Questo protocollo descrive un metodo per determinare la proteina emivite in singole cellule aderenti, utilizzando impulsi etichettatura e time-lapse imaging di fluorescenza di proteine di fusione SNAP-tag.
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Articolo metodologico
Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine sono in uno stato dinamico di sintesi e degradazione e la loro emivita può essere regolata in varie circostanze. Tuttavia, la maggior parte comunemente utilizzati approcci per determinare l'emivita della proteina o sono limitate a medie della popolazione dalla cellule lisate o richiedono l'uso di inibitori della sintesi di proteina. Questo protocollo descrive un metodo per misurare la proteina emivite in singole cellule aderenti, con proteine di fusione SNAP-tag in combinazione con Time-lapse microscopia di fluorescenza. Qualsiasi proteina di interesse fusa ad un SNAP-tag possa legarsi covalentemente da una tintura di permeabili delle cellule fluorescente, che è accoppiata ad un derivato di benzylguanine, e il decadimento della popolazione proteina marcata può essere monitorato dopo interruzione della tintura residua. Successiva delle cellule di rilevamento e la quantificazione dell'intensità di fluorescenza integrata rispetto ai risultati di tempo in una curva di decadimento esponenziale per ogni cella cingolato, permettendo per determinare i tassi di degradazione delle proteine in cellule singole di adattamento della curva. Questo metodo fornisce una stima per l'eterogeneità delle emivite in una popolazione di cellule in coltura, che non può essere valutato facilmente con altri metodi. L'approccio qui presentato è applicabile a qualsiasi tipo di cellule aderenti coltivate che esprime una proteina di interesse fusa a un tag di SNAP. Qui usiamo cellule staminali embrionali (ES) topo coltivate su piastre per colture cellulari E-cadherin-rivestito per illustrare come singola cella degradazione tassi di proteine con una vasta gamma di dimezzamento possono essere determinati.
Introduzione
È noto che proteine cellulari subiscono ampio turnover, con tassi di sintesi e degradazione essendo specifico per ogni proteina e soggette a regolazione fisiologica. Tradizionalmente, tassi di degradazione delle proteine sono stati misurati utilizzando metodi di massa, quali l'analisi di chase impulso radioattivo, o che coinvolgono gli inibitori della sintesi di proteine quali cicloesimmide1. Più recentemente, isotopo stabile etichettatura con gli amminoacidi nella coltura delle cellule (SILAC) in combinazione con la spettrometria di massa è stato istituito per quantificare il turnover delle proteine su una scala globale2
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Protocollo
Nota: In questo studio, è stata utilizzata la linea cellulare E14 ES. Tuttavia, questo protocollo è direttamente applicabile a qualsiasi altra linea di mouse ES cellula che esprime una proteina di interesse fusa a un tag di SNAP, codifica la proteina endogena oppure mediante sovraespressione. Per gli esempi riportati nella sezione risultati, linee cellulari di doxiciclina-inducible SNAP-tag fusione sono stati usati (SNAP-tag fusa per le seguenti proteine: Nanog, Oct4, Srsf11, o per le proteine fluorescenti mOrange2 e sfGFP e messo sotto il controllo di un doxiciclina-inducible promotore. Vedi11 per ulteriori informazioni sui plasmidi utilizzati....
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Risultati
Il protocollo descritto fornisce una stima della variabilità cellula--cellula in Half-Life per qualsiasi data proteina fusa a un tag di SNAP. L'uso di ricombinanti E-cadherin-Fc per il rivestimento della piastra imaging consente risoluzione unicellulare in cellule ES, che altrimenti crescere nelle colonie. Cellule singole possono essere monitorate separatamente durante tutto il corso del film ( Figura 1A).
Al fine di determinare il tempo di dimezzamento di protein.......
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Discussione
Il passaggio più importante quando si utilizza un tag di SNAP per monitorare il decadimento della proteina è per garantire che nessun residuo colorante non legato è lasciato nel terreno o nelle cellule dopo il lavaggio, altrimenti si potrebbe associare a recentemente prodotte molecole SNAP-tag più tardi nel corso dell'esperimento e ther Eby compromesso la curva di decadimento. Questo è un lato ottenuta eseguendo attentamente tutti i passaggi di lavaggio descritta. D'altra parte, la concentrazione di colorante dovrebbe es.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Esperimenti di microscopia time-lapse sono stati eseguiti presso biomolecolari Screening Facility (BSF), EPFL. Ringraziamo Marc Delachaux (servizio Audiovisuel, EPFL) per la videografia e montaggio del film.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| ES che esprime una proteina di fusione SNAP-tag di interesse | - | - | |
| Falcon 100 mm Piastra per colture cellulari trattata con TC Falcon | Corning | 353003 | |
| 96 pozzetti, nero/trasparente, piastra trattata per colture tissutali | Corning | 353219 | |
| Camera di conteggio migliorata Neubauer, 0,1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| Incubatore a CO2 | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuga 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Sistema di imaging cellulare | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Azienda | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Siero fetale bovino, qualificato per cellule staminali embioniche | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Soluzione di piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimo Essenziale Medio Aminoacidi non essenziali | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillina-Streptomicina | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutammina 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Fattore inibitorio della leucemia | - | - | Prodotto in laboratorio mediante trasfezione transitoria di cellule HEK-293T, seguita da raccolta e filtraggio del surnatante. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatina da pelle bovina | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrato | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Tripsina-EDTA-Soluzione 0,25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Proteina Chimera Fc di topo ricombinante | R & D systems | 748-EC-050 | |
| Idlato di doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Numero di catalogo | Commenti |
| Software | |||
| FIJI | - | - | Software di analisi delle immagini open source |
| MATLAB R2014a | Mathworks-Microsoft | ||
| Excel | Microsoft | - |
Riferimenti
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P.
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Ristampe e permessi
