Questo protocollo descrive un nuovo metodo per lo studio di una forma di neurostimolazione chimica del wholemount ratto retine in vitro con il glutammato, un neurotrasmettitore. Neurostimolazione chimica è un'alternativa promettente per la neurostimolazione elettrica convenzionale dei neuroni retinici per il trattamento di cecità irreversibile causata da malattie degenerative dei fotorecettori.
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Articolo metodologico
Metodologia per la neuromodulazione Biomimetic chimico di retine del ratto con il neurotrasmettitore glutammato In Vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattie degenerative dei fotorecettori causano cecità irreparabili attraverso la progressiva perdita di cellule fotorecettrici della retina. Le protesi retiniche sono un trattamento emergente per le malattie degenerative dei fotorecettori che cercano di ripristinare la visione stimolando artificialmente i neuroni retinici superstiti nella speranza di suscitare comprensibile percezione visiva in pazienti. Corrente protesi retiniche hanno dimostrato successo nel ripristinare la visione limitata ai pazienti utilizzando una matrice di elettrodi per elettricamente stimolano la retina ma affrontare notevoli ostacoli in ripristino alta acuità, visione naturale ai pazienti. Neurostimolazione chimica usando neurotrasmettitori nativi è una stimolazione alternativa elettrica biomimetici e potrebbe bypassare le limitazioni fondamentali connesse con protesi retiniche con neurostimolazione elettrica. In particolare, neurostimolazione chimica ha il potenziale per ripristinare la visione più naturale con le acuità visiva paragonabile o migliore ai pazienti iniettando piccole quantità di neurotrasmettitori, gli stessi agenti naturali di comunicazione utilizzati da Retina prodotto chimico sinapsi, a risoluzione molto più fine rispetto a protesi elettriche corrente. Tuttavia, come un paradigma di stimolazione relativamente inesplorato, non c'è nessun protocollo stabilito per raggiungere stimolazione chimica della retina in vitro. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un quadro dettagliato per l'effettuazione di stimolazione chimica della retina per i ricercatori che desiderano studiare il potenziale di neuromodulazione chimica della retina o simili tessuti neurali in vitro. In questo lavoro descriviamo la messa a punto sperimentale e la metodologia per suscitare retiniche del ganglio (RGC) spike risposte simili a visual luce le risposte delle cellule nel selvaggio-tipo e controllato retine del ratto del fotoricettore-degenerato wholemount iniettando volumi di il glutammato, un neurotrasmettitore nello spazio subretinal usando vetro Micropipette e un dispositivo microfluidico multiporta personalizzato. Questa metodologia e il protocollo sono abbastanza generale per essere adattato per neuromodulazione con altri neurotrasmettitori o anche altri tessuti neurali.
Introduzione
Malattie degenerative del fotoricettore, come la retinite pigmentosa e degenerazione maculare senile, stanno conducendo ereditabili cause di perdita della visione e sono attualmente incurabile1,2. Anche se queste malattie derivano da una varietà di specifiche mutazioni genetiche, malattie degenerative del fotoricettore sono caratterizzate come gruppo dalla perdita progressiva delle cellule fotorecettrici nella retina, causando eventualmente cecità. La perdita di trigger di fotorecettori diffusa che ritocca in tutta la retina, ma sopravvivere neuroni retinici, tra cui le cellule bipolari e RGCs, rimangono intatti e relativamente funzionale anche negli stadi avanzati di fotorecettore degenerazione3 ,4,5,6,7.
I meccanismi e le patologie di queste malattie sono state ben caratterizzate3,4,5,6,7 , ma un efficace trattamento resta sfuggente. Negli ultimi tre decenni, i ricercatori in tutto il mondo hanno studiato una varietà di trattamenti terapeutici per ripristinare la visione a persone affette da malattie degenerative dei fotorecettori, tra cui gene terapia8, cellule staminali trattamento9, trapianto retinico10e stimolazione artificiale11,12 dei neuroni della retina superstiti. Di questi, il più clinicamente disponibili sono protesi retiniche, che sono dispositivi di neurostimolazione artificiale che tradizionalmente hanno utilizzato un array di elettrodi per stimolare elettricamente le cellule bipolari o RGCs secondo schemi specifici con l'obiettivo di creazione di percezioni visive artificiali in pazienti11. Protesi elettrica attuale generazione, come l'Argus II13 e Alpha-IMS14 dispositivi, hanno ottenuto approvazione clinica e studi preliminari hanno indicato che può migliorare la qualità della vita per i pazienti ripristinando un misura della visione utilizzando sia epiretinica (anteriore della retina) e subretinal (dietro la retina) impiantato dispositivi15,16. Gruppi di ricerca intorno al mondo stanno lavorando su avanzando protesi retiniche dopo i successi di questi dispositivi prima generazione17,18,19,20 ma hanno affrontato Difficoltà progettare una protesi elettrica in grado di ripristinare la visione alta acuità inferiore al livello di cecità legale ai pazienti. Recenti studi hanno dimostrato che raggiungere la maggiore risoluzione spaziale di quella attivata per la generazione di corrente elettrica basato su protesi è impegnativo a causa del limite di iniezione di carica, che richiede l'uso di elettrodi grandi per stimolare in modo sicuro neuroni retinici a costo di risoluzione spaziale, cioè l'acuità visiva11,21. Inoltre, la stimolazione elettrica è ulteriormente limitato perché in genere stimola tutte le cellule vicine e quindi suscita percezioni innaturale e confusione nei pazienti, in gran parte perché è un paradigma di stimolazione intrinsecamente innaturale21. Tuttavia, i primi successi di stimolazione elettrica hanno dimostrato che la neurostimolazione artificiale può essere un efficace trattamento per le malattie degenerative del fotoricettore. Questo porta a ipotizzare che un trattamento ancora più efficace potrebbe essere realizzabile stimolando la retina con prodotti chimici di neurotrasmettitore, gli agenti naturali di comunicazione alle sinapsi chimiche. Lo scopo del metodo presentato in questa carta è quello di esplorare la fattibilità terapeutica della stimolazione chimica, che cerca di imitare il sistema naturale di comunicazione sinaptica tra neuroni retinici, come una stimolazione alternativa elettrica biomimetici per una protesi retinica.
Traduzione del concetto di stimolazione terapeutica chimica ad una protesi retinica chimica si basa su chimicamente attivazione di neuroni retinici di destinazione con piccole quantità di neurotrasmettitori nativi, come il glutammato, rilasciato attraverso un microfluidica dispositivo costituito da una vasta gamma di microporta in risposta alla stimolazione visiva. In questo modo, una protesi retinica chimica sarebbe essenzialmente uno strato di fotorecettori artificiali biomimetici che traduce fotoni naturalmente raggiunge la retina a segnali chimici. Poiché questi segnali chimici utilizzano gli stessi neurotrasmettitori utilizzati nella segnalazione della retina normale e stimolano i neuroni retinici superstiti di un degenerato retina attraverso le stesse vie sinaptiche utilizzato da vie di visione normale, il visual risultante percezione attraverso una protesi retinica chimica potrebbe essere più naturale e comprensibile rispetto a una evocata attraverso una protesi elettrica. Inoltre, poiché il microporta attraverso il quale vengono rilasciati i neurotrasmettitori possa essere fatte estremamente piccolo e raggruppate in alta densità, a differenza degli elettrodi, un potenziale chimico protesico potrebbe essere in grado di raggiungere più stimolo focale e superiore spaziale risoluzione rispetto a una protesi elettrica. Così, una protesi retinica chimica basato su questi potenziali vantaggi, offre un'alternativa altamente promettente per protesi elettriche.
Stimolazione chimica della retina, tuttavia, è stato relativamente poco esplorata fino a poco tempo. Mentre la stimolazione elettrica della retina è stata caratterizzata bene in decenni di lavoro attraverso in vitro22,23, in vivo23,24e studi clinici13 ,14, studi sulla stimolazione chimica sono stati limitati esclusivamente a pochi in vitro opere25,26,27,28. Iezzi e Finlayson26 e Inayat et al. 27 ha dimostrato epiretinal stimolazione chimica del retina in vitro utilizzando un singolo elettrodo e una matrice multielettrodo (MEA), rispettivamente, per registrare le risposte di glutammato evocato dei neuroni retinici. Più recentemente, Rountree et al. 28 ha dimostrato la stimolazione differenziale delle vie e spegnendo retiniche con glutammato dal lato subretinal e un MEA per registrare le risposte di un neurone da più siti sulla retina.Anche se questi lavori hanno stabilito preliminarmente la fattibilità di stimolazione chimica, ulteriori studi sono essenziali per studiare molti aspetti di questo approccio di là di quelli affrontati finora25,26,27 , 28e ottimizzare i parametri di stimolazione terapeutica in modelli animali sia in vitro che in vivo prima di tradurre questo concetto ad una protesi retinica chimica come discusso in precedenza. Tuttavia, attualmente non c'è nessuna metodologia consolidata per l'effettuazione di stimolazione chimica della retina nella letteratura e i metodi utilizzati in lavori precedenti non sono stati descritti in dettaglio quanto sarebbe essenziale per gli studi replicativi. Pertanto, la spiegazione razionale per questa carta di metodi è quello di fornire un quadro ben definito per lo svolgimento in vitro stimolazione chimica della retina per quei ricercatori interessati a entrambi la replica di nostri precedenti studi27, 28 o avanzando ulteriormente questo concetto nascente di neurostimolazione chimica.
Qui dimostriamo un metodo per lo svolgimento in vitro stimolazione chimica dei neuroni retinici in wholemount retine dei ratti di selvaggio-tipo e un modello di ratto degenerato del fotoricettore che imita molto attentamente la progressione del fotorecettore degenerativa malattie in esseri umani. La spiegazione razionale dietro lo sviluppo di questo metodo di stimolazione in modelli in vitro è quello di valutare le gamme terapeutiche di vari parametri di stimolazione e studiare le caratteristiche di risposta neurale che sarebbero impossibile o difficile da osservare in in vivo modelli, soprattutto durante gli studi iniziali incentrata su valutare la fattibilità di questo approccio. In questa procedura, indichiamo sia singolo sito e simultanee multi-sito stimolazioni chimiche delle retine fornendo piccole quantità di 1 millimetro di glutammato nei pressi di neuroni retinici di destinazione via commercialmente disponibili singola porta vetro Micropipette e una consuetudine dispositivo di silicio microlavorato microfluidici multi-porta, rispettivamente. Mentre stimolazioni sia sito singolo e multi-sito compire l'obiettivo fondamentale di studiare la fattibilità terapeutica di neuromodulazione chimica, ciascuna ha uno scopo distinto con un vantaggio unico. La stimolazione di singolo sito, che può essere realizzata con Micropipette di vetro pre-stirato commercialmente disponibile, può essere usata per iniettare sostanze chimiche direttamente nel sottosuolo della retina in un unico sito e serve a indagare se osservabile RGC spike tasso le risposte che sono simili alle risposte luce visivamente evocate possono essere suscitate focale nel sito di iniezione. D'altra parte, la stimolazione multisita, che richiede un dispositivo microfluidico multiporta appositamente fabbricati, può essere usata per iniettare sostanze chimiche nello spazio a più siti sopra la superficie della retina e serve per indagare quanto bene evocato da glutammato RCG modelli di risposta corrispondono ai modelli iniezione glutammato negli studi di stimolazione del reticolo.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida delineate dalla guida del Consiglio nazionale delle ricerche per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Protocolli di trattamento e l'eutanasia animali erano esaminati e approvati dal istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) dell'Università di Illinois a Chicago.
1. modelli animali
- Ratti di selvaggio-tipo lungo Evans
- Procurarsi un topo lungo Evans Hooded di selvaggio-tipo 24-32 giorno vecchio di entrambi i sessi cresciuto con un ritmo giorno/notte h 12 standard.
- Scuro adattare il ratto collocandolo in una stanza completamente buia per 1 h prima di iniziare l'esperimento.
- Ratti S334ter-3
- Attraversare il albino transgenici omozigoti S334ter-3 rat line (entrambi i sessi), esprimendo due copie del gene mutante rodopsina, con ratto pigmentato selvaggio-tipo lungo Evans per produrre ratti S334ter-3 eterozigoti pigmentati che presentano degenerazione dei fotorecettori simili nella progressione a umano retinite pigmentosa29,30.
- Generano prole eterozigoti con ritmo giorno/notte h 12 standard e utilizzano ratti di entrambi i sessi per esperimenti di Evo seguente corrispondente per le seguenti fasi di degenerazione dei fotorecettori: degenerazione di fase iniziale: 14-20 giorni; Middle degenerazione fase: 21-27 giorni di vita; Degenerazione di fase tardiva: 28-35 giorni di età; Completamente cieco: > 50 giorni di età.
- Scuro adattare il ratto collocandolo in una stanza completamente buia per 1 h prima di iniziare l'esperimento.
2. preparazione della soluzione medio sistema di perfusione e Ames
Figura 1: schema di messa a punto sperimentale. Schema dell'apparato sperimentale per stimolazione chimica usando una micropipetta di vetro (A) e un dispositivo personalizzato microfluidici multiporta (B). La retina è posizionata su un pMEA e continuamente irrorata con soluzione medio Ames fresco ossigenato dalla parte superiore e il fondo attraverso le perforazioni pMEA. Segnali di risposta neurale prelevati dagli elettrodi del pMEA sono alimentati attraverso l'amplificatore MEA in un computer di acquisizione dati. Stimolazione visiva e chimica sono compiute utilizzando un LED verde e un iniettore di pressione di 8 canali, rispettivamente, ed entrambi gli stimoli vengono attivati da un computer dedicato stimolo, che viene anche utilizzato per posizionare la pipetta attraverso una precisione 3-asse micromanipolatore. Un microscopio invertito è usato per osservare la retina durante un esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: messa a punto sperimentale. (A) fotografia del setup sperimentale completa che mostra le posizioni relative di tutti i componenti. Il sistema di amplificatore MEA è posizionato sulla cima di un microscopio invertito, che viene utilizzato per ispezionare visivamente la retina e digitalmente immagine dell'interfaccia di dispositivo-retina mediante la fotocamera ad alta velocità collegata durante l'esperimento. Perfusione superiore e inferiore sono controllati in modo indipendente utilizzando un sistema di regolazione del solenoide di aspersione. Iniezione, controllo di posizione e misure di impedenza sono compiute utilizzando una pressione iniettori, micromanipolatore e amplificatore di patch clamp (box arancione; illustrato più dettagliatamente in B), rispettivamente. La micropipetta o il dispositivo è inserito in una patch clamp headstage per misure di impedenza e montato su un cavalletto (indicato dalla casella verde; illustrato più dettagliatamente in C) per facilitare il posizionamento utilizzando un micromanipolatore. (B) un primo piano degli strumenti di misura e controllo utilizzati nell'esperimento: l'iniettore di pressione di 8 canali, sistema di controllo di micromanipolatore, patch clamp amplificatore per misurazione dell'impedenza e il vaso di aspirazione per l'eliminazione di aspersione. (C) un primo piano del portale del sistema di iniezione mostrando un dispositivo multiporta interfacciato con il supporto per pipette, patch clamp headstage e micromanipolatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: installazione di aspersione. Fotografia (A) della parte superiore dell'amplificatore MEA illustrano la posizione della perfusione superiore e aspirazione così come il LED verde utilizzato per la stimolazione visiva luce. (B) un primo piano della camera di aspersione pMEA illustrando le posizioni precise di perfusione superiore e aspirazione, il pMEA e l'elettrodo di riferimento utilizzato per la misurazione dell'impedenza. (C) una microfotografia della piastra inferiore di aspersione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nota: Vedere Figura 1, Figura 2e Figura 3
- Misurare 900 mL di acqua deionizzata a temperatura ambiente (~ 21 ° C) e inserire nel contenitore da 1L.
- Irrorare l'acqua con 100% CO2 tramite un meccanismo di propagazione.
- Aggiungere 8,8 g del mezzo in polvere Ames all'acqua nel contenitore da 1L.
- Risciacquare il contenitore medio Ames con qualche mL di acqua deionizzata per rimuovere tutte le tracce del mezzo in polvere Ames e aggiungere al contenitore da 1L.
- Aggiungere 25,3 mL di soluzione di bicarbonato di sodio (7,5% w/v31) al contenitore da 1L.
- Aggiungere acqua per portare la soluzione a un volume finale di 1 L.
- Continuare che irrora l'acqua con CO2 per circa 5 min.
- Smettere di CO2 perfusione e iniziare che irrora la soluzione con una miscela di gas medicale di 95% O2 e 5% CO2 per almeno 30 minuti o fino a quando il pH si stabilizza a 7,4.
Nota: Ai fini del presente protocollo, il mezzo di Ames è conservato a temperatura ambiente (~ 21 ° C) in tutto l'esperimento per impedire l'emissione di gas, di CO2 o O2 che possono occludere le linee di perfusione con bolle d'aria. - Pulire i tubi di perfusione superiore ed inferiore di riempimento con etanolo al 70% e poi lavare entrambe le linee 3 volte con acqua deionizzata. Riempire la linea di fondo con acqua deionizzata e la linea superiore con aria.
3. Wholemount retinica preparazione
Figura 4: preparazione di dissezione e wholemount della retina. (A) fotografia di un oculare intatto, prelevato da un animale ha degenerato del fotoricettore. (B) microfotografia della retina con tagli longitudinali per appiattirlo. (C) dopo l'appiattimento della retina, esso viene posizionato su una griglia mesh con il lato del fotoricettore contattando la mesh e appiattito in aria (di fuori medium di perfusione) per accertarsi che non vi è pieghe o bordi arricciati. (D) la maglia e la retina sono rapidamente trasferiti il pMEA con il lato delle cellule del ganglio contattando gli elettrodi e immediatamente irrorati con il mezzo di Ames ossigenato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: perforato matrice multielettrodo. Fotografia (A) della matrice perforata multielettrodo utilizzata nel protocollo. La retina è posto sulla matrice dell'elettrodo (indicata dal rettangolo rosso, che è illustrato più dettagliatamente in B) all'interno della camera di pMEA per permettere la perfusione continua con il mezzo di Ames ossigenato. (B) una microfotografia della matrice elettrodo stessa che illustrano la disposizione delle perforazioni tra gli elettrodi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nota: Vedi Figura 4 e Figura 5
- Utilizzando una torcia LED rosso per fornire illuminazione rossa dim, eutanasia animale tramite anidride carbonica asfissia seguita da dislocazione cervicale o un altro metodo scelto, secondo i protocolli IACUC.
- Entrambi gli occhi usando il forcipe #5 del gioielliere di enucleare e posto occhi enucleated in una capsula di Petri diametro 60 mm con circa 3-4 mL di soluzione medio Ames fresco ossigenato.
- Mentre osservando l'occhio attraverso uno stereomicroscopio di dissezione con illuminatori superiore e inferiore coperto con schermo filtro rosso, praticare una piccola incisione in faccia cornea usando un bisturi o un paio di forbici affilate.
- Tagliare da questa piccola incisione al bordo della cornea poi estendere il taglio in una parte della circonferenza intorno a tutto il bordo della cornea. Rimuovere la cornea ora staccata insieme con la lente, traslucidi umori acquosi e vitrei.
- Tenendo delicatamente l'oculare con un paio di pinze, attentamente fare due piccole incisioni sui lati opposti dell'oculare. Successivamente, è possibile utilizzare due paia di pinze per delicatamente tirare a parte il paraocchi in ciascuna delle incisioni e separare la retina da sclera. Lentamente sollevare l'intera retina dalla sclera e oculare. Tagliare il nervo ottico, se è ancora collegato.
- Effettuare tagli longitudinali nella retina per ottenere la metà o quarto sezioni usando le forbici e poi delicatamente diffuso una sezione retinica su una maglia di nylon (diametro di filettatura 100 µm con 350 µm di apertura) con la rivolta di (lato concavo della retina) di cellule del ganglio dalla mesh.
- Posizionare la maglia e la retina su una matrice multielettrodo perforata (pMEA) con le cellule gangliari a contatto con la superficie pMEA. Poi delicatamente posizionare una griglia di fetta ponderata in cima la mesh per tenere la retina in posizione.
4. MEA e Setup di acquisizione dati
Figura 6: rumorosità di pMEA. (A) registrazione rappresentativa di un sottoinsieme di elettrodi pMEA espositrici elevato rumore persistente. Questo rumore è solitamente dovuto una mancanza di contatto tra le pastiglie di contatto pMEA e gli spinotti dell'amplificatore MEA a seguito di normale usura dello strato sottile perforata polyimide sopra pMEA, soprattutto presso le pastiglie di contatto. L'altra possibile fonte di rumore è in genere soluzione perdita le pastiglie di contatto amplificatore pMEA. Rumore persistente dovuto povero pin contattare e/o trapelate soluzione sul contatto pastiglie di solito possono essere corretto da spostando la posizione della pMEA all'interno dell'amplificatore per ottenere un contatto migliore e pulizia e asciugatura delle pastiglie, rispettivamente. Se il rumore non può essere eliminato di pulizia o spostando la posizione pMEA, il pMEA potrebbe essere necessario essere sostituita completamente. (B) registrazione rappresentativa dei livelli di rumore da un sottoinsieme di pMEA elettrodi da un pMEA pulito con buon contatto tra la pMEA e amplificatore. In genere, il livello di rumore medio è entro ± 16 µV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nota: Vedere la Figura 6
- Dim illuminazione rossa, posizionare pMEA in amplificatore MEA e chiusure di amplificatore.
- Se segni di riferimento non sono già presenti sull'anello camera pMEA, etch due 'X'-contrassegni a forma distanziati di circa 5 mm di distanza in una zona facilmente visibile dall'alto con il microscopio montato stand boom.
- Posizionare la presa superiore perfusione all'interno della camera di pMEA e attivare la valvola superiore aspersione di conseguire un tasso di aspersione di circa 3 mL al minuto. Posizionare la bocca di aspirazione superiore a livello di perfusato desiderata (~ 5 mm di profondità) e accertarsi che funzioni.
- Aprire il software di acquisizione dati del computer di acquisizione di dati e fare clic sul pulsante 'play' per iniziare a ricevere dati. Assicurarsi che tutti i canali di pMEA sono segnali neurali di registrazione e privo di rumore.
- Guardando un'immagine digitale live del microscopio invertito campo visivo su un monitor, osservare la superficie inferiore del pMEA per prove che soluzione fluisce attraverso la piastra di perfusione inferiore.
5. glutammato stimolazione preparazione
Figura 7: vetro micropipetta e dispositivo microfluidico multiporta. (A) un pipetta titolare prima di inserire una micropipetta o dispositivo. L'elettrodo di argento/argento cloruro (50 micron di diametro) è elettricamente accoppiato alla scheda sulla fine di interfaccia con il patch clamp headstage. (B) una fotografia della micropipetta di vetro interfacciato con il pipetta titolare che illustrano la posizione del porto di pressione utilizzato per avviare le iniezioni pneumatiche. (C) un dispositivo personalizzato microfluidici multiporta (1 cm 1 cm cm 0,134) collegato a un dispositivo di stampa 3D personalizzato e interfacciato con il pipetta titolare attraverso un tubo di acciaio inox. Il dispositivo, che è stato fabbricato a due strati, ha otto microporta (diametro 14 µm) nello strato inferiore (340 µm di spessore) e otto serbatoi su chip (diametro 1,6 mm) per la memorizzazione di glutammato nello strato superiore (spessore 1 mm). Indipendentemente ciascuno il otto microporta nello strato inferiore del dispositivo è connesso a un serbatoio su chip nello strato superiore tramite un microchannel in piano, e ciascun serbatoio su chip a sua volta è collegata a una porta di pressione dell'iniettore 8 canali pressione tramite un tubo flessibile per consentire l'attuazione indipendenti di microporta per iniezioni multisite fantasia. (D) un primo piano della periferica multiporta tenuto da pinzette prima di fissare il dispositivo di interfaccia di tubazione mostrando la disposizione delle otto indipendentemente indirizzabile su chip serbatoi e insenature della tubazione. (E) una microfotografia della superficie inferiore del dispositivo mostrando il microporta otto 14 µm-diametro disposti in una configurazione di 3 x 3 con 200 µm spaziatura per allinearsi con gli elettrodi del pMEA. Gli otto fuori microporta sono utilizzati per le iniezioni multisite, mentre la porta centrale è stata usata rigorosamente per allineamento durante la fabbricazione del dispositivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nota: Vedere la Figura 7.
- Preparare soluzione glutammato glutammato stock solutionwith ossigenato Ames soluzione media per ottenere un campione di 0,5 mL ad una concentrazione di lavoro di 1 millimetro di glutammato.
- Inserire con cautela una micropipetta pre-stirato 10 µm di diametro o l'asta in acciaio inox collegato al dispositivo microfluidico multiporta in un supporto di pipetta standard contenente un elettrodo a filo argento/argento cloruro 50 µm di diametro.
Nota: Se il rilevamento impedenza non è disponibile, l'elettrodo filo argento/argento cloruro può essere omesso. - Interfaccia di Dispensare titolare con l'headstage di patch-clamp e collega la connessione luer port di pressione di Dispensare titolare al canale 1 del sistema di iniezione di pressione, se utilizzando una micropipetta di vetro o le connessioni luer porta di pressione di ogni i porti di 8 iniezione con canali 1-8 del sistema di iniezione di pressione, se si utilizza la periferica multiporta.
- Accendere il sistema di iniezione di pressione manualmente e sul canale 1 (o canali 1-8, come applicabile). Assicurarsi che il sistema è ventilato all'atmosfera e impostare la pressione di iniezione a 0,1 psi.
- Accendere il micromanipolatore e calibrarlo premendo il pulsante 'Calibrare' sul controller di manipolatore. Posizionare il micromanipolatore in modo che la punta della micropipetta (o la parte inferiore del dispositivo, come applicabile) è di circa 30 mm sopra l'amplificatore MEA.
- Riempire una piccola capsula di Petri con soluzione di glutammato (1 millimetro di glutammato nel medium di Ames standard) e posizionarlo sotto il micromanipolatore. Abbassare la punta della micropipetta (o il dispositivo) nella soluzione e riempimento premendo il pulsante di 'Riempimento' del sistema di iniezione di pressione (pressione di aspirazione di -13 in H2O) fino a quando non c'è soluzione di circa 20 mm visibile nella micropipetta di vetro o il tubazione di dispositivo multiporta.
- Se si utilizza la periferica multiporta, girare di pressione iniettori spento il canale 1 e ripetere il protocollo per canali 2-8. Sollevare la punta della micropipetta o il dispositivo fuori dalla soluzione, rimuovere la capsula di Petri e posizionare il micromanipolatore sopra la camera pMEA.
- Utilizzando un microscopio stereoscopico boom-stand-montato, allineare la punta della micropipetta o gli angoli del dispositivo con i segni di riferimento incisi sul ring alloggiamento pMEA. Memorizzare le posizioni di manipolatore nel software di controllo utilizzando i pulsanti 'Store riferimento A' e 'Archivio di riferimento B' (o semplicemente notare le coordinate di manipolatore manualmente) per mappare il sistema di coordinate del manipolatore con gli elettrodi pMEA.
- Utilizzando il software di controllo del manipolatore, selezionare un elettrodo pMEA bersaglio con robusta attività spontanea e fare clic sul pulsante 'Move al canale' per allineare il vetro micropipettewith l'elettrodo bersaglio.
6. interfaccia con Retina
- Se la misurazione dell'impedenza è disponibile, attivare patch clamp amplificatore e avviare il software di visualizzazione di impedenza facendo clic sul pulsante 'Start' per visualizzare l'impedenza dell'elettrodo argento/argento cloruro all'interno del supporto di pipetta. Osservando i segnali in tempo reale impedenza, abbassare lentamente la micropipetta o il dispositivo fino a quando non si mette in contatto la superficie retinica come indicato da un rapido aumento nell'impedenza del segnale (Vedi Figura 8). Salvare o prendere nota della posizione della superficie retinica.
- Se la misurazione dell'impedenza non è disponibile, rilevare il contatto con la superficie retinica attraverso osservazione visiva, anche se questo sarà meno preciso. Abbassare la pipetta o il dispositivo fino a quando si mette in contatto visibilmente la superficie superiore della soluzione media Ames nella camera di MEA.
- Quindi, osservando la parte superiore della retina con un microscopio invertito, abbassare lentamente la pipetta o il dispositivo fino a quando la superficie superiore della retina è visibilmente distorta, che indica che il contatto è stato effettuato con la superficie della retina. Salvare o prendere nota della posizione della superficie retinica.
- Per la stimolazione del sottosuolo, abbassare la pipetta un ulteriore 40 µm (per retine di S334ter-3) o 70 µm (per retine di selvaggio-tipo).
- Eseguire alcune iniezioni di breve durata (10-30 ms) utilizzando il sistema di iniezione (0.1 psi) di pressione per determinare se le cellule vicino alla punta della micropipetta o dispositivo microporta è ricettivi alla stimolazione di glutammato osservando i segnali neurali con acquisizione dati software.
Nota: Successo iniezioni di suscitare un'inibizione burst o spike spike chiaramente visibile di tasso (Vedi Figura 9). Se nessuna risposta è osservata, riposizionare la micropipetta o il dispositivo ad un altro elettrodo.
Figura 8: misurazione dell'impedenza. (A) un disegno schematico della tecnica di misura di impedenza. Utilizzando l'amplificatore di patch clamp, l'impedenza della micropipetta è continuamente monitorata come si è abbassato lentamente verso la superficie della retina. Quando la micropipetta è sopra la retina, la relativamente alta conducibilità ionica del mezzo Ames si traduce in una lettura di bassa impedenza. Come la micropipetta rende il contatto con la superficie della retina, la conducibilità ionica attraverso il filo di argento/argento cloruro è ridotta, causando un rapido aumento di impedenza misurata. (B) una trama visualizzare la variazione di impedenza registrato appena prima e dopo il contatto della punta della pipetta con superficie retinica. L'impedenza misurata è relativamente bassa, quando la punta della micropipetta è in soluzione appena prima del contatto (indicata dalla regione arancia a sinistra). Una volta che avviene il contatto (indicato dalla freccia rossa e la verde regione sulla destra), l'impedenza aumenta rapidamente a causa della ridotta conducibilità ionica al contatto con il tessuto retinico. In pratica, la superficie retinica è registrata come l'altezza corrispondente alla comparsa dell'aumento vertiginoso dell'impedenza misurata (la posizione della punta della freccia rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: elettrodo registrazioni dell'attività neurale durante visual, spontanea e le registrazioni di iniezione di glutammato. (A) registrazioni rappresentative da nove elettrodi pMEA mostrando il passa-alto filtrati dati elettrodo durante stimolazione visiva luce con un LED verde dove ogni rettangolo Mostra i dati neurali da un unico elettrodo. Ogni registrazione di elettrodo illustra i dati raccolti nel primo secondo dopo l'accensione il LED verde (temporizzazione indicato con le frecce arancione in ogni trama) con una scala di tensione comune mostrata nella sinistra y. Picchi sono stati identificati usando una tensione di soglia di-18 µV (linea rossa orizzontale in ogni trama di elettrodo) e sono rappresentati dalle tracce nere sopra i dati elettrodo verde. Stimolazione visiva ha causato uno scoppio di picchi (eccitazione) in tutti gli elettrodi tranne uno, che ha posseduto una risposta inibitoria alla luce alto al centro. (B) una trama simile per gli stessi elettrodi risultati attività neurale spontanea senza stimolazione visiva o iniezione. Anche se più piccoli scoppi erano presenti, i modelli di punte erano molto diversi da quelli registrati in risposta alla stimolazione visiva. (C) rappresentante registrato dallo stesso subset di elettrodi immediatamente dopo un'iniezione di glutammato all'elettrodo centrale (tempistica indicata da frecce arancione in ogni trama). Il glutammato iniettato ha suscitato una raffica di picchi nell'elettrodo centrale che era molto simile ai bursts visivamente evocato spike. Tutti gli altri elettrodi sono stati influenzati tramite l'iniezione di glutammato, che dimostra la risoluzione spaziale fine della tecnica di stimolazione chimica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
7. avviare la registrazione della retina e programma di stimolo
- Orientare il LED verde verso la superficie superiore della retina. Iniziare la registrazione utilizzando il software di acquisizione di dati sul computer dedicato registrazione digitando il nome del file e fare clic sul pulsante "record".
- Una volta iniziata la registrazione, aprire il programma di controllo dello stimolo e caricare il file di stimolo predefinita facendo clic sul pulsante "Leggi stimolo File". Fare clic sul pulsante "File di esecuzione stimolo" per avviare il file di stimolo predefinito costituito il protocollo di acquisizione dati e stimoli descritto nella nota seguente.
Nota: (i) 30 prove di 2 s ON e 2 s OFF pieno campo flash (5 lm/m2 intensità) usando il LED verde. (ii) 120 s di dati senza utilizzare il LED verde per registrare l'attività spontanea della retina sopra una scala cronologica simile. (iii) 1 o più insiemi di iniezioni di glutammato che consiste di 30 studi di iniezioni di glutammato a 0,1 psi con iniezione di ms 10-30 volte (circa 100-300 pL per iniezione) e 3 s interpulse durate. Nel caso di iniezioni di multi-sito, selezionare 2 o più porte per iniettare contemporaneamente.
Figura 10: Peristimulus istogrammi di visual, spontanea e le risposte del glutammato. (A) peristimulus rappresentante istogrammi (30 ms binwidth) dei dati spike dal sottoinsieme degli elettrodi in Figura 9A, media attraverso 20 prove di stimolazione visiva luce. Una scala comune del tasso spike è stata applicata a tutti gli elettrodi e viene mostrata sulla sinistra y. La linea nera in ogni trama di elettrodo rappresenta il tasso medio di spike per tutti i picchi registrati durante il primo secondo dopo l'accensione il LED verde. Come si può vedere, stimolazione visiva ha causato una risposta di frequenza transitoria spike eccitatorio presso tutti gli elettrodi tranne l'elettrodo in alto al centro, che ha avuto una risposta inibitoria transitoria alla luce. (B) le risposte di tasso medio picco spontaneo registrato presso gli stessi elettrodi senza alcuna stimolazione visiva o chimici. Senza stimolazione, i tassi di picco per ciascun elettrodo sono relativamente costanti. (C) le risposte di tasso medio picco registrato presso gli stessi elettrodi in risposta a un'iniezione di glutammato a una posizione sopra l'elettrodo centrale. La risposta ai transienti solo evidente è la risposta eccitatoria all'elettrodo direttamente sotto il sito di iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Risultati
Questo protocollo può essere utilizzato per stimolare chimicamente retine normali, selvaggio-tipo così come il fotorecettore degenerato retine, nonostante il notevole rimodellamento cellulare causata dalla perdita dei fotorecettori. Prima di iniziare gli esperimenti con entrambi del fotoricettore degenerato o retine di selvaggio-tipo, la necessità di attrezzature (Figura 1 e Figura 2) registrazione e stimolazione di essere prepar...
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Discussione
Il metodo presentato qui di seguito viene illustrato un paradigma di stimolazione neurale unico, in cui i neuroni retinici sono chimicamente stimolati iniettando sostanze chimiche nativo neurotrasmettitore nel sottosuolo della retina in vitro. Questa tecnica di stimolazione chimica offre diversi vantaggi rispetto la tecnica di stimolazione elettrica convenzionale, tra cui selettività e focale elevata specificità dei neuroni bersaglio. Il protocollo sopra dettagli come piccole iniezioni pneumatiche volume del neu...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Il lavoro presentato nel libro è stato sostenuto dalla National Science Foundation, frontiere emergenti nella ricerca e innovazione (NSF-EFRI) programma concede numero 0938072. Il contenuto di questa carta è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NSF. Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Samsoon Inayat per il suo lavoro di progettazione e collaudo il setup sperimentale iniziale per stimolazione chimica e Mr. Ashwin Raghunathan per il suo lavoro di progettazione, fabbricazione e valutazione del dispositivo microfluidico multiporta utilizzato in Questo studio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Array di microelettrodi, layout perforato | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| Amplificatore MEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Piastra di messa a terra per perfusione inferiore pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| Micromanipolatore motorizzato a 3 assi | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Sistema di controllo del micromanipolatore | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry supporto per micromanipolatore con slitta lineare | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| iniettore di pressione multicanale programmabile a 8 canali | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Fornitore: Harvard Apparatus UK | PM-8000 o PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Fornitore: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A è stato sostituito con un modello più recente Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Kit per rifiuti sottovuoto | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | |
| http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ Porta pipetta | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-tirato 10 μ micropipette in vetro con diametro punta m World | Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscopio | Nikon, Tokyo, Giappone | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Supporto per microscopio con doppia sfera lineare | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereomicroscopio con supporto LED ibrido C-LEDS | Nikon, Tokyo, Giappone | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Sistema di microscopio invertito | Nikon, Tokyo, Giappone | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| Acido L-glutammico (glutammato) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| Piastra di Petri da 60 mm (altezza 10 mm) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | Piastra di Petri trasparente da 60 mm; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Lama per bisturi standard #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Manico per bisturi #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Forbici da dissezione | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 Kit rete | in nylon https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 | |
| Griglia per fette per arpa ALA | Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | Pellet |
| elettrodi di riferimento http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ Ag/AgCl | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| Sistema di perfusione a gravità controllata da valvola a 4 canali | ALA Strumenti scientifici, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS fotocamera per microscopio | Andor Technology, Belfast, Regno Unito | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| filo d'argento (50 μ Tubo | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon (diametro 1,6 mm) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Portautensili inclinabile con cannula | in acciaioALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | Uno di questi è stato utilizzato per la perfusione e l'aspirazione superiori; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Foglio filtrante rosso chiaro | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Produttore: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Venditore: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Torcia Rossa | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Produttore: https://www.smith-wesson.com/ Fornitore: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | |
| http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Giappone | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
Riferimenti
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