione della formazione di particelle di colesterolo gallerie immagini. Campo luminoso si riferisce alla zona simile a FSC nel citometro a flusso convenzionale. Canale verde si riferisce all'emissione di fluorescenza rilevata nel 505-560 nm, e canale giallo alla emissione di fluorescenza rilevata nel 560-595 nm. (a-e) Gallerie di immagini visualizzati da morfologia delle particelle di colesterolo si formano in presenza di lovastatina, simvastatina, atorvastatina, rosuvastatina e fluvastatina, rispettivamente. (f) formazione di particelle di colesterolo in assenza di statina (controllo negativo). Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: dimostrare l'effetto differenziale di farmaci ipolipemizzanti nella modulazione della formazione di particelle del colesterolo. (a-d) Gallerie di immagini visualizzati da morfologia delle particelle di colesterolo si formano in presenza di ezetimibe, niacina, fibrata e acido grasso omega-3, rispettivamente. Canale verde si riferisce all'emissione di fluorescenza rilevata nel 505-560 nm, e canale giallo alla emissione di fluorescenza rilevata nel 560-595 nm. Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: analisi di VLDL, LDL e HDL colesterolo particelle formazione in assenza di droga. Dot-piazzole: Asse x Visualizza uno spettro di particelle di colesterolo rilevato nel canale di fluorescenza verde (505-560 nm) e asse y Visualizza scatter laterale. Gating indica regioni delle particelle di VLDL, LDL e HDL rilevate in fluorescenza dot-trame. (a) formazione di particelle di colesterolo in presenza di VLDL purificata. (b) rappresentante immagini di particelle di VLDL. (c) formazione di particelle di colesterolo in presenza di LDL purificato. immagini di (d), rappresentante delle particelle di LDL. (e) formazione di particelle di colesterolo in presenza di HDL purificata. immagini (f), rappresentante delle particelle di HDL. Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: dimostrare l'effetto di farmaci ipolipemizzanti su purificato le particelle di colesterolo LDL e di VLDL. (un) VLDL particelle senza la droga. (b), VLDL particelle incubati con ezetimibe. (c), VLDL particelle incubati con lovastatina. (d), VLDL particelle incubati con simvastatina. (e), VLDL particelle incubati con niacina. particelle (f) LDL incubato senza la droga. particelle (g) LDL incubato con ezetimibe. particelle (h) LDL incubato con lovastatina. particelle (io) LDL incubato con simvastatina. particelle (j) LDL incubato con niacina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-7
Figura 7: fluorescenza dot-piazzole mostrando un effetto differenziale delle droghe nella modulazione della formazione di particelle colesterolo VLDL, LDL e HDL in campioni di siero di riduzione dei lipidi. Riga superiore, lo screening della risposta di basso livello droga del siero 1 visualizzando in crescente da 0 a 15% la formazione di particelle HDL; fila centrale, lo screening di risposta ai farmaci di livello moderato visualizzando siero 2 in aumento da 16 a 50% particelle di HDL; Riga inferiore, lo screening del siero 3 visualizzando più alto livello risposta ai farmaci in aumento 51 a 100% di particelle di HDL. (a, f, k) Campioni di siero senza droghe. (b, g, l) Campioni di siero incubato con ezetimibe. (c, h, m) Campioni di siero incubato con lovastatina. (s, i, n) Campioni di siero incubato con simvastatina. (e, j, o) Campioni di siero incubato con niacina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-8
Figura 8: gallerie di immagini visualizzati da morfologia delle particelle di colesterolo identificato nel siero del campione 1. Canale verde Mostra le immagini dell'emissione di fluorescenza da particelle; a dispersione laterale (ciano canale) Mostra le immagini del laser di eccitazione luce sparsi dalle particelle. (a) colesterolo a forma globulare e lineare particelle formano senza la droga. (b, c, d, e) Particelle di colesterolo si formano in presenza di ezetimibe, lovastatina, simvastatina e niacina, rispettivamente. Barre della scala= 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ID del sieroSenza droga (controllo)Con EzetimibeCon lovastatinaCon simvastatinaCon niacina
Particelle di LDL lineare %Lineare, particelle di HDL %Particelle di LDL lineare %Lineare, particelle di HDL %Particelle di LDL lineare %Lineare, particelle di HDL %Particelle di LDL lineare %Lineare, particelle di HDL %Particelle di LDL lineare %Lineare, particelle di HDL %
PND-011.7345.20.8118,10.6116.10,5913,92.2633,6
PND-022,8635,91.2630,91.2722,70,7315,23,0337,7
PND-032.0435,80,874,821.024,140.363,060.459,57
PND-042.5632,91.1521,81.1218,60,7717,23.3736.5
PND-050,4229.20,245.620.228,720.169.910.3522,2
PND-061.828.10.416,80,62150,429,272.2838,4
PND-071.826,50.8510.51.1819,90,627,321.2923,4
PND-080,9822,80.867,281,5510.20,145,980,5913.3
PND-093,8722,11.989,561,8710.31.467,962,869,88
PND-104,4621,92.5713,64,0417,12.2811,90,7125,7
PND-111.5719,21.159,241.376,980,745.031.3716
PND-121.0616,70,664,380,74.740.996,361.144.73
PND-134.8516,61.2830.41.432,60,816,64,0231
PND-142.08160,6815.40,6416,51,9710.21.2520.11
PND-151.511,91.1413.31.2111.40,86.121.384,59
PND-161.8210.42.049.591.245.620.915,381.317,61
PND-171.0510.31.024.71.7815.10.937,811.2713
PND-181.118,760.543,680.613.511.015.031.026.69
PND-1918,520,756,670,765,860.918,361.2211,9
PND-203,547,923.78123,565,813.288,283.4412.3
PND-211,887.692.1211.41.739,541.778.342.3216,7
PND-221.647.170.355.750,5613.20,144,331.2317,8
PND-231.546.271.257.241.026.120,733,581.426.69
PND-240,536.220,524,490.915,570.544.010.6510.5
PND-252.975.11.59111,8891.036,542,6129.1

Tabella 1: Screening della dislipidemia campioni di siero nell'analisi di matrice della placca mostrano l'effetto differenziale di farmaci ipolipemizzanti. Confrontato ai comandi senza droga (colonne 2, 3), i campioni di siero incubato con ezetimibe (colonne 4, 5), lovastatina (colonne 6, 7), simvastatina (colonne 8, 9) e niacina (colonne 10, 11) hanno mostrato variazioni su induzione lineare a forma di colesterolo LDL e HDL Formazione di particelle.

ID del sieroSenza drogaCon EzetimibeCon lovastatinaCon simvastatinaCon niacina
Particelle di LDL lineare %Lineare, particelle di HDL %Particelle di LDL lineare %Lineare, particelle di HDL %Particelle di LDL lineare %Lineare, particelle di HDL %Particelle di LDL lineare %Lineare, particelle di HDL %Particelle di LDL lineare %Lineare, particelle di HDL %
PNAN-012.0526,80,6211,90,5616,90,529,281.411,9
PNAN-021.3526,31.6821,82.5923,60.796,922.1629,7
PNAN-032.4
24,9 0,53 7,54 0.57 13,8 0.55 5,82 1.7 4.71 PNAN-04 1.99 21,5 1.54 9,45 1.56 8.25 0,31 3.74 2.88 20,8 PNAN-05 1.77 18,8 1.49 6,03 1.65 5.5 0.54 4,67 1.2 8,19 PNAN-06 1.12 15,2 0,67 4,42 2.68 13.3 0,5 2.37 1.54 16,3 PNAN-07 1.03 14,4 0.79 6.83 1.45 7,91 0,67 5.36 1.57 12 PNAN-08 0,98 14.3 0.88 4,48 2 7.1 0,19 2,66 1.02 18,1 PNAN-09 2.85 14.1 1.95 12,6 2.34 12.5 0,7 6.24 1.84 18,7 PNAN10 1.01 10.4 0,8 5,07 0.51 5.9 0,87 6.5 1.63 10,9 PNAN-11 0.92 12.4 0.21 9,94 0,29 3.31 0,29 6,52 0,58 10.4 PNAN-12 0.6 10.5 0,56 5,78 1.06 4.74 0.4 3,32 0.91 11,8 PNAN-13 1.25 10.3 0.45 3,79 0,67 6,53 0,27 3.17 0,8 6,28 PNAN-14 1.03 9,86 1.12 8,51 1.05 6,91 0.6 5.94 1.05 8.14 PNAN-15 2.28 8.1 1.93 10.4 2.14 8,86 1.56 6,84 2.31 8,61 PNAN-16 1.98 7.69 0.45 4,36 1 5,46 0,27 2.89 0,49 4.12 PNAN-17 1.72 6,72 0,75 14,8 0,74 9,26 0,49 5,58 1.98 12,8 PNAN-18 2.45 6.38 0.85 16,8 0.89 14.2 0,58 5.9 1.8 20,6 PNAN-19 1.67 5.12 0,58 8,63 0.65 5.7 0,64 8.8 1,88 2.08 PNAN-20 1.17 4,41 0.85 7.77 0.91 6,43 0,69 5.08 1.21 6.12 PNAN-21 0,31 4,18 0,48 6.95 0,19 5.09 0.15 2.1 0,29 5,93 PNAN-22 0,77 4,02 1.24 7,41 0.61 5.02 0,29 3.49 0,42 3,98 PNAN-23 0.4 1.25 0,75 6.25 0.88 5.91 0.9 5.06 0,82 6,71 PNAN-24 0.45 1.1 0,63 2.5 0.55 5,32 0.9 4.3 0,71 3.5 PNAN-25 0.36 1 0,73 2.4 0,66 5.1 0,82 4 0,7 3.4

Tabella 2: Screening di campioni di siero di controllo di pari età nell'analisi di matrice della placca mostrano l'effetto differenziale di farmaci ipolipemizzanti. Confrontato ai comandi senza droga (colonne 2, 3), i campioni di siero incubato con ezetimibe (colonne 4, 5), lovastatina (colonne 6, 7), simvastatina (colonne 8, 9) e niacina (colonne 10, 11) hanno mostrato variazioni su induzione lineare a forma di colesterolo LDL e HDL Formazione di particelle.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In generale, la distribuzione e le proprietà funzionali delle particelle di colesterolo VLDL, LDL e HDL nella circolazione sanguigna sono determinata principalmente dal metaboliche, genetiche, epidemiologici, cellulari e al plasma fattori22,23. Nello studio presente, esaminando gli effetti di dimodificazione farmaci nel buffer ha rivelato che altamente lipofiliche droghe quali ezetimibe, lovastatina, simvastatina e atorvastatina ha indotto un più elevato livello di complessità sulla morfologia delle particelle di colesterolo confrontato all'effetto di livello inferiore osservato con farmaci altamente idrofili di rosuvastatina e fluvastatina. Questi risultati sono in buon accordo con il nostro studio precedente che descrive un meccanismo non-enzimatica basato effetto delle statine nella modulazione della formazione di particelle colesterolo LDL e HDL nel buffer e siero campioni21. Di conseguenza, i risultati dallo studio presente ha rivelato un non-enzimatica meccanismo d'azione di ezetimibe, niacina, fibrata e farmaci di acido grasso omega-3 che possono svolgere un ruolo diretto nella formazione di particelle del colesterolo di modulazione. È possibile che le interazioni tra farmaci e aggregati di colesterolo conduce all'Assemblea delle particelle di colesterolo di grandi dimensioni che sono 2-60 µm2, esibendo morfologie globulare e lineare del filo.

Inoltre, i risultati ottenuti utilizzando particelle della lipoproteina purificata indicano interazioni tra aggregati di colesterolo e di fattori plasmatici tra cui proteine VLDL, LDL e HDL che possono alterare le composizioni e le proprietà morfologiche del colesterolo particelle. I risultati di trattamento della droga che coinvolgono particelle della lipoproteina purificata ha indicato un effetto di droga livello superiore su formazione di particelle di VLDL rispetto al loro effetto osservato su formazione di particelle del colesterolo di LDL. La lovastatina e simvastatina ezetimibe droghe sono state usate come pro-farmaci e loro dosi nei saggi possono essere superiori a concentrazioni fisiologiche.

Interessante, lo screening di campioni di siero hanno mostrati le variazioni dell'effetto della droga su alterare i profili di formazione di particelle di colesterolo VLDL, LDL e HDL, particolarmente il loro effetto sulle formazioni di lineare a forma di particelle di LDL e HDL. Queste droghe ha indotto riduzione il lineare a forma di formazione di particelle colesterolo LDL e HDL in dislipidemia e campioni di siero normali di pari età. Gli effetti di droga osservati sulla riduzione della formazione di particelle a forma lineare era più alta in ezetimibe, simvastatina, lovastatina e la niacina. L'identificazione di particelle di colesterolo con morfologie globulare e lineare del filo in campioni di siero normale e dislipidemia suggerisce che particelle con morfologie simili possono formare in condizioni in vivo . Precedenti studi hanno identificato la presenza del disco e cristalli aghiformi di colesterolo nelle placche aterosclerotiche di umani e ApoE- / - e LDLR- / - topi modelli24,25,26 ,27,28.

Le particelle di HDL circolanti nel sangue esistano come una miscela eterogenea e il livello di particelle di HDL di piccole e grandi dimensioni con attività funzionale sono fattori importanti per esercitare il loro effetto cardio-protettivo tramite il trasporto inverso del colesterolo Via29,30. Recenti studi hanno evidenziato l'importanza dell'identificazione subfractions di particelle di HDL colesterolo per chiarire il loro ruolo nelle funzioni biologiche quali efflusso di colesterolo, anti-infiammatorio, anti-trombotica e anti-ossidativo31 . Inoltre, una serie di studi hanno riferito l'effetto della terapia di riduzione dei lipidi nell'aumento di un livello basso per moderare il livello di HDL nel plasma1,5,21. Di conseguenza, i risultati da questo studio forniscono nuove intuizioni su caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo. In particolare, la rilevazione di un livello superiore di lineare a forma particelle di colesterolo di HDL nei campioni del siero di soggetti di dislipidemia suggerisce che essi possono essere il biomarcatore affidabile per la diagnosi e la valutazione degli effetti di dimodificazione farmaci nei pazienti. Tuttavia, ulteriore indagine è richiesta utilizzando grandi campioni clinici per capire meglio le particelle di colesterolo con morfologie distinte e la loro associazione di CVD.

Nell'analisi di matrice della placca per esaminare l'effetto della droga il montaggio delle particelle di colesterolo, abbiamo usato 2 µ g di fluorescenza etichettato come aggregati di colesterolo e 5 µgof ogni droga perché: (1) farmaci modo competitivo legano entrambi fluorescenza etichettato colesterolo e lipidi endogeni presenti nei campioni del siero; (2) da ciascun campione, abbiamo acquisito da 5.000 a 10.000 particelle di colesterolo che vengono assemblate in grandi dimensioni e forme che vanno da ~ 2-60 µ2; (3) abbiamo osservato un ampie variazioni di risposta ai farmaci tra i campioni di siero incubato con le droghe (dosi 300 ng a 5 µ g) e ~ 1-5% di loro incubate con dosi elevate ha mostrate nessun cambiamento rilevabile nel profilo della formazione di particelle di colesterolo; e (4) l'interazione tra gli aggregati di colesterolo e lipidi droga è mediata da un processo non enzimatico. Quindi, le concentrazioni dei reagenti utilizzati nel test possono essere superiore al loro livello fisiologico.

In conclusione, abbiamo dimostrato con successo i vantaggi di un in vitro imaging metodo descritto in questo studio per determinare l'effetto di un ampio spettro di farmaci ipolipemizzanti sulla modulazione morfologia e composizione del colesterolo particelle. L'approccio di visualizzare e quantificare la morfologia delle particelle lipidiche impiegando una costellazione di algoritmi di analisi di immagine può aiutare sia la diagnosi di aterosclerosi e di valutare i risultati della terapia di riduzione dei lipidi in pazienti.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Madasamy ha ricevuto sovvenzioni da Plaxgen, Inc e ha un interesse finanziario concorrente. Gli altri autori non hanno concorrenti finanziari interessi di divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato da una ricerca Plaxgen sovvenzione conferito alla SM (PLX-1008). Ringraziamo Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute per la raccolta di campioni di siero da soggetti di aterosclerosi sotto approvazione IRB.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
TopFluor colesterolo fluorescenteAvanti Polar lipidi immagazzinare100 µ l aliquote a -20 ° C
simvastatina (pro-farmaco)Cayman Chemicalsstore 100 & micro; l aliquote a -20 ° C
lovastatina (pro-farmaco)Cayman Chemicalsstore 100 &; l aliquote a -20 ° C
rosuvastatinaCayman Negozio di prodotti chimici100 µ l aliquote a -20 ° C
atorvastatinaCayman Chemicalsstore 100 & micro; l aliquote a -20 ° C
fluvastatinaCayman Chemicalsstore 100 & micro; l aliquote a -20 ° C
ezetimibe (pro-farmaco)Cayman Chemicalsstore 100 &; l aliquote a -20 ° C
Niacina MilliporeSigmastore 100 µ l aliquote a -20 ° C
fibratoMilliporeSigmastore 100 µ l aliquote a -20 ° C
acido grasso omega-3MilliporeSigmastore 100 µ l aliquote a -20 ° Proteine
/particelle VLDL purificate C Proteine/particelle LDLLee Bio
Proteine/particelle HDL purificateLee Bio
Siero umano abbinato all'etàDx Biosamples
Siero per aterosclerosi umanaBioserve
Siero normale umanoStanford Pacchetto di
Roche Diangostics
Misurazione del colesterolo totaleRoche Diangostics
microtitolazione a 96 pozzetti
Roche Diangostics
Amnis Imaging Citometro a flussoAmnis Inc
Software di analisi delle immagini IDEASAmnis Inc
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902Awarness Technology
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400Roche Diangostics
purificate reagenti per la misurazione delle LDL per centri trasfusionali Pacchetto di reagenti per la misurazione delle HDL Roche Diangostics Piastre per

Riferimenti

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