Questo articolo presenta un metodo che coinvolge la sintesi e la caratterizzazione delle micelle di amphiphile peptide monocito-targeting e le corrispondenti saggi per verificare la biocompatibilità e capacità la micella di associare ai monociti.
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Articolo metodologico
Sintesi del monocito-targeting Peptide Amphiphile micelle per l'Imaging di aterosclerosi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'aterosclerosi è un contributore importante alla malattia cardiovascolare, la principale causa di morte nel mondo, che sostiene 17,3 milioni di vite ogni anno. L'aterosclerosi è anche la principale causa di morte improvvisa e l'infarto miocardico, istigato da placche instabili che si rompono e occludono il vaso sanguigno senza avviso. Modalità di formazione immagine corrente non può distinguere tra placche stabili e instabili che rottura. Micelle di peptide anfifili (PAMs) possono ovviare a questo inconveniente come possono essere modificati con una varietà di molecole che si legano specificamente a tessuto malato di targeting. I monociti sono stati indicati per essere marker precoce di aterosclerosi, mentre il grande accumulo di monociti è associato con le piastre alla rottura incline. Quindi, nanoparticelle che possono mirare monociti possono essere utilizzate per discriminare le diverse fasi di aterosclerosi. A tal fine, qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di monocito-targeting PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sono auto-assemblate attraverso sintesi in condizioni blande di forma nanoparticelle di 15 nm di diametro con vicino neutro carica superficiale. In vitro, PAMs sono state trovate per essere biocompatibile e aveva una legame ad alta affinità per i monociti. I metodi descritti nel presente documento mostrano la promessa per una vasta gamma di applicazioni nell'aterosclerosi, nonché altre malattie infiammatorie.
Introduzione
Le malattie cardiovascolari rimangono per essere le principali cause di morte a livello mondiale con circa 17,3 milioni di morti in tutto il mondo1. Le malattie cardiovascolari sono fornite da aterosclerosi, una condizione in cui si accumulano le placche nelle arterie, quindi inibente sangue e flusso di ossigeno alle cellule del corpo2,3. La progressione di aterosclerosi coinvolge l'ispessimento e l'indurimento delle arterie da una risposta infiammatoria, metabolismo dei lipidi irregolare e l'accumulazione della placca, che conduce a placca la rottura e l'infarto miocardico
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Protocollo
Nota: Leggere la scheda di sicurezza per i reagenti e seguire tutte le misure di sicurezza chimica come richiesto dall'istituzione locale.
1. preparazione di MCP-1 PAMs
-
Preparazione del peptide di MCP-1
- Pesare 0,25 mmol di Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in un recipiente di reazione (RV). Sciacquare il lato del camper con 5ml dimethylforamide (DMF) in una cappa chimica.
- Caricare il camper su un sintetizzatore di peptidi di benchtop automatizzato. Carico pre-confezionato aminoacido fiale, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', dal C a N-terminale. Includere un flaconcino vuoto alla fine per il passo finale....
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Risultati
Preparazione di MCP-1 PAM
Il motivo di CCR2-legante (residui, 13-35) della proteina di MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] o strapazzato peptide [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] è stato modificato mediante l'aggiunta di un residuo di cisteina su N-terminale. Il peptide di MCP-1 è stato sintetizzato da un metodo di fase solida Fmoc-mediata utilizzando un sintetizzatore di peptidi automatizzato. Il peptide grezzo è stato purificato mediante HPLC in fase inversa su una colonna C8 a 5.......
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Discussione
MCP-1 PAMs sono una promettente piattaforma di imaging molecolare, costituito da un peptide di targeting idrofilo e coda idrofobica che spinge la natura auto-assemblata di nanoparticella. Questa micella monocito-targeting può essere preparato da semplice sintesi e fasi di purificazione del peptide di MCP-1 e DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs hanno molte caratteristiche benefiche per in vivo imaging molecolare come loro self-assembly sotto condizioni blande, biodegradabilità intrinseca e diversità strutturali e chimich.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori si desidera ringraziare il sostegno finanziario alla University of Southern California, il National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli ed Edythe Broad Innovation Award e il L.K. Whittier Foundation Non-cancro Premio di ricerca traslazionale concesso a EJC. Gli autori ringraziano il centro per la microscopia elettronica e microanalisi, centro di eccellenza in NanoBiophysics, centro di eccellenza per la caratterizzazione molecolare e traduzione Imaging Center presso la University of Southern California per assistenza in configurazioni di strumentale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-etanedithiol | VWR | E0032 | per la sintesi di peptidi |
| 10 mL pipette sierologiche monouso | VWR | 89130-898 | per colture cellulari |
| 15 mL provette da centrifuga, polipropilene | VWR | 89401-566 | per varie applicazioni |
| Acido 2,5-diidrossibenzoico, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | per MALDI |
| 25 mL monouso pipette sierologiche | VWR | 89130-900 | per colture cellulari |
| 2-Mercaptoetanolo, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | per colture cellulari |
| 5 mL pipette sierologiche monouso | VWR | 89130-896 | per colture cellulari |
| 50 mL provette da centrifuga | VWR | 89039-658 | per varie applicazioni |
| Pallone di coltura da 75 cm2 | Fisher Scientific | 13-680-65 | per coltura cellulare |
| recipiente di reazione da 75 mL | Protein Technologies | 3000005 | per la sintesi di peptidi |
| piastra per colture cellulari a 96 pozzetti | VWR | 40101-346 | per saggio MTS |
| Acetonitrile, grado HPLC | Fisher Scientific | A998SK-4 | per purificazione HPLC |
| Vetro borosilicato, 1 dram | VWR | 66011-041 | per la sintesi PAM |
| Pipetta in vetro borosillicato, punte lunghe | VWR | 14673-043 | per varie applicazioni |
| Vetrino coprioggetti, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | per microscopia confocale |
| Cy5 ammina | Abcam | ab146463 | per coniugazione di peptidi |
| Etere dietilico, grado ACS | Fisher Scientific | E138-1 | per precipitazione di peptidi |
| Monouso siringhe, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | per purificazione HPLC |
| Emocitometro a doppio neubauer VWR | 63510-13 | per conteggio di cellule | |
| DSPE-PEG(2000) ammina | Avanti | 880128P | per coniugazione di peptidi |
| DSPE-PEG(2000) maleimmide | Avanti | 880126P | per coniugazione di peptidi |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | per la coniugazione con Cy5 |
| Eagle modificato di Dulbecco glucosio medio-alto | Sigma | Aldrich D5796-500ML | per colture cellulari |
| Siero fetale bovino, qualificato, inattivato a caldo | ThermoFisher Scientific | 10438026 | per colture cellulari |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | per la sintesi |
| di peptidiFmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | per la sintesi di peptidi |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | per la sintesi di peptidi |
| Resina Fmoc-Lys(Boc)-wang, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | per la sintesi di peptidi |
| Acido formico, grado LC/MS ottimale | Fisher Scientific | A117-50 | per la purificazione HPLC |
| Glicerolo | VWR | M152-1L | per microscopia confocale |
| Contatore di conteggio manuale | Fisher Scientific | S90189 | per il conteggio delle cellule |
| Barre di agitazione magnetiche, | VWR | 58949-006 | per coniugazione di peptidi |
| Metanolo, certificato ACS | Fisher Scientific | A412-4 | per la sintesi di PAM |
| Kit di saggio colorimetrico per la proliferazione cellulare MTS | VWR | 10191-104 | per il saggio MTS |
| N,N-Dimetilformammide, grado di sequenziamento | Fisher Scientific | BP1160-4 | per la sintesi di peptidi |
| N-Metilmorfolina | Protein Technologies | S-1L-NMM | per la sintesi di peptidi |
| Paraformaldeide | Fisher Scientific | AC416780250 | per il fissaggio di cellule |
| PBS, pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | per varie applicazioni |
| Penicillina/streptomicina, 10.000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | per colture cellulari |
| Recipiente di sintesi peptidica, 25 mL& nbsp; | Fisher Scientific | CG186011 | per la sintesi di peptidi |
| Acido fosfotungstico | Fisher Scientific | A248-25 | per TEM |
| Spettro di piperidina | P1146-2.5LTGL | per sintesi di peptidi | |
| Vetrino per microscopio in vetro semplice 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | per microscopia confocale |
| Serbatoi di reagenti, sterili | 95128093 | VWR per colture cellulari | |
| Pinzetta autochiudente | TedPella | 515 | per TEM |
| Pellicola di supporto TEM | TedPella | 01814F | per TEM |
| Acido trifluoroacetico | Fisher Scientific | BP618-500 | per la scissione dei peptidi e la purificazione HPLC |
| Triisopropilsilano | VWR | TCT1533-5 ml | per la scissione dei peptidi |
| Soluzione di tripano blu, 0,4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | per il conteggio delle cellule |
| VWR | 231-SA-SE | seghettato per uso generale | per microscopia confocale |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | sintetizzatore |
| di peptidi da banco automatizzato | Sintetizzatore di peptidi da banco | Protein Technologies | |
| α- acido ciano-4-idrossicinnamico, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | per MALDI |
Riferimenti
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12....
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Ristampe e permessi
