Iniezione della vena della coda idrodinamica di vettori di integrazione basata su trasposone consente trasfezione stabile di epatociti murini in vivo. Qui, presentiamo un protocollo pratico per sistemi di transfezione che consente l'espressione costitutiva a lungo termine di un transgene singolo o combinato espressione costitutiva e doxiciclina-viscoelastico di un transgene o miR-shRNA nel fegato.
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Articolo metodologico
Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nei modelli di ricerca di cancro del fegato, di rigenerazione, di infiammazione e di fibrosi, sistemi flessibili per in vivo l'espressione genica e silenziamento sono molto utili. Iniezione della vena della coda idrodinamica dei costrutti basati su trasposone è un metodo efficiente per la manipolazione genetica degli epatociti in topi adulti. Oltre l'espressione costitutiva del transgene, questo sistema può essere utilizzato per applicazioni più avanzate, come implicazione di colpo, di shRNA-mediata del gene del sistema CRISPR/Cas9 per indurre mutazioni del gene, o sistemi di viscoelastici. Qui, la combinazione dell'espressione costitutiva CreER insieme espressione inducibile di un transgene o miR-shRNA di scelta si presenta come un esempio di questa tecnica. Copriamo la procedura multi-step a partire dalla preparazione della bella addormentata-trasposone costruisce, per l'iniezione e il trattamento dei topi e la preparazione del tessuto del fegato per analisi immunostaining. Il sistema presentato è un approccio affidabile ed efficiente per realizzare complesse manipolazioni genetiche negli epatociti. È particolarmente utile in combinazione con ceppi di topi Cre/loxP-based e può essere applicato ad una varietà di modelli nella ricerca dell'affezione epatica.
Introduzione
L'affezione epatica cronica presenta un onere importante di salute nel mondo1. Modelli di ricerca sugli animali sono strumenti essenziali nello studio delle malattie epatiche e hanno contribuito a rispondere alle domande complesse nella rigenerazione del fegato, infiammazione epatica e steatosi, così come il cancro del fegato2. Un numero considerevole di questi modelli animali si basa sulla modificazione genetica delle cellule del fegato. Efficienti strumenti per manipolare l'espressione genica in epatociti sono pertanto utili3. Metodi consolidati come l'allevamento di ceppi di topi geneticamente ....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dalle autorità responsabili (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania e Stanford istituzionale Animal Care e utilizzare Comitato, Stanford, CA, USA). In tabella supplementare S1 viene fornito un elenco di tutti i plasmidi per la clonazione (passo 1 a 4).
1. clonazione di un Transgene per espressione genica costitutiva
- Disegnare primers per transgene amplificazione13,14.
- Aggiungere siti di restrizione p....
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Risultati
L'efficacia di transfezione di iniezione della vena della coda idrodinamica: La percentuale di epatociti murini che transfected idrodinamicamente tramite una singola iniezione è variabile e dipende da diversi parametri come il volume di iniezione, il tempo di iniezione, la quantità di DNA iniettato e dimensione del costrutto iniettato6, 22,23. Inoltre, l'efficienza di trasfezion.......
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Discussione
Transfezione di epatociti con l'iniezione della vena della coda idrodinamica è diventato un metodo stabilito sin dalla sua introduzione più di 15 anni fa6. Il volume iniettato supera la gittata cardiaca e confluisce dalla vena cava inferiore i sinusoids del fegato7, che conduce alla trasfezione di circa 10-20%, in alcuni casi fino al 40% di epatociti25,26. Predittori di una riuscita transfezione sono il volume iniet.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da Deutsche Krebshilfe, Germania (codice di autorizzazione 111289 per UE), il Lucile Packard Foundation per salute dei bambini (Ernest e Amelia Gallo dotato Postdoctoral Fellowship - numero di concessione CTSA UL1 RR025744 per UE). Grazie Dr Mark A. Kay per vettore costrutti e consulenza sperimentale e Dr Julien Sage per topi e sperimentali supportano.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | Scala DNA per elettroforesi |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | inclusione di criosezioni |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Bromuro di etidio | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | Per l'addolcimento della soluzione di doxiciclina |
| Ampicillina Sale sodico | AppliChem | A0839,0010 | Per la selezione di cloni |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Brodo (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicina solfato | AppliChem | A1492,0001 | Per la selezione di cloni resistenti alla gentamicina |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | soluzione para-formaldeide |
| T4 DNA Ligasi | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Mix enzimatico | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contiene LR-clonasi Mix enzimatico II e proteinasi K |
| DB3.1 Cellule competenti | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 E. coli chimicamente competente | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Enzimi di restrizione | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Per l'estrazione del DNA dal gel |
| NucleoSpin Gel e PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Estrazione di plasmidi (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Estrazione plasmidico (Maxi preparazione) |
| Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Materiali per esperimenti sui topi | |||
| Injekt Siringa F 1 ml | Braun | 9166017V | Per iniezione intraperitoneale |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | Per iniezione endovenosa |
| Cannula Sterican 24G Cannula Sterican 24G | 4657675 | ||
| Cannula Sterican 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifene | Sigma-Aldrich | T5648-1G | Per attivazione CreER |
| Olio di mais | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Vettore per iniezioni di tamoxifene |
| Doxiciclina iclilato | AppliChem | A2951,0025 | Attivazione dell'espressione tetraciclina-dipendente |
| Injekt 10 ml Siringa | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | Per la filtrazione della doxiciclina |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier per iniezioni endovenose Falcon |
| Tubo conico 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Lampada a infrarossi | N/A | N/A | Per il riscaldamento della coda di topo |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Sistema di imaging in vivo |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Plasmidi per la clonazione di vettori di trasposoni della bella addormentata per HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vettore per l'espressione genica costitutiva, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Vettore di ingresso per l'espressione genica inducibile, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Vettore di ingresso per l'espressione inducibile di miR-shRNA con co-espressione di GFP, rif. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Vettore di ingresso per l'espressione inducibile di miR-shRNA senza co-espressione di GFP, rif. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Vettore di espressione per l'espressione di un gene inducibile o di miR-shRNA con il promotore ApoE.HCR.hAAT, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Vettore di espressione per l'espressione di un gene inducibile o di miR-shRNA con promotore di CMV, rif. 11 |
Riferimenti
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159(2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 ....
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