Method Article

Metodo per l'etichettatura di trascrizioni in cellule individuali Escherichia coli per singola molecola di fluorescenza In Situ gli esperimenti di ibridazione

DOI:

10.3791/56600

⸱

December 21st, 2017

 ,  , 
1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto descrive un metodo per l'etichettatura individuale RNA messaggero (mRNA) trascrizioni con sonde di DNA fluorescente etichettati, per l'uso in singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) gli esperimenti di ibridazione in Escherichia coli. smFISH è un metodo di visualizzazione che permette la rilevazione simultanea, la localizzazione e quantificazione delle singole molecole di mRNA in singole celle fisse.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un metodo è descritto per l'etichettatura individuale RNA messaggero (mRNA) trascrizioni nei batteri fissi per l'utilizzo in singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) gli esperimenti di ibridazione in Escherichia coli. smFISH permette la misura della cellula--cellula variabilità nel numero di copie di mRNA di geni di interesse, come pure la posizione subcellulare delle trascrizioni. I passi principali coinvolti sono fissazione di coltura delle cellule batteriche, la permeabilizzazione delle membrane cellulari e l'ibridazione delle trascrizioni destinazione con set di sonde del oligonucleotide fluorescente-etichetta breve disponibile in commercio. smFISH può consentire l'imaging delle trascrizioni di geni multipli nella stessa cella, con limitazioni imposte dalla sovrapposizione spettrale tra diversi marcatori fluorescenti. Dopo il completamento del protocollo illustrato di seguito, le cellule possono essere imaged prontamente usando un microscopio accoppiato con una macchina fotografica adatta a bassa intensità di fluorescenza. Queste immagini, insieme ai contorni delle cellule ottenute dalla segmentazione dei telai di contrasto di fase, o dalla colorazione della membrana cellulare, permettono il calcolo della distribuzione numerica mRNA copia di un campione di cellule utilizzando software open-source o personalizzato. Il metodo d'etichettatura descritto qui può essere applicato anche alle trascrizioni di immagine con microscopia di ricostruzione ottica stocastica (tempesta).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stocasticità è un aspetto fondamentale e inevitabile dell'espressione genica e dà luogo a cellula-cellula eterogeneità1, sia a livello di trascrizioni e proteine2,3. Quantificare la variabilità fra le cellule in condizioni ben definite offre una finestra unica i processi di base che sottendono l'espressione genica e sua regolazione. Una fonte importante di eterogeneità cellulare nei batteri avviene al livello trascrizionale. I numeri di trascrizione variano non solo dovuto la variabilità stocastica della trascrizione, ma anche ai processi post-trascrizionali come regolamento da piccolo RNAs e RNAases2. Un modo per accedere direttamente a questa eterogeneità in modo quantitativo è da fluorescente tagging trascrizioni individuale di un dato gene in smFISH. Questa metodologia consente il rilevamento e la localizzazione subcellulare di particolari molecole di RNA in fisso, singole cellule batteriche4. mRNAs sono ibridati con un insieme dei oligonucleotides base-lungo di ~ 20 fluorescente contrassegnati che sono progettato per legarsi selettivamente alle trascrizioni di interesse5,6. Etichettatura più assicura la rilevazione sopra fluorescenza di fondo, e singole molecole di mRNA appaiono come macchie di diffrazione limitata sotto un microscopio di fluorescenza7 (vedere Figura 1). Ci sono altri approcci per l'etichettatura di molecole di mRNA, in cui le sonde complementari oligomero trasportano apteni coniugati (ad es., biotina o digossigenina) che vengono rilevati utilizzando reporter fluorescente-etichetta secondaria tecniche8.

Ci sono altri metodi che forniscono informazioni quantitative sulla trascrizioni, oltre a smFISH. Alcuni, come la Northern blot o PCR quantitativa, la maggior parte della sonda e quindi in grado di misurare il numero di copie di mRNA né loro posizione in singole celle. Di conseguenza questi metodi non sono adatti per quantificare la variabilità della cellula--cellula. Una recente tecnica basata su immagine che permette per la quantificazione di sia il numero di copie di RNA all'interno delle cellule, nonché la loro posizione intracellulare, chiamato multiplexed errore-robusto fluorescenza in situ di ibridazione (MERFISH) è stata sviluppata. MERFISH è basato sull'assegnazione di un codice a barre univoco composto da una combinazione definita da un numero fisso di sonde del oligonucleotide fluorescente etichettati. Questi codici a barre vengono lette in turni sequenziale delle misure smFISH, con photobleaching dopo ogni turno di ibridazione, aumentando la velocità effettiva di due ordini di grandezza9,10. Questa tecnica richiede un fluidi automatizzato sistema e la corretta progettazione del set di sonda.

La combinazione di più fluorescenza etichettatura delle trascrizioni individuali, insieme alle tecniche di Super-risoluzione romanzo come stocastico ricostruzione ottica microscopia (tempesta)11, permette un aumento di dieci volte nella risoluzione nella localizzazione subcellulare delle trascrizioni. In tempesta, una combinazione adatta di sonde fluorescenti e imaging buffer consente cicli multipli di emissione di fluorescenza per molecola sonda (lampeggiante). TEMPESTA può essere utilizzato anche per immagine il trascrittoma di e. coli e osservare il genoma organizzazione spaziale del RNA, etichettando contemporaneamente tutte le trascrizioni di interesse12.

Tutti i metodi di cella singola recensione sopra si basano su trascrizioni in celle fisse di imaging. Quindi, non forniscono tutte le informazioni riguardanti le proprietà cinetiche di trascrizioni all'interno delle cellule. Per seguire le trascrizioni in cellule vive13, mRNAs possono essere contrassegnati tramite la fusione del gene di interesse in una matrice di siti di legame. Questi ultimi vengono poi riconosciuti da una RNA-proteina, quali il batteriofago MS2 proteina di cappotto, che si fonde ad una proteina fluorescente come ad esempio la proteina fluorescente verde (GFP)10,14,15.

Qui descriviamo un metodo per l'etichettatura di singoli mRNA con un set di sonde di DNA fluorescente contrassegnate, per uso negli esperimenti di smFISH, in particolare in e. coli. Inoltre, mostriamo che lo stesso schema di etichettatura può essere utilizzato per misure di tempesta con modifiche minori.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Design della sonda

Nota: Questo protocollo utilizza sonde del oligonucleotide disponibili in commercio già contrassegnati con fluorofori. Le sonde sono costituiti da un insieme di specifiche sequenze complementari ad un target mRNA, ogni sonda viene coniugato ad una singola molecola fluorescente. In alternativa, è possibile allegare marcatori fluorescenti per sonde, come descritto altrove5,16.

  1. Sonde di smFISH di progettazione utilizzando l'algoritmo di16 sonda Designer sviluppato da Rosasco (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); sequenze di smFISH sonde utilizzate in questo manoscritto sono elencati nella tabella dei materiali.
    Nota: Il numero minimo di sonde in un set per un segnale rilevabile è ~ 30. Il numero esatto può variare secondo il gene di interesse, specialmente se molto breve trascrizioni sono misurate.
  2. Scegliere un colorante che si adatta la configurazione ottica (Vedi tabella dei materiali).
    Nota: La tintura di Cy3 o un colorante otticamente equivalente con una bassa sensibilità alle foto-candeggio è altamente consigliato. È un candidato per l'etichettatura dual Cy5 o un otticamente equivalente tingere (Vedi tabella dei materiali). Coloranti adatti per l'imaging di tempesta di mRNA con etichetta sono caratterizzati dalla loro capacità di cicli multipli di emissione di fluorescenza. Alcuni coloranti smFISH possono essere utilizzati per l'imaging di tempesta (Vedi tabella dei materiali). Per due (o più) trascrizioni corrispondenti ai diversi geni nella stessa cella di immagine, uno dovrebbe scegliere sonde del oligonucleotide coniugati a coloranti cui spettri hanno poca o nessuna sovrapposizione.

2. preparazione del reagente

Nota: È importante per mantenere i campioni RNAsi-libera utilizzando RNAsi-libera di materiali di consumo quali tubi e puntali filtrata e per mantenere qualsiasi ambiente di lavoro pulito. Al fine di evitare il degrado delle trascrizioni destinazione, tutti i reagenti utilizzati a seguito di fissazione delle cellule devono essere privo di nucleasi (Vedi tabella materiali) o dietilpirocarbonato (DEPC)-trattati e sterilizzati.

  1. Buffer per smFISH
    1. Preparare la RNAsi-libera 1X PBS (tamponato fosfato salino, soluzione con una concentrazione di tampone fosfato 0,01 m e una concentrazione di cloruro di sodio di 0,154 M, (pH 7.4)). Diluire la RNAsi-libera 10X PBS (Vedi tabella materiali) nucleasi-free acqua (Vedi tabella materiali) presso un 01:10 rapporto di v/v.
      1. In alternativa preparare trattata DEPC 1 x PBS.
    2. Preparare la RNAsi-libera 2 x SSC (buffer di salino-sodio citrato, 0,3 M di NaCl in citrato di sodio 0,03 M, (pH 7.0)). Diluire la RNAsi-libera 20 x SSC (Vedi tabella materiali) in acqua privo di nucleasi a un 01:10 rapporto di v/v.
      1. In alternativa, preparare 2 DEPC-trattati x SSC.
  2. Soluzione madre di oligonucleotide sonda.
    1. Ri-sciogliere la miscela di sonda oligonucleotide essiccate in 200 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) per creare uno stock di sonda di 25 µM. Mix bene di pipettaggio su e giù e poi vortex e centrifugare brevemente.
    2. Per evitare il congelamento e scongelamento del tubo soluzione di riserva, fare diverse aliquote della soluzione stock, corrispondente all'importo previsto per essere utilizzato in un singolo sperimentale eseguito. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C o inferiore e proteggerlo dalla luce.
      Nota: Un set di sonda di nmol 5 può fornire fino a 250 reazioni di ibridazione.
  3. Tampone di ibridazione (a seguito di Skinner et al. 7 ):
    1. Aggiungere 5 mL di acqua privo di nucleasi a una provetta fondo conico in polipropilene da 50 mL. Aggiungere 1 g di solfato di destrano all'acqua e scioglierla nel Vortex vigorosa. Mescolare il contenuto in un agitatore orbitale fino a quando le bolle scompaiono (~ 30 min).
    2. Aggiungere la soluzione 3.530 µ l di formamide deionizzata, 10 mg di tRNA e. coli , 1 mL di 20x SSC, 100 µ l del complesso di vanadyl-ribonucleoside 200 mM e 40 µ l di 50 mg/mL BSA. Portare il volume finale di 10 mL con aggiunta di acqua trattata con DEPC o acqua priva di nucleasi e vortex la soluzione fino a quando è omogenea.
      Nota: Per evitare di congelare e scongelare della soluzione, fare diverse aliquote della soluzione stock, corrispondente all'importo previsto per essere utilizzato in un singolo sperimentale eseguito. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C. Assicuratevi di lasciare la formammide calda a temperatura ambiente prima di aprire la bottiglia. Per ridurre lo sfondo, è suggerito per calibrare la concentrazione ottimale formammide (rapporto di 10-40% v/v).
      Attenzione: ATTENZIONE! Formammide è altamente tossica e un noto teratogeno. Evitare il contatto con occhi o pelle, inalazione o ingestione. Gestirlo sotto cappa aspirante mentre indossa un camice da laboratorio e guanti protettivi.
    3. Sterilizzare la soluzione facendolo passare attraverso un filtro da 0,22 µm. Tenere in aliquote e conservare a-20 ° C ad un anno.
  4. Preparare il tampone di fissazione (4,6% formaldeide in PBS 1X) con l'aggiunta di formaldeide al 37% (v/v) di PBS 1X (Vedi 2.1.1) a un rapporto v/v di 1:8 e vortexare.
    ATTENZIONE: AVVISO! La formaldeide è altamente tossica e un noto cancerogeno. Gestirlo sotto cappa aspirante mentre indossa un camice da laboratorio e guanti protettivi.
  5. Preparare il tampone di lavaggio per smFISH (20% formammide in 2 x SSC) aggiungendo formammide deionizzata a 2 x SSC (Vedi 2.1.2) per un rapporto v/v di 1:4 e vortice.
  6. Preparare il tampone di imaging per smFISH con l'aggiunta di 5 mM cisteamina e ossigeno spazzini (7 µM glucosio ossidasi, catalasi nM 56 e glucosio 10% (p/v)) per tampone di lavaggio (20% formammide in 2 x SSC)
  7. Buffer per la tempesta
    1. Preparare il tampone A aggiungendo 50 mM Tris-HCl e 10 millimetri di NaCl all'acqua priva di nucleasi.
      Nota: Conservare a RT per anni.
    2. Preparare tampone B aggiungendo 50 mM Tris-HCl 10 mM NaCl e 10% p/v al glucosio di acqua priva di nucleasi.
      Nota: Conservare a 4 ° C per fino a un anno.
    3. Preparare il tampone di MEA sciogliendo cisteamina 77 mg in 1 mL di tampone A (rende una soluzione 1 M).
      Nota: Esso può essere conservato a 4 ° C per 1 mese.
    4. Preparare il tampone di Gloxy aggiungendo 8.440 ossidasi di glucosio (unità arbitrarie) AU e 70.200 catalasi AU a 1 mL tampone A.
      Nota: Rende 50 x soluzione di riserva, esso può essere conservato a 4 ° C per 1 mese.
    5. Preparare il tampone di imaging per la tempesta con l'aggiunta di 50 mM di buffer di MEA e 1x Gloxy buffer a tampone B.
      Nota: Il buffer di imaging per la tempesta è composto da 5 mM cisteamina, organismi saprofagi dell'ossigeno (56 nM della catalasi e ossidasi di glucosio 7 µM) in 50 mM Tris con 10 millimetri di NaCl e del glucosio 10% pH 8.0. Preparare appena prima di formazione immagine, possono essere archiviato ed utilizzato a temperatura ambiente per circa 2 h.

3. il campione fissazione

  1. Crescere le cellule batteriche (ad es., E.
coli MG1655) in crescita media di agitatore orbitale di inan notturno di scelta (ad es., LB medium) a 260 giri e 37 ° C.
Nota: Per determinare la priorità bassa a causa del legame non specifico delle sonde, misurazioni in un ceppo in cui è stato eliminato il gene di interesse dovrebbero essere condotta, seguendo le stesse procedure (Vedi Δgalk in Figura 1 e ΔsodB in Figura 2).
  • Diluire il pernottamento cultura 1: 100 in mezzo fresco e misurare la densità ottica (OD600) in uno spettrofotometro ogni ~ 1 h, fino ad un valore di 0,2 - 0,4; una cultura di 4 mL dovrebbe essere sufficiente.
    Nota: Se il microscopio selezionato non dispone di contrasto di fase o capacità di contrasto differenziale di interferenza, membrane esterne di e. coli possono essere etichettate con marcatore fluorescente lipofilico di 2 μM (Vedi tabella dei materiali), che deve essere aggiunto il sospensione batterica 20 min prima fissazione17. Fissazione e ulteriore trattamento vengono eseguite come descritto di seguito. Deve prestare attenzione a scegliere un marcatore fluorescente avendo un diverso spettro di emissione, per ridurre al minimo la sovrapposizione spettrale con il set di sonda marcata con.
  • Pellet di cellule mediante centrifugazione per 5 min a 4.500 g a 4 ° C. Rimuovere il surnatante da tutte le provette.
  • Aggiungere 1 mL di 1X PBS a ciascuna provetta e risospendere il pellet per ridurre al minimo l'aggregazione di cellula--cellula. Quindi aggiungere 4 mL di buffer di fissazione e vortex delicatamente.
  • Incubare i campioni in un agitatore orbitale a 260 giri/min per 30 min a 24 ° C.
  • Pellet di cellule mediante centrifugazione per 10 min, 1.000 g, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBS 1X.
  • Trasferire sospensioni 1,8 µ l fondo conico micro-centrifuga provette (Vedi tabella dei materiali) e ripetere il punto 3.6 due volte.

    • 4. campione permeabilizzazione

    1. Rimuovere il surnatante con molta attenzione. Utilizzo di pipette di piccolo volume, se necessario, rimuovere tutto il liquido fuori il pellet.
    2. Risospendere in 300 µ l acqua trattata DEPC o nucleasi-free. Aggiungere 350 µ l alto grado etanolo assoluto (99%) e mescolare delicatamente capovolgendo la provetta. Aggiungere un altro 350 µ l di etanolo e mescolare ancora una volta, per raggiungere una concentrazione di etanolo finale del 70% (v/v rapporto).
      ATTENZIONE: AVVISO! L'etanolo è infiammabile.
    3. Ruotare il campione con un rotatore tubo 20 giri/min per 1 h a temperatura ambiente (TA), o a 4 ° C durante la notte. Campioni possono essere conservati a 4 ° C fino a una settimana.

    5. l'ibridazione

    1. Pellet di cellule mediante centrifugazione per 7 min, 750 x g, 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
    2. Aggiungere 1 mL 20% tampone ai campioni di lavaggio e lasciare riposare per alcuni minuti, o pipetta per sciogliere completamente il pellet.
    3. Pellet di cellule mediante centrifugazione per 7 min, a 750 x g, 4 ° C.
    4. Rimuovere il surnatante molto dolcemente pipettando. Utilizzo di pipette di piccolo volume se necessario rimuovere tutto il liquido fuori il pellet.
    5. Aggiungere la sonda oligonucleotide impostata soluzione di riserva per l'aliquota di tampone di ibridazione in modo che la concentrazione finale del oligonucleotide è 250 nM; vortice vigorosamente.
      Nota: Uno può etichettare due o più diversi target mRNAs contemporaneamente nella stessa cella. Aggiungere insiemi di sonda di entrambi gli obiettivi per il tampone di ibridazione. Deve prestare attenzione a scegliere tinture avendo diversi spettri di emissione per minimizzare la sovrapposizione spettrale (ad es., Cy3 e Cy5). Assicurarsi che i campioni destinati a formazione immagine tempesta sono ibridati con una sonda oligonucleotide impostata coniugata con un colorante adatto per STORM (ad esempio, nella tabella dei materiali).
    6. Sospendere i campioni (Vedi punto 5.4) in 50 µ l di tampone di ibridazione contenente le sonde del oligonucleotide, evitando la generazione di bolle (la soluzione è abbastanza viscosa).
    7. Lasciare i campioni durante la notte su un blocco di caldo a 30 ° C in buio.
      Nota: In seguito, campioni possono essere conservati fino a 6 mesi a 4 ° C.

    6. lavaggio

    1. Utilizzare un tubo del microcentrifuge nuovo per ogni campione di immagine. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio.
    2. Aggiungere 10-15 µ l dai campioni ibridati per il nuovo tubo contenente il tampone di lavaggio e mix/vortex.
    3. Pellet di cellule di centrifugazione per 7 min, 750 x g a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
      Nota: Per ridurre la priorità bassa, incubare per 1 h a 30 ° C.
    4. Lavare due volte più (risospendere in 1 mL di tampone di lavaggio, centrifuga e rimuovere pellet).
    5. Risospendere in 25 µ l di tampone di lavaggio.
      Nota: Al fine di ridurre una foto-candeggio può aggiungere per il tampone di lavaggio un ossigeno lo scavenging sistema (2.6) per migliorare la stabilità del colorante in fluorescenza di singola molecola esperimenti6.

    7. preparazione dei campioni per l'Imaging

    Nota: Le cellule hanno bisogno per essere immobilizzato al fine di consentire la corretta formazione immagine al microscopio di fluorescenza e contrasto di fase. I seguenti metodi possono essere utilizzati per preparare campioni in cui diversi campi di vista può essere imaged in diversi piani focali.

    1. Preparazione del gel dell'agarosi
      1. Aggiungere 150 mg agarosio al buffer di x SSC 10 mL 2. Non aggiungere 2 x SSC di agarosio, altrimenti non si dissolvono correttamente.
      2. Forno a microonde per 10-15 s ogni volta fino a grandi bolle iniziano a formarsi. Lasciate raffreddare per qualche minuto.
      3. Posizionare una separazione cornice in silicone sulla diapositiva in modo che centro della diapositiva rimane esposta.
      4. Posizionare un anello rigido di 10 mm wide (1-2 mm di spessore) al centro della diapositiva e depositare una piccola quantità di gel in esso, per la sigillatura. Attendere qualche minuto per esso per indurire.
      5. Aggiungere più gel fino a formare una forma a cupola alta. Aspettare 10 min per esso ad indurirsi e rimuovere l'anello (con una pinzetta bene o qualsiasi altro metodo).
      6. Cassetta di ~ 10 μL di cellule batteriche lavate (vedere 6.5) sul gel e la guarnizione con un vetrino coprioggetto #0.
    2. Preparazione del campione di camera per smFISH
      1. In alternativa (al punto 7.1) preparare i campioni per l'imaging di immobilizzare le cellule batteriche lavate (vedere 6.5) su vetro rivestiti con poli-D-lisina fondo plastica petri piatti usa e getta.
      2. Incubare i campioni al buio, a temperatura ambiente, una notte prima di visualizzazione per consentire l'adesione delle cellule alla superficie. Prima visualizzazione lavare una volta con tampone di lavaggio (. 5); mantenere il campione bagnato con tampone di lavaggio di imaging o buffer(2.5) per smFISH (2,6).
    3. Sezione preparazione del campione per la tempesta
      1. Preparare i campioni per tempesta per imaging su vetro rivestiti con poli-D-lisina fondo plastica petri piatti usa e getta.
      2. Incubare i campioni al buio, a RT, durante la notte. Prima del lavaggio di visualizzazione in una volta con tampone di lavaggio per smFISH (2.5); e aggiungere buffer di imaging per la tempesta (2.7.5).

    8.Visualizzazione di trascrizione

    1. L'immagine di cellule con un microscopio a fluorescenza largo campo attrezzato con un tavolino motorizzato (Vedi tabella dei materiali).
      Nota: Per la modifica di tempesta, utilizzare cellule marcate con un colorante capace di cicli multipli di emissione di fluorescenza. L'esempio utilizzando il sistema di imaging 3D Super-risoluzione di immagine (ad esempio, vedere la tabella dei materiali).
    2. Uso (consigliato) un 60-100x Nardi > 1,3 olio immersione fase contrasto obiettivo con una forte sorgente luminosa, ad esempio un mercurio o lampada di alogenuro di metallo; Fonti di luce LED-based sono anche raccomandati.
    3. Uso standard raffreddato telecamera CCD, idealmente ottimizzata per formazione immagine di livello basso-luce piuttosto che velocità (usiamo una macchina fotografica con dimensione dei pixel 16 µm) (Vedi tabella dei materiali).
      Nota: L'uso di un EMCCD raffreddata (elettrone moltiplicando dispositivo a carica accoppiata) telecamera CCD telecamera è necessario ridurre il rumore termico che impedisce il rilevamento, in particolare di singole molecole.
    4. Usa filtro imposta appropriato per i fluorophores scelto.
    5. Per determinare correttamente i bordi della cella, acquisire immagini di diversi campi di vista in ogni campione con ottica di contrasto di fase, o di etichettatura fluorescente membrana cellulare esterna. Acquisire immagini a diversi piani focali (z-stack) per tutti i canali (solitamente 13 fette separate da 250 nm sono presi).
      Nota: La fase motorizzata del microscopio e il set di filtri dovrebbe essere controllata da commerciali (Vedi tabella materiali) o software in-House che può catturare una pila di immagini in sequenza.

    9. analisi dei dati

    1. Convertire le serie di immagini in un formato adatto per l'analisi dei dati.
    2. Stimare il numero di copie del target mRNA dall'intensità totale dei fuochi fluorescenti nella cella, piuttosto che dal conteggio discreti 'punti' come in altri protocolli attualmente disponibili.
    3. Effettuare analisi di immagine con software open-source18 o con un programma personalizzato. Per informazioni dettagliate dei dati di imaging e l'analisi vedere Skinner et al. 7

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    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Abbiamo effettuato misurazioni smFISH delle trascrizioni galK e sodB in cellule di Escherichia coli . Le trascrizioni sono state ibridate con un set di specifiche sequenze complementari alla sequenza di destinazione, ogni sonda viene coniugato ad una singola molecola fluorescente (Vedi tabella dei materiali). Fluorescenza e fase contrasto immagini di selvaggio-tipo MG1655 ceppo di e. coli (WT) o di un ceppo di galK-eliminato JW0740 (raccolta di Keio)19<...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Nel nostro laboratorio abbiamo misurato il numero di trascrizione di diversi geni in cellule di Escherichia coli usando il smFISH metodo2. In breve, questa procedura prevede i passaggi seguenti: fissazione delle cellule, permeabilizzazione delle membrane per consentire la penetrazione della sonda, l'ibridazione della sonda e utilizzando un microscopio a fluorescenza standard di formazione immagine di esempio. Questa procedura si basa su quelli precedentemente pubblicati con alcune modific...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Gli autori non hanno nulla a rivelare.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Questo lavoro è stato supportato da un grant di Israel Science Foundation 514415 (a J.S.) e una sovvenzione di BSF-NSF (MCB) 2016707 (di J.S.). Supporto da un Siegfried e Irma Ullman cattedra (a J.S.) è anche riconosciuto.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Solfato di destrano sale sodicoSigma-AldrichD8906
    Etanolo puro, 99,5%, reagente ACS, assolutoMallinckrodt Baker - Avantor8025.25
    Dietilpirocarbonato (DEPC)Sigma-AldrichD5758
    Senza RNasi 20X SSCLife Technologies/AmbionAM9763
    Senza RNasi 10X PBSLife Technologies/AmbionAM9625
    Tampone TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) BioUltra, per biologia molecolareSigma-Aldrich93283
    acqua priva di nucleasiThermo Fisher Scientific10977035
    Soluzione di formaldeide per biologia molecolare, 36,5-38% in acquaSigma-AldrichF8775
    Forma deionizzata, priva di nucleasiThermo Fisher Scientific/AmbionAM9342
    TRNA di E. coli (acido ribonucleico, trasferimento di tipo xx da escherichia)Sigma-AldrichR1753-500UN
    UltraPure BSA (50mg/ml)Thermo Fisher Scientific/AmbionAM2616
    Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mMNew England BiolabS1402S
    Poly-L-LysineSigmaP4707
    Cisteamina e ossigenoSigma-Aldrich30070
    Glucosio ossidasi da Aspergillus niger, Tipo VII, 50KUSigma-AldrichG2133
    CatalasiSigma-AldrichC40
    D-glucosioSigma-AldrichG8270
    D-fucosioSigma-AldrichF8150
    Vybrant DiO Cell-Labeling SolutionLife TecnologieV2286
    Agarosio, reagente a basso punto di fusioneSigma-AldrichA9414
    Isolatore siliconico adesivo 24-2 mm Ø X 1,8 mm di profondità JTR24R-A2-2.0Grace Bio-LabsJTR24R-A2-2.0 666208
    fondo in vetro rivestito in poli-D-lisina Piatti di coltura con fondo in vetroMatTek CorporationP35GC-1.5-14-C
    Guanti da esplorazione senza polvere di nitrile Super LifeSupermaxTC-N-9889
    Nastro per incubatrice di sterilizzazionedi marca Sigma-AldrichBR61750
    Provette per microcentrifuga (1,8 ml)Axygen - Corning Life SciencesMCT-175C
    Provette in polipropilene a fondo tondo Falcon (14 ml)BD Biosciences352059
    Polipropilene per centrifuga a fondo conico PipetteCorning430828 Life
    Sciences4051
    (Corning 10 ml)Corning Life Sciences4488
    Pipette sierologiche (Corning 25 ml)Corning Life Sciences4251
    Spettrofotometro cuvetteSarstedt67.742
    Puntali per pipette senza RNasi 0,2 - 20 μ lFroggaBioFT20
    Puntali per pipette senza RNasi 10 - 200 μ lAxigene/corningTF-200
    Puntali per pipette senza RNasi 100 - 1000 μ lFroggaBioFT1000
    Puntali per pipette senza RNasi 100 - 1000 μ lSorenson14200
    Dispense per siringa 10 mL ago G-21Becton Dickinson, BiosciencesBD-309643
    Minisart 0,2 um Filtro per siringaSartorius16534 K
    Nikon instruments microscopio tipo A olio da immersione A, 8ccNikonMXA20233
    Vetrini per microscopio 76 x26, 3"x1"x1" x1mmThermo Fisher Scientific421-004ET
    #0 vetrino coprioggetti 24x60Thermo Fisher Scientific/MenzelBNBB024060A0
    Agitatore orbitaleM.R.CTOU-50
    Blocco caldoM.R.C
    VortexFried Electric CompanyG-560-E
    MicrocentrifugaEppendorf5427R
    CentrifugaEppendorf5810R
    Pipet-Aid XP2 portatile, controller per pipetteDrummond Scientific Company4-000-501-I
    OD600 spettrofotometro per tassi di crescita batterica DiluPhotometerMidsciOD600-10
    iXon X3 EMCCD cameraAndorDU-897E-CS0-#BV
    Eclipse Ti microscopioNikonMEA53100
    CFI plan apochromat DM 100X obiettivo olio lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13NikonMRD31905
    Set di filtri (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LPNikon49005
    Set di filtri (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660PNikon49009
    Nis-elements software di ricerca automatica ARNikonMQS31000
    microscopio STORMVutaraSR-200
    NA 1.2 obiettivo a immersione in acqua Olympus
    SRX software di acquisizione e analisi delle immaginiFotocamera
    Evolve 512Fotometria
    Stellaris® Sonde FISH, test personalizzati con CAL Fluor® Red 590 Dye BiosearchTechnologies IncSMF-1083-5
    Probe Sequence for galK mRNA:
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    Stellaris® Sonde FISH, test personalizzati con Quaser Fluor® Red 670 Dye BiosearchTechnologies IncSMF-1083-5
    Probe Sequence for sodB mRNA:
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    sierologiche . . . EMCCD Vutara gcatcgagggaaaaactcgtcgcatcgagggaaaaactcgtc

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
    2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    3. Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
    4. van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523(2016).
    5. Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
    6. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
    7. Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
    8. Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628(2014).
    9. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
    10. van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
    11. Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
    12. Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
    13. Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
    14. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
    15. Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
    16. So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
    17. Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
    18. Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
    19. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8(2006).
    20. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    21. Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).

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