Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell'attività luciferasica.
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Articolo metodologico
Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Interazioni proteina-proteina sono meccanismi fondamentali per l'inoltro della trasduzione del segnale nei processi più cellulari; Pertanto, identificazione delle coppie di interazione proteina-proteina novella e dinamiche di interazione della proteina di monitoraggio sono di particolare interesse per rivelare come le piante rispondono ai fattori ambientali e/o segnali inerente allo sviluppo. Una pletora di approcci sono stati sviluppati per esaminare le interazioni proteina-proteina, sia in vitro che in vivo. Tra questi, la complementazione di luciferase recentemente stabilito imaging (LCI) analisi è il metodo più semplice e veloce per la dimostrazione in vivo interazioni proteina-proteina. In questo test, proteina A o proteina B si fonde con la metà amino-terminale o carbossi-terminale della luciferasi, rispettivamente. Quando la proteina A interagisce con la proteina B, le due metà della luciferasi verrà ricostituita per formare un enzima luciferasi funzionale e attivo. L'attività luciferasica può essere registrato con un luminometro o la telecamera CCD. Rispetto ad altri approcci, il dosaggio LCI Mostra interazioni proteina-proteina sia qualitativamente che quantitativamente. L'infiltrazione di Agrobacterium in foglie di Nicotiana benthamiana è un sistema ampiamente utilizzato per l'espressione della proteina transitoria. Con la combinazione di LCI ed espressione transiente, questi approcci mostrano che l'interazione fisica tra COP1 e SPA1 è stata gradualmente ridotta dopo il trattamento jasmonato.
Introduzione
Al fine di coordinare la crescita con il suo ambiente, le piante hanno sviluppato eleganti vie di segnalazione per percepire, trasduce e rispondere ai segnali di segnalazione. Come i corridori in una gara a staffetta, le proteine sono necessari giocatori nella trasduzione del segnale di pianta. È stato ampiamente riconosciuto che l'interazione proteina-proteina (PPI) svolge un ruolo importante per la comunicazione cellulare. Degradazione, acetilazione e fosforilazione della proteina dipendono tutti dalla interazione fisica tra una proteina dell'obiettivo e suoi enzimi di modificazione. Ad esempio, proteine della famiglia di Jasmonate ZIM-dominio della proteina (JAZ) i....
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Protocollo
1. preparazione delle piante (8 settimane)
- Mettere 50 semi di Nicotiana benthamiana in una microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di 5% NaClO e soluzione 0,1% Triton X-100 (V/V) e lasciare agire per 5 min sterilizzare i semi.
- Sciacquare i semi con acqua sterile 5 volte e sospendere semi in 200 µ l di acqua sterile.
- Accuratamente posto semi individuali sulla superficie del terreno di MS-agar (1 l.: 1 x sali di Murashige e Skoog, 10 g di saccarosio, pH 5,8 (KOH), 1% agar) con estremità sottili e piastre di terreno di negozio a 4 ° C per 3 giorni sincronizzare la germinazione.
Nota: Per evitare la contaminazione di microbo, es....
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Risultati
Tre passaggi principali possono essere individuati in questo protocollo di complementazione di luciferase per lo studio delle proteine interazioni in vivo, tra cui la crescita delle piante, l'infiltrazione di tabacco e l'analisi di luciferase. Il passaggio più importante in questo protocollo è infiltrazione del liquido a. tumefaciens in N. benthamiana foglie (Figura 1).
Ec.......
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Discussione
Il protocollo descritto qui è semplice e riproducibile per studiare in vivo interazioni proteina-proteina e particolarmente adatto per la rilevazione di dinamiche di interazione della proteina sotto trattamento esogeno. Il passo fondamentale in questa analisi è N. benthamiana infiltrazione. Per garantire il successo di infiltrazione, le piante devono essere molto sani. Un altro fattore critico è quando controllare l'attività luciferasica dopo infiltrazione. Non c'è nessuna risposta corretta a questa dom.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione con scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20140919), National Natural Science Foundation of China (31470375), la priorità programma sviluppo di Jiangsu istruzione superiore istituzioni accademiche e Qing Lan Project.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di trasformazione | |||
| 10 mM Acido morfolinetsolfonico | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucosio | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2&volte; 6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μ M Acetosiringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5,7 | |||
| Luciferina tampone di lavoro | |||
| 5 mM Luciferina sale di potassio | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0,025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O a 10 ml |
Riferimenti
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature....
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Ristampe e permessi
