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Articolo metodologico

Che istituisce un modello murino di una neuropatia pura piccola fibra con l'agonista Ultrapotent di Transient Receptor potenziali vanilloidi tipo 1

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⸱

DOI:

10.3791/56651

⸱

13 febbraio 2018

 ,  , 
1Department of Anatomy, School of Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, 2Department of Medical Research, Kaohsiung Medical University Hospital, 3Department of Medical Research, Ultrastructural Laboratory, Kaohsiung Medical University Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo studio stabilisce un modello sperimentale di neuropatia pura piccola fibra con resiniferatossina (RTX). Una dose unica di RTX (50 µ g/kg) è ottimale per lo sviluppo di un modello di neuropatia di piccole fibre che imita le caratteristiche dei pazienti e potrebbe aiutare a studiare il significato molecolare nocicettivo sottostante il dolore neuropatico.

Abstract

I pazienti con diabete mellito (DM) o quelli che avvertono gli effetti neurotossici di agenti chemioterapeutici possono sviluppare disturbi della sensazione a causa di degenerazione e lesioni dei neuroni sensoriali di piccolo diametro, indicato come neuropatia delle piccole fibre. Presenti modelli animali della neuropatia delle piccole fibre influenzano entrambi fibre sensoriali di diametro grande e piccolo e così creano un neuropathology troppo complessa per valutare adeguatamente gli effetti dell'infortunato fibre sensoriali di piccolo diametro. Pertanto, è necessario sviluppare un modello sperimentale di neuropatia pura piccola fibra di esaminare adeguatamente questi problemi. Questo protocollo descrive un modello sperimentale di neuropatia delle piccole fibre in particolare che interessa i nervi sensoriali di piccolo diametro con resiniferatossina (RTX), un ultrapotent agonista del recettore transitoria potenziali vanilloidi tipo 1 (TRPV1), attraverso una singola dose di iniezione intraperitoneale, indicato come neuropatia RTX. Questa neuropatia RTX ha mostrato manifestazioni patologiche e le anomalie del comportamento che imitano le caratteristiche cliniche dei pazienti con neuropatia delle piccole fibre, tra cui la degenerazione di intraepidermal fibre nervose (IENF), in particolare lesioni in neuroni di piccolo diametro e l'induzione di hypoalgesia termica e allodinia meccanica. Questo protocollo testato tre dosi di RTX (200, 50 e 10 µ g/kg, rispettivamente) e ha concluso che una dose critica di RTX (50 µ g/kg) è necessaria per lo sviluppo delle manifestazioni di neuropatia tipica piccola fibra e preparato una procedura di immunostaining modificate per indagare IENF degenerazione e lesioni di soma neuronale. La procedura modificata è veloce, sistematica ed economica. Valutazione comportamentale del dolore neuropatico è fondamentale per rivelare la funzione dei nervi sensitivi di piccolo diametro. La valutazione delle soglie meccaniche nei roditori sperimentali è particolarmente impegnativa e questo protocollo descrive una rete metallica su misura che è adatta per questo tipo di valutazione nei roditori. In sintesi, la neuropatia RTX è un nuovo e facilmente stabilito modello sperimentale per valutare il significato molecolare e intervento sottostante dolore neuropatico per lo sviluppo di agenti terapeutici.

Introduzione

Neuropatia delle piccole fibre che coinvolge il dolore neuropatico, che è evidente dalla degenerazione di IENFs, è comune a vari tipi di condizioni, quali DM e come conseguenza degli effetti neurotossici di agenti chemioterapeutici1,2, 3,4,5. IENFs sono i terminali periferici di piccolo diametro neuroni situati nei gangli di radice dorsale (DRG) e sono interessati in parallelo nei casi di degenerazione di IENF6. Ad esempio, la trascrizione genetica a Monte alterata di somata neuronali ha dimostrata il upregulation di attivazione trascrizione factor-3 (ATF3)6,7. Inoltre, la valutazione dell'innervazione IENFs con la biopsia della pelle è utile per la diagnosi di piccole fibre neuropatia5,8,9. Tradizionalmente, i profili di IENFs sulla biopsia della pelle hanno dipendeva dimostrazione immunohistochemical del prodotto del gene della proteina di 9,5 (PGP 9.5)1,10,11. Presi insieme, i profili patologici dei DRG e IENFs riflettono la neuropatia delle piccole fibre sottostante condizione funzionale e possono essere un indicatore per le conseguenze funzionali di questo tipo di neuropatia sui neuroni di piccolo diametro.

In precedenza, diversi modelli sperimentali hanno affrontato la questione della degenerazione IENF nei casi della neuropatia indotta da chemioterapia12,13 e nervo ferita causata da compressione o transection14,15 , 16. questi modelli sperimentali anche colpiti i nervi di grande diametro; era, quindi, non è possibile escludere il contributo dei nervi interessati di grande diametro nella neuropatia osservati piccola fibra; per esempio, l'esame di thermosensation disordine da ritiro nociva dipende dalle fibre nervose motorie funzionali17,18,19. Così, che stabilisce un modello di pura fibra piccola neuropatia e indagare sistematicamente lo stato patologico di somata neuronali e loro fibre nervose periferiche cutanee nei neuroni di piccolo diametro sono necessarie e imperativo.

RTX è un analogo di capsaicina e un potente agonista al recettore transitoria potenziali vanilloidi recettore 1 (TRPV1), che media elaborazione nocicettivo20,21,22. Recentemente, periferico RTX trattamento alleviato dolore neurogeno23,24,25 e un'iniezione intragangliari di RTX indotto irreversibile perdita di neuroni DRG22. L'effetto della somministrazione periferica di RTX è dose-dipendente20,26,27, che ha provocato la desensibilizzazione transitoria o degenerazione di IENFs. Intrigante, sistematico della alto-dose RTX trattamento ha condotto a dolore neuropatico28, un sintomo della neuropatia delle piccole fibre. Questi risultati suggeriscono che la modalità di trattamento e la dose di RTX produrre effetti patologici distinti e risposte neuronali; vale a dire, somministrazione periferica impedita la trasmissione del dolore da effetti locali29 e colpite il somata neuronale che sviluppato neuropatico comportamento6. Collettivamente, questi risultati indicano che RTX ha un effetto di multipotenza e sollevato la questione se esista una dose specifica di RTX che potrebbero influenzare sistematicamente i nervi periferici, come il IENFs periferico e centrale somata neuronali. Se è così, RTX potrebbe essere un potenziale agente specificamente influenzano i neuroni di piccolo diametro e imitano neuropatia delle piccole fibre nella clinica. Ad esempio, DM nella clinica è una questione complessa compreso disordine metabolico e neuropatologia dei nervi periferici, che sono le principali caratteristiche della neuropatia delle piccole fibre. I meccanismi della neuropatia associata DM piccola fibra non ha potevano escludere il contributo del disordine metabolico che potrebbe non essere l'agente principale che interessa i nervi periferici. Di conseguenza, neuropatia associata DM piccola fibra richiede un modello animale puro che potrebbe escludere gli effetti di sistematico disordine metabolico. Questo protocollo descrive la dose di lavoro di RTX per sviluppare un modello di neuropatia tipica piccola fibra, compreso IENF degenerazione e lesioni del neurone di piccolo diametro, come dimostrato dall'analisi di immunostaining modificate.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte sono in conformità con le linee guida etiche per laboratorio animali30, e il protocollo è stato approvato dalla animale Comitato di Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan.

1. istituzione di RTX neuropatia

Attenzione: RTX è neurotossico e pericolose. In contatto, agisce come un irritante per occhi, mucose e delle vie respiratorie superiori. Evitare l'inalazione e indossare occhiali da vista lab e cappotti durante la preparazione di RTX. Sciacquare abbondantemente con acqua in caso di contatto con la pelle o dopo la manipolazione.

  1. Aggiungere 1 mg di polvere di RTX a un 200 µ l di miscela di volume uguale di Tween 80 ed etanolo assoluto (100 µ l per ogni solvente).
  2. Aliquota della soluzione RTX (12 µ l/flaconcino) e conservare a-20 ° C, fino a 3 mesi. Questo costituisce il brodo RTX; scartare la soluzione RTX rimanente alla scadenza.
  3. Diluire lo stock RTX con salino normale ad un volume finale di 600 µ l. La concentrazione finale della soluzione RTX dovrebbe essere 0.01%, che equivale a 1 µ g RTX in 10 µ l di soluzione di veicolo.
  4. Utilizzare topi ICR maschio adulto di 8-settimana-vecchio (35-40 g) come animali da esperimento e somministrare una singola dose di soluzione RTX (dose: 200, 50 e 10 µ g/kg, rispettivamente) per via intraperitoneale (i.p.) con una siringa di microiniezione per i topi. Topi è stato anestetizzato di inalatore con isoflurano 5% per l'anestesia profonda. Se i topi hanno mostrato azione di ritiro delle estremità durante l'iniezione di RTX, topi dovrebbero prendere più tempo inalazione dell'anestesia.
    Esempio: Se il mouse pesa 40 g, quindi riceverà 20 µ l della soluzione RTX, che rappresenta la dose di 50 µ g/kg.
  5. Dare un volume uguale di veicolo (10% Tween 80 e 10% di etanolo assoluto in soluzione salina), un gruppo di topi come controllo.
  6. Dopo l'iniezione di RTX, restituire i topi di una gabbia di plastica su un 12-h luce/12-h scuro ciclo e forniscono cibo e acqua ad libitum.

2. valutazione del comportamento neuropatico

Nota: Mantenere gli animali in un ambiente confortevole (passo 1.6) per permettere il recupero dopo l'iniezione. Al 7 ° giorno post RTX ad iniezione (D7), ogni animale esegue i test di filamento di capelli piastra calda e von Frey il giorno stesso per ridurre i pregiudizi del tempo e promuovere l'efficienza dei test comportamentali. Portare gli animali in una camera tranquilla che è mantenuta ad una temperatura (27 ° C) e umidità stabile (40%) per ottimizzare acclimatazione degli animali e ridurre gli effetti ambientali durante i test comportamentali. Non disturbare gli animali durante i periodi di prova; i test comportamentali sono previsti settimanalmente.

  1. Misurazione delle latenze termiche con il test della piastra calda
    1. Metti l'animale delicatamente su un piatto di metallo caldo (27 cm × 29 cm) con una gabbia di Plexiglas trasparente (lunghezza × larghezza × altezza: 22 cm × 22 cm × 25 cm; Figura 1A). Impostare la temperatura della piastra riscaldante in metallo a 52 ° C.
    2. Iniziare a misurare la durata della latenza termica dell'animale sulla piastra calda con il timer passo-on, built-in della piastra riscaldante una volta si dell'animale toccare la piastra calda e osservano le risposte del si dell'animale. Se l'animale Mostra agitazione, leccare di si, o saltando mentre sulla piastra calda, rimuoverlo e registrare la durata che l'animale è rimasto sulla piastra calda. Questa durata di tempo definisce la latenza termica di un singolo animale. Registrare la latenza termica la più vicina 0.1 s.
    3. Per ogni sessione di test, è necessario eseguire tre prove con intervalli di 30 min per la normalizzazione di risposta dopo l'ultima prova della piastra calda. Se l'animale non è nessuna risposta sulla piastra calda, interrompere la sessione dopo 25 s per evitare potenziali danni ai tessuti.
  2. Test di misurazione della soglia meccanica con il filamento di capelli di von Frey
    1. Mettere l'animale sulla maglia metallica su misura (dimensioni delle maglie: 5 × 5 mm) con una gabbia di Plexiglas semi-trasparente cilindro (diametro: 13 cm; altezza: 12 cm) (Figura 1B) per acclimatazione per almeno 2 h.
    2. Applicare i diversi calibri dei filamenti di capelli di von Frey alla regione plantare del hindpaw con il metodo altalenante31. Avviare applicazione iniziale dalla forza centrale di un insieme di filamenti di von Frey capelli per una durata di applicazione di filamento di 5-8 s.
    3. Utilizzare un intervallo di 2 minuti tra le applicazioni del filamento per ottimizzare la normalizzazione degli animali. Cambiare la forza applicata filamento basata sulla risposta ultima dell'animale.
      Nota: Un insieme di filamenti di capelli di von Frey costituito 0,064, 0,085, 0,145, 0,32, 0,39, 1.1 e 1,7 g forza applicazione. Ad esempio, se si è verificato hindpaw ritiro con una forza iniziale di 0,32 g, quindi applicare 0,145 g. In assenza di ritiro della zampa, quindi viene applicata una forza di 0,39 g. Ulteriori quattro filamenti delle diverse forze vengono applicate in base alle risposte precedenti, quindi il limite meccanico è calcolato secondo una formula pubblicato31.
    4. Per ogni sessione di test, sono la bilaterale si. Eseguire tre prove per ogni hindpaw. Esprimere la media di queste sei soglie meccaniche come la soglia meccanica media (mg) di ogni animale.

figure-protocol-1
Figura 1. Su misura gabbia di Plexiglas e metallo mesh per la valutazione del dolore neuropatico nel modello del topo di resiniferatossina (RTX)-indotto neuropatia delle piccole fibre. (A, B) Questi grafici mostrano l'attrezzatura utilizzata per misurare (A) le latenze termiche da una piastra in metallo (27 cm × 29 cm) con una gabbia di Plexiglas trasparente (lunghezza × larghezza × altezza: 22 cm × 22 cm × 25 cm) e valutazione (B) la soglia meccanica di una meta su misura maglia l (maglia taglia: 5 × 5 mm) con una gabbia di Plexiglas semi-trasparente cilindro (diametro: 13 cm; altezza: 12 cm) nei topi con la neuropatia indotta da RTX piccola fibra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. pelle biopsia preparazione e valutazione di innervazione IENFs

  1. Dopo comportamento test, anestetizzare gli animali con 5% isoflurane e sacrificare animali, mediante perfusione intracardiaca con tampone fosfato 0,1 M (PB) (pH 7.4), seguiti da paraformaldeide al 4% (4P) in PB 0,1 M.
  2. Tagliare il primo footpads dei due si dopo perfusione e post-loro fissarsi in 4P per h. 6 un altro trasferimento del tessuto grassatore a PB 0,1 M a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.
  3. Cryoprotect footpads con 30% di saccarosio in PB durante la notte e taglio in verticale alla superficie plantare maniera in fette dello spessore di 30 µm. Etichetta il grassatore sezioni in sequenza e quindi memorizzare in antigelo a-20 ° C.
    Nota: La composizione di antigelo è come segue: acqua distillata, glicerolo di etilene, glicerolo e 2 x PB in un rapporto di 3:3:3:1.
  4. Per garantire un prelievo corretto, selezionare ogni terza sezione del grassatore.
    1. Mettere le sezioni selezionate grassatore sulle lastre di vetro rivestito e li asciugare all'aria.
    2. Coprire una piastra di copertura in plastica sulla diapositiva e processo con procedure standard che immunostaining.
      1. Placare le sezioni grassatore con 1% H2O2 in metanolo per 30 min e bloccare con latte in polvere senza grassi 0,5% e 0,1% Triton X-100 nel buffer 0.5 M Tris (Tris) per 1 h.
      2. Incubare per sezioni grassatore con antisieri contro pan axonal marcatore, PGP 9.5 (alzato dentro coniglio; 1:1, 000), una notte a 4 ° C.
      3. Incubare le sezioni grassatore con un anticorpo biotinilato capra anti-coniglio IgG secondario a temperatura ambiente (TA) per 1 h e poi incubare con il complesso avidina-biotina al RT per 45 min.
      4. Visualizzare il prodotto di reazione con 0,05% 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) soluzione per 45 s. Poi lavare sezioni grassatore con acqua distillata e asciugare li per il montaggio.
        Nota: Gli antisieri primari e secondari sono diluiti con latte in polvere senza grassi 0,5% a 0,5 M Tris.

4. DRG sezione preparazione e valutazione dei feriti neuroni di piccolo diametro

  1. Sezionare il 4th e 5th lombare DRG e post-fix per un altro 2 h.
  2. Tessuti Cryoprotect DRG con 30% di saccarosio in PB durante la notte e tagliare a un 8-µm di spessore in sequenza, posizionare su vetrini da microscopio e l'etichetta. Memorizzare sezioni DRG in un congelatore a-80 ° C.
  3. Sezioni di Immunostain DRG in 80 µm-intervalli per garantire un prelievo corretto.
    1. Eseguire procedure di immunostaining DRG come quelli delle sezioni grassatore, fatta eccezione per le procedure di immunofluorescenza doppia marcatura. In alternativa, includere ATF3 (alzato dentro coniglio; 1: 100), un indicatore di pregiudizio e desmina (alzato dentro mouse; 1: 800), un marker neuronale di piccolo diametro in antisieri primari.
    2. Incubare le sezioni DRG con la miscela di antisieri primari durante la notte a 4 ° C.
  4. Incubare le sezioni DRG con entrambi Texas rosso o fluoresceina isotiocianato (FITC)-coniugato secondari antisieri (1: 200), corrispondente a antisieri primari appropriati al RT per 1 h e poi montare per quantificazione.

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Risultati

Questo protocollo descrive un modello di topo romanzo della neuropatia RTX, che colpisce in particolare i neuroni di piccolo diametro, compreso degenerazione IENF, associata a disturbi sensoriali (Figura 2). Seguendo il protocollo descritto nel presente documento, gli animali hanno esibito hypoalgesia termica e allodinia meccanica presso D7 post iniezione RTX. Per stabilire questo modello di neuropatia di piccole fibre, tre dosi di RTX: 200, 50 e 10 µ g/kg so...

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Discussione

Terapia efficace della neuropatia delle piccole fibre nella clinica è necessaria per promuovere il recupero funzionale e la qualità della vita dei pazienti. Attualmente, c'è mancanza di una guida terapeutica targeting sensoriale disordine connesso con neuropatia delle piccole fibre dovuta alla mancanza di comprensione dei meccanismi molecolari alla base di lesione di un neurone di piccolo diametro. Modelli precedenti di neuropatia solitamente colpiti entrambi i nervi sensoriali di grande e piccolo-diametro; per esempio, ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero della scienza e tecnologia (106-2320-B-037-024), Università medica di Kaohsiung (KMU-M106028, KMU-S105034) e obiettivo per il Top Università Grant (TP105PR15), Università medica di Kaohsiung, Taiwan.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente chimico
ResiniferatoxinSigmaR8756
Tween 80SigmaP1754
3,3'-diaminobenzidinaSigmaD8001
complesso avidina-biotinaVettorePK-6100
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Primary Antisera
PeripherinChemiconMAB-1527
ATF3Santa CruzSC-188
PGP9.5UltraCloneRA95101
< strong>NameAziendaNumero di catalogoComments
Secondary Antisieri
Biotinylated goat anti-rabbitIgG VectorBA-1000
Texas Red-conjugated goat anti-mouseJackson ImmunoResearch115-075-146
Asino coniugato con isotiocianato (FITC) anti-coniglio JacksonImmunoResearch711-095-152
NomeCompanyNumero di catalogoComments
Equipment
Hot plateIITCModello 39
von Frey filamentoSomedic Sales AB10-600-0001
NomeAziendaCatalog NumberComments
>Material
Shandon coverplateThermo 72110017
scientifico PortavetriniThermo scientific73310017

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Che istituisce un modello murino di una neuropatia pura piccola fibra con l'agonista Ultrapotent di Transient Receptor potenziali vanilloidi tipo 1
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