Articolo metodologico

Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

DOI:

10.3791/56613

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2 febbraio 2018

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1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine, Medical Center University of Freiburg

In questo articolo

Sommario

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Iniezione della vena della coda idrodinamica di vettori di integrazione basata su trasposone consente trasfezione stabile di epatociti murini in vivo. Qui, presentiamo un protocollo pratico per sistemi di transfezione che consente l'espressione costitutiva a lungo termine di un transgene singolo o combinato espressione costitutiva e doxiciclina-viscoelastico di un transgene o miR-shRNA nel fegato.

Abstract

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Nei modelli di ricerca di cancro del fegato, di rigenerazione, di infiammazione e di fibrosi, sistemi flessibili per in vivo l'espressione genica e silenziamento sono molto utili. Iniezione della vena della coda idrodinamica dei costrutti basati su trasposone è un metodo efficiente per la manipolazione genetica degli epatociti in topi adulti. Oltre l'espressione costitutiva del transgene, questo sistema può essere utilizzato per applicazioni più avanzate, come implicazione di colpo, di shRNA-mediata del gene del sistema CRISPR/Cas9 per indurre mutazioni del gene, o sistemi di viscoelastici. Qui, la combinazione dell'espressione costitutiva CreER insieme espressione inducibile di un transgene o miR-shRNA di scelta si presenta come un esempio di questa tecnica. Copriamo la procedura multi-step a partire dalla preparazione della bella addormentata-trasposone costruisce, per l'iniezione e il trattamento dei topi e la preparazione del tessuto del fegato per analisi immunostaining. Il sistema presentato è un approccio affidabile ed efficiente per realizzare complesse manipolazioni genetiche negli epatociti. È particolarmente utile in combinazione con ceppi di topi Cre/loxP-based e può essere applicato ad una varietà di modelli nella ricerca dell'affezione epatica.

Introduzione

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L'affezione epatica cronica presenta un onere importante di salute nel mondo1. Modelli di ricerca sugli animali sono strumenti essenziali nello studio delle malattie epatiche e hanno contribuito a rispondere alle domande complesse nella rigenerazione del fegato, infiammazione epatica e steatosi, così come il cancro del fegato2. Un numero considerevole di questi modelli animali si basa sulla modificazione genetica delle cellule del fegato. Efficienti strumenti per manipolare l'espressione genica in epatociti sono pertanto utili3. Metodi consolidati come l'allevamento di ceppi di topi geneticamente o la generazione di vettori virali per l'infezione dell'epatocita sono entrambi harbor richiede tempo, problemi di sicurezza, o cedere l'espressione del transgene poveri in epatociti in vivo 4 , 5. iniezione della vena della coda idrodinamica (HTVI) è un metodo alternativo per la transfezione in vivo degli epatociti che consente per l'interrogatorio di facile, veloce e conveniente di funzione del gene nel fegato. Per HTVI, un vettore contenente la sequenza di DNA desiderata è dissolto in un volume di soluzione fisiologica corrispondente al 10% del peso corporeo dell'animale iniettato. La soluzione allora è iniettata nella vena della coda entro 5-10 s6. Superiore a gittata cardiaca, le saline scorre dalla vena cava inferiore nelle vene del fegato, che porta all'espansione del fegato e idrodinamica transfezione di epatociti7. Per realizzare l'integrazione genomica stabile, il metodo è stato combinato con vettori basati su trasposone, quali il sistema di trasposone dormire bellezza. Sistemi di questo media la ricombinazione dei vettori di destinazione con i siti di ricombinazione genomica catalizzate da un sonno bellezza -transposase8,9. Per i modelli di fibrosi del fegato o di carcinogenesi, è spesso desiderabile ai geni iperesprimere o silenzio determinati intervalli di tempo del modello di malattia. Per questo scopo, strumenti per l'espressione genica viscoelastica come Cre/LoxP-sistema o il sistema di espressione del gene tetraciclina-inducibile (Tet-On) può essere usato10.

Qui, descriviamo un protocollo per la transfezione in vivo di epatociti murini utilizzando HTVI di un sistema basato su trasposone addormentata . Oltre a un protocollo per l'espressione stabile, costitutiva di un transgene sotto il controllo di un promotore di fegato-specific, descriviamo un sistema più avanzato di vettore che unisce l'espressione costitutiva di tamoxifen-dipendente Cre ricombinasi (CreER) con la induzione dell'espressione genica di un transgene o shRNA adattato microRNA (miR-shRNA), chiamato il pTC TET-sistema11. In questo sistema vettoriale, transgeni inducibile o miR-shRNA per espressione tetraciclina-dipendente vengono clonati nel vettore backbone con un sistema di clonazione recombinational, permettendo la generazione facile e veloce di nuovi vettori12. Questa guida basate su video descrive la preparazione di opportuni vettori, iniezione e il trattamento dei topi per ottenere l'espressione del transgene/miR-shRNA viscoelastica ed infine la preparazione del tessuto del fegato per l'analisi. Il metodo descritto in questo protocollo è stato progettato per consentire la combinazione di qualsiasi sistema di topo Cre/loxP mediato con l'espressione o knock-down di qualsiasi gene di scelta, che lo rende un sistema ampiamente applicabile nella ricerca dell'affezione epatica.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dalle autorità responsabili (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania e Stanford istituzionale Animal Care e utilizzare Comitato, Stanford, CA, USA). In tabella supplementare S1 viene fornito un elenco di tutti i plasmidi per la clonazione (passo 1 a 4).

1. clonazione di un Transgene per espressione genica costitutiva

  1. Disegnare primers per transgene amplificazione13,14.
  2. Aggiungere siti di restrizione per PacI (TTAATTAA) all'estremità 5' del primer in avanti. Aggiungere siti di restrizione per AscI (GGCGCGCC) o FseI (GGCCGGCC) all'estremità 5' del reverse primer.
  3. Amplificare il transgene mediante PCR utilizzando condizioni ottimizzate per il transgene desiderato14. Purificare utilizzando un kit di purificazione di DNA commercialmente disponibile.
    Nota: Tempo di ricottura dipende il primer disegnati al punto 1.1., tempo di allungamento dipende dalla lunghezza del costrutto. Ad esempio, per un costrutto di 1.000 bp durata uso 60 s di tempo di allungamento.
  4. Digerire il transgene e vettore per gene costitutivo espressione15 con nucleasi di restrizione rispettivi (Vedi punto 1.2) e buffer in un volume totale di 50 µ l a 37 ° C durante la notte. Ad esempio, digerire costrutto con 5 unità PacI e 5 unità FseI se appropriato (Vedi punto 1.2).
  5. Gel di purificare vettore digerito e inserimento utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale secondo le istruzioni del produttore. Eseguire una legatura standard di 100 ng di vettore e 100 – 1.000 ng di inserimento mediante 400 U T4 ligasi a 14 ° C per 16 h. calore inattivare a 65 ° C per 10 min.
  6. Trasformare batteri competenti utilizzando standard calore-shock-protocollo16.
  7. Piastra su agar piastre contenenti 100 ampicillina di µ g/mL. Incubare a 30 ° C per 24 h.
  8. Scegliere singole colonie, purificare il DNA plasmidico utilizzando un kit commerciale miniprep secondo le istruzioni del produttore e verificare la sequenza di sequenziamento Sanger17 (primer di sequenziamento: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
  9. Utilizzare positivo colonie per maxi scala amplificazione del DNA del plasmide e purificano utilizzando un plasmide privo di endotossina preparazione kit18 secondo le istruzioni del produttore.
  10. Costrutto è pronto per l'iniezione, quindi continuare con il passaggio 5.

2. clonazione di un Transgene per l'espressione genica viscoelastica

  1. Disegnare primers per transgene amplificazione13,14.
  2. Aggiungere siti di restrizione per SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) o KpnI (GGTACC) all'estremità 5' del primer in avanti. Aggiungere siti di restrizione per NotI (GCGGCCGC) o XhoI (CTCGAG) all'estremità 5' del reverse primer.
  3. Amplificare il transgene mediante PCR utilizzando condizioni ottimizzate per il transgene desiderato14. Purificare utilizzando un kit di purificazione di DNA commerciale.
  4. Digerire il transgene purificato e 4 µ g di vettoriale voce (pEN_TTmcs-vettoriale, Vedi Tabella materiali)19 separatamente con nucleasi di restrizione appropriato (Vedi punto 2.2) e buffer in un volume totale di 50 µ l a 37 ° C durante la notte.
  5. Gel di purificare vettore digerito e inserimento utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale secondo le istruzioni del produttore. Eseguire la legatura standard con 100 ng di vettore e 100 – 1.000 ng di inserto utilizzando 400 U T4 ligasi a 14 ° C per 16 h. calore inattivare a 65 ° C per 10 min.
  6. Trasformare batteri competenti utilizzando standard calore-shock-protocollo16.
  7. Piastra su agar piastre contenenti gentamicina 15 µ g/mL. Incubare a 37 ° C per 16 h.
  8. Scegliere singole colonie, purificare il DNA del plasmide e verificare inserto di sequenziamento17 utilizzando il primer forward pCEP: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
    Nota: PCR sulle singole colonie può essere eseguita senza previa purificazione con primer pCEP avanti e pCEP inversa (AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC GCC 3' 5'). Questo passaggio può essere utile per la pre-selezione di colonie positive.
  9. Procedere al passaggio 4.

3. clonazione di un miR-shRNA per Inducible Gene Knock-down

  1. Progettare oligonucleotidi miR-shRNA secondo il pSLIK clonazione protocollo19. Tempri e purificare oligonucleotidi e diluire 01:20 in ddH2O.
  2. Digest 3 µ g del vettore di ingresso con 5 U BfuAI a 50 ° C per 3 h, quindi inattivare la reazione a 65 ° C per 20 min.
    Nota: Se si desidera co-espressione della proteina fluorescente verde (GFP), uso pEN_TTGmiRc19 come vettore di entrata, altrimenti usare pEN_TTmiRc219.
  3. Gel di purificare digerito vettoriale come descritto al punto 2.5. Eseguire la legatura standard di 100 ng di vettore e 1 µ l di purificato diluito shRNA oligonucleotidi (punto 3.1) utilizzando 400 U T4 ligasi a temperatura ambiente per 1 h. calore inattivare a 65 ° C per 10 min.
  4. Trasformare batteri competenti utilizzando standard calore-shock-protocollo16.
  5. Piastra su agar piastre contenenti gentamicina 15 µ g/mL. Incubare a 37 ° C per 16 h.
  6. Scegliere singole colonie, purificare il DNA del plasmide e inserto per verificare di sequenziamento Sanger17 (primer di sequenziamento: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
  7. Procedere al passaggio 4.

4. recombinational clonazione per generare cloni pronto per l'iniezione

  1. Mix 150 ng del vettore di ingresso (da passo 2 o 3) e 150 ng di pTC TET-vector20.
  2. Aggiungere buffer di TE per un volume totale di 8 µ l (pH = 8).
  3. Trasferire il mix di enzima di LR-clonase II (Vedi Tabella materiali) per il ghiaccio, incubare per 2 min Vortex due volte.
  4. Aggiungere 2 µ l di miscela di enzima LR-clonase II alla reazione e incubare a 25 ° C per 1 h.
  5. Fermare la reazione aggiungendo 1 µ l di proteinasi K-soluzione. Incubare a 37 ° C per 10 min.
  6. Trasformare Stbl3 batteri competenti con 2 µ l di recombinational clonazione mescolano utilizzando standard calore-shock-protocollo16.
  7. Piastra su agar piastre contenenti 100 ampicillina di µ g/mL. Incubare a 30 ° C per 24 h.
  8. Scegliere singole colonie, purificare il DNA plasmidico utilizzando un plasmide privo di endotossina preparazione kit18 secondo le istruzioni del produttore e confermare l'integrità vettoriale da di sequenziamento Sanger17 (primer di sequenziamento 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
  9. Costrutto è pronto per l'iniezione, continuare con il passaggio 5.

5. preparare la soluzione per iniezione della vena della coda idrodinamica

Nota: Preparazione di costrutti per l'espressione genica costitutiva e inducibile sono descritti nel passaggio 1, 2, 3 e 4.

  1. Preparare soluzione fisiologica 0,9% sterile iniettabile (fare non uso PBS). Utilizzare il volume corrispondente a circa il 10% del peso corporeo del mouse. Esempio: per un mouse peso 20 g, preparare 2 mL di soluzione.
  2. Preparare i vettori di iniezione che sono stati purificati utilizzando un kit di purificazione plasmide privo di endotossina18 (Vedi punto 1.8 o 4.8, rispettivamente).
  3. Aggiungere 10 µ g o 15 µ g di endotossina-libero addormentata vettore costrutto (da passo 1 uso 10 µ g, da passo 4 uso 15 µ g, rispettivamente) e 1 µ g di endotossina-free pc-HSB521 per mL di soluzione fisiologica sterile.
  4. Conservare la soluzione per fino a 4 h a 4 ° C. Non congelare.

6. esecuzione di iniezione della vena della coda idrodinamica

  1. Utilizzare un dispositivo di ritenuta per iniezione della vena della coda (commerciale o preparati da un tubo conico da 50 mL con fori per la respirazione e per la coda). Riempire il fondo del tubo con la carta velina.
  2. Per l'iniezione, è possibile utilizzare topi di circa 8 – 10 settimane di età con pesi di 20 – 25 g.
  3. Pesare i topi prima dell'iniezione e preparare il volume di iniezione secondo il peso corporeo (corrispondente al 10% del peso corporeo, vedi punto 5.1). Preparare un 3 mL-siringa sterile con un 27 G-ago per iniezione e riempire con il volume richiesto.
  4. Posizionare il mouse nel dispositivo di ritenuta. Regolare la quantità di carta velina (Vedi punto 6.1) di lasciare solo un minimo spazio per il movimento ma abbastanza spazio per respirare.
  5. Assicurarsi che il mouse è respirando regolarmente.
  6. Caldo la coda utilizzando una lampada a raggi infrarossi per 30-60 s. attentamente attenzione ai segni di surriscaldamento.
  7. Pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool.
  8. Inserire l'ago quasi orizzontalmente in uno delle due vene coda laterale vicino alla base della coda.
    Nota: Se posizionato correttamente, una piccola quantità di sangue potrebbe fluire nuovamente dentro il cono dell'ago. Non è consigliabile per aspirare attivamente come qualsiasi ulteriore movimento dell'ago può provocare la sua cilindrata e/o lesioni della vena.
  9. Iniettare il volume totale in vena caudale entro 8-10 s.
  10. Rimuovere immediatamente il mouse dal dispositivo di ritenuta. Comprimere iniezione ferita per almeno 30 s o fino alla scomparsa del qualsiasi sanguinamento.
  11. Posizionare il mouse in una gabbia separata. Una volta che il mouse ha recuperato dalla procedura (circa 30 – 60 minuti), è possibile trasferire il mouse torna alla sua gabbia originale. Controllare il mouse regolarmente per il prossimo 24 h.
    Nota: Lieve sedazione del mouse ordinariamente è osservato per fino a 2 h dopo l'iniezione.
  12. Prima di procedere con ulteriori esperimenti (cioè, passaggio 7), attendere 10-15 giorni per la liquidazione dei vettori non integrati.

7. induzione di CreER trasfettate con il tamoxifene

Attenzione: Il tamoxifene è nocivo, può essere cancerose o nuocere alla fertilità. Fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza.

  1. Pianificare le iniezioni intraperitoneali tamoxifen per tre giorni consecutivi.
  2. Il giorno 1, sciogliere 10 mg di tamoxifene in etanolo al 40 µ l. Incubare a 55 ° C per 10 min. vortice più volte fino a sciolta il tamoxifen.
  3. Aggiungere olio di mais 960 µ l. Incubare per 5 minuti a 55 ° C. Vortice diverse volte per ottenere una soluzione limpida.
  4. Preparare la soluzione in una siringa da insulina 1 mL con ago 27G.
  5. Collottola del mouse afferrando il collo del mouse attentamente con il pollice e il secondo dito, la coda tra la base della mano e il quarto e il quinto dito di fissaggio.
  6. Iniettare 0,1 mL (= 1 mg di tamoxifene) della soluzione per via intraperitoneale nel quadrante inferiore sinistro dell'addome.
  7. Ripetere le iniezioni in giorni due e tre.

8. induzione del Gene tetraciclina-dipendente o shRNA espressione

Attenzione: Doxiciclina può essere dannosa. Fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza.

Nota: A seconda del tipo e la durata dell'esperimento, doxiciclina possa essere fornita in acqua potabile (punto 8.1) o chow (punto 8.2)

  1. Per esperimenti di breve termine (< 10 giorni) amministrare doxiciclina via acqua potabile utilizzando il seguente protocollo.
    1. Sciogliere 5 g di saccarosio in 100 mL di acqua di rubinetto. Sterilizzare in autoclave.
    2. Sciogliere 100 mg di doxiciclina-hyclate in 5 mL di soluzione di saccarosio (punto 8.1.1) in una provetta conica da 15 mL.
    3. Utilizzando una siringa 10 mL, filtro sterile la soluzione attraverso un filtro di 0,2 µm. Aggiungere alla soluzione di saccarosio preparata al punto 8.1.1.
    4. Fornitura di doxiciclina-saccarosio soluzione come acqua potabile per il mouse. Controllare tutti i giorni e sostituirlo quando la soluzione diventa torbida che indica la crescita eccessiva batterica (sostituire la soluzione limpida dopo tre giorni al più tardi).
  2. Per gli esperimenti a lungo termine (> 10 giorni) o esperimenti sensibili a cambiamenti metabolici, utilizzare doxiciclina-chow commerciale (ad es., Doxycycline Hyclate Chow 0,625 g/kg) per evitare la disidratazione e/o cambiamenti indotti da saccarosio nei fegati degli animali trattati.

9. preparazione del fegato del topo per analisi immunostaining

Attenzione: Paraformaldeide può essere dannoso. Fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza.

Nota: Il timepoint quando saranno analizzati topi dipende l'esperimento. Si raccomanda di analizzare il tessuto del fegato dopo non meno di tre giorni di trattamento doxiciclina per garantire sufficiente induzione dell'espressione del transgene o shRNA.

  1. Preparare una siringa da 1 mL con ago 27G con 1 mL di soluzione di paraformaldeide 4% (PFA).
  2. Eutanasia il mouse mediante un metodo appropriato secondo un protocollo approvato animale.
    Nota: Le linee guida per i metodi appropriati di eutanasia possono variare a seconda dell'istituzione.
  3. Con delle forbici per dissezione, pinze anatomiche, aprire con cautela la cavità addominale con una laparotomia mediana per esporre il fegato. Spostare il piccolo intestino a destra per esporre la vena porta e la vena cava inferiore (IVC).
  4. Inserire l'ago della siringa preparata (Vedi punto 9.1) nell'IVC e taglio della vena portale. Iniettare 1 mL di PFA lentamente nella VCI per irrorare il tessuto del fegato e rimuovere auto-fluorescente globuli rossi (auspicabile se macchiatura immunofluorescente verrà eseguita).
  5. Rimuovere il fegato. Risciacquare in acqua e trasferire al 5 – 10 mL di soluzione al 4% PFA.
  6. Per sezioni di paraffina, tessuto di correzione per 36 – 48 h. tessuto è pronto per disidratazione e inclusione in paraffina.
  7. Per sezioni congelate, difficoltà del tessuto in 4% PFA per 1 h.
    1. Per crioprotezione, trasferire alla soluzione di saccarosio al 10%. Incubare per 60 minuti.
    2. Trasferimento a soluzione di saccarosio al 20%. Incubare per 60 minuti.
    3. Trasferimento a soluzione di saccarosio al 30%. Incubare per 12 – 16 h. Embed in incorporamento composto per sezioni congelate e congelare a-20 ° C.

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Risultati

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L'efficacia di transfezione di iniezione della vena della coda idrodinamica: La percentuale di epatociti murini che transfected idrodinamicamente tramite una singola iniezione è variabile e dipende da diversi parametri come il volume di iniezione, il tempo di iniezione, la quantità di DNA iniettato e dimensione del costrutto iniettato6, 22,23. Inoltre, l'efficienza di trasfezion...

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Discussione

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Transfezione di epatociti con l'iniezione della vena della coda idrodinamica è diventato un metodo stabilito sin dalla sua introduzione più di 15 anni fa6. Il volume iniettato supera la gittata cardiaca e confluisce dalla vena cava inferiore i sinusoids del fegato7, che conduce alla trasfezione di circa 10-20%, in alcuni casi fino al 40% di epatociti25,26. Predittori di una riuscita transfezione sono il volume iniet...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da Deutsche Krebshilfe, Germania (codice di autorizzazione 111289 per UE), il Lucile Packard Foundation per salute dei bambini (Ernest e Amelia Gallo dotato Postdoctoral Fellowship - numero di concessione CTSA UL1 RR025744 per UE). Grazie Dr Mark A. Kay per vettore costrutti e consulenza sperimentale e Dr Julien Sage per topi e sperimentali supportano.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher#SM1331Scala DNA per elettroforesi
Tissue-Tek O.C.T.Sakura4583inclusione di criosezioni
Biozym LE AgaroseBiozym840004
Bromuro di etidioSigma-AldrichE7637-1G
D(+)-SaccharoseCarl Roth4621.1Per l'addolcimento della soluzione di doxiciclina
Ampicillina Sale sodicoAppliChemA0839,0010Per la selezione di cloni
LB Agar (Luria/Miller)Carl RothX969.1
LB Brodo (Luria/Miller)Carl RothX968.1
S.O.C. MediumThermo Fischer15544034
Gentamicina solfatoAppliChemA1492,0001Per la selezione di cloni resistenti alla gentamicina
Roti-Histofix 4 %Fa. RothP087.6soluzione para-formaldeide
T4 DNA LigasiNew England BioLabsM0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Mix enzimaticoinvitrogen/ThermoFisher11791-020contiene LR-clonasi Mix enzimatico II e proteinasi K
DB3.1 Cellule competentiThermo Fisher11782-018
Stbl3 E. coli chimicamente competenteThermo FisherC737303
NameAziendaNumero di catalogoComments
Enzimi di restrizione
PacINew England BioLabsR0547S
AscINew England BioLabsR0558S
FseINew England BioLabsR0588S
SacINew England BioLabsR0156S
SpeINew England BioLabsR0133S
KpnINew England BioLabsR0142S
NotINew England BioLabsR0189S
XhoINew England BioLabsR0146S
BfuAINew England BioLabsR0701S
NameAziendaNumero di catalogoComments
Kits
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Per l'estrazione del DNA dal gel
NucleoSpin Gel e PCR Clean UpMacherey & Nagel740609.10
NucleoBond PC20Macherey & Nagel740571Estrazione di plasmidi (Mini prep)
NucleoBond PC500Macherey & Nagel740574Estrazione plasmidico (Maxi preparazione)
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltàThermo FisherF530S
NameCompanyNumero di catalogoComments
Materiali per esperimenti sui topi
Injekt Siringa F 1 mlBraun9166017VPer iniezione intraperitoneale
Omnifix Luer 3 mlBraun4616025VPer iniezione endovenosa
Cannula Sterican 24G Cannula Sterican 24G4657675
Cannula Sterican 27GBraun4657705
TamoxifeneSigma-AldrichT5648-1GPer attivazione CreER
Olio di maisSigma-AldrichC8267-500MLVettore per iniezioni di tamoxifene
Doxiciclina iclilatoAppliChemA2951,0025Attivazione dell'espressione tetraciclina-dipendente
Injekt 10 ml SiringaBraun4606108V
Filtropur S 0.2Sarstedt831,826,001Per la filtrazione della doxiciclina
NaCl 0,9%Braun3200905Carrier per iniezioni endovenose Falcon
Tubo conico 50mlCorning Life Science352095
Lampada a infrarossiN/AN/APer il riscaldamento della coda di topo
IVISPerkin Elmer124262Sistema di imaging in vivo
NameCompanyNumero di catalogoComments
Plasmidi per la clonazione di vettori di trasposoni della bella addormentata per HTVI.
pTCn/aVettore per l'espressione genica costitutiva, ref. 15
pEN_TTmcsAddgene #25755Vettore di ingresso per l'espressione genica inducibile, ref. 19
pEN_TTGmiRc2Addgene #25753Vettore di ingresso per l'espressione inducibile di miR-shRNA con co-espressione di GFP, rif. 19
pEN_TTmiRc2Addgene #25752Vettore di ingresso per l'espressione inducibile di miR-shRNA senza co-espressione di GFP, rif. 19
pTC ApoE-TetAddgene #85578Vettore di espressione per l'espressione di un gene inducibile o di miR-shRNA con il promotore ApoE.HCR.hAAT, ref. 11
pTC-CMV-TetAddgene #85577Vettore di espressione per l'espressione di un gene inducibile o di miR-shRNA con promotore di CMV, rif. 11
resistenti all'Amp

Riferimenti

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