Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Sommario

Il microambiente tumorale acide gioca ruoli critici nella progressione del tumore. Per valutare gli effetti del pH extracellulare acido sul cancro cellule in vitro, abbiamo istituito sistemi di semplice cultura acida.

Abstract

Condizioni del microambiente tumorale, quali ipossia o nutriente inedia, giocano un ruolo critico nella progressione del cancro e malignità. Tuttavia, il ruolo di pH acido extracellulare in aggressività del tumore e del suo meccanismo sottostante non è stato ampiamente studiato rispetto alle condizioni ipossiche o nutriente inedia. Inoltre, un metodo di cultura ben definita per imitare il microambiente tumorale extracellulare acido completamente non è stato segnalato.

Qui presentiamo un metodo di coltura semplice in vitro per mantenere acida pH extracellulare utilizzando ridotto bicarbonato e aumento del lattato o HCl concentrazioni nel terreno di coltura. Il pH medio era sostenuto per almeno 24 h e gradualmente diminuito da 72 h dopo coltura di cellule di cancro del pancreas PANC-1 e AsPC-1. Tre condizioni distinte media acide in questo studio altamente sovraregolati geni pH-sensible a reagire come MSMO1, INSIG1e IDI1 rispetto ad ipossia o nutriente inedia. Il upregulation di questi geni può essere utilizzato come un indicatore di pH acido. Queste semplici tecniche sono benefiche per delucidare i meccanismi di fondo di malignità del tumore sotto microambiente tumorale acide. Di conseguenza, il nostro sistema di cultura acida pH extracellulare consente l'individuazione di risposte cellulari pH acido non solo nelle cellule tumorali, ma anche nelle cellule primarie, come le cellule tubolari renali, nei confronti di altri acidi disordini compreso, chetoacidosi diabetica, acidosi lattica, acidosi tubulare renale e acidosi respiratoria.

Introduzione

Il microambiente tumorale svolge un ruolo critico nella progressione del tumore e cancro cellula metabolismo^1,2,3. Le cellule tumorali sono spesso esposti a condizioni quali ipossia, privazione nutriente e acida pH extracellulare (pHe). Tuttavia, il ruolo di pHe in progressione del tumore non è stato chiarito come ampiamente come ipossia o nutriente inedia. Il pHe nel tessuto del tumore può diventare acido, raggiungendo circa pH 6,8^4,5. Il pH acido nasce dall'aerobica ed anaerobica glicolitica escrezione di protoni (H⁺) e lattato di proliferazione del cancro cellule^5,6.

Studi recenti hanno rivelato che acida indotta da pHe istone deacetilazione, ossidazione degli acidi grassi ed esocitosi dei lisosomi acidi per adattamento al severo ambiente acido^7,8,9,10. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali l'acidificazione extracellulare influenza cancro comportamento e l'identità della chiave regolatori nel microambiente tumorale pH acido completamente non sono stati determinati. Inoltre, parecchi rapporti descritti vari media di pH acido, utilizzando poco chiare concentrazioni di bicarbonato, Tris, tubi e HEPES buffer o lattato e HCl, ma ci sono pochi rapporti per dimostrare la stabilità del rettificata media né completa confronto di diversi distinti acide cultura media^7,8,9,10

Per delucidare i regolatori chiave ed i cambiamenti metabolici in cellule tumorali nel contesto dell'acidificazione extracellulare, abbiamo stabilito un modello semplice in vitro della coltura per mantenere un pHe acide ed ha esaminato il ruolo di pHe in cancro cellule¹¹. Utilizzando questo metodo, abbiamo mantenuto un terreno di coltura acida con un pHe di 6.8 a 37 ° C inferiore al 5% CO₂, usando le concentrazioni ridotte di bicarbonato nel terreno di coltura. pH 7.4 è stato utilizzato come normale e medio di controllo. Il pH medio era sostenuto per almeno 24 h e gradualmente diminuito di 72 h durante la coltura di cellule di cancro del pancreas PANC-1 e AsPC-1. Perché avanzata glicolisi accelera l'escrezione di non solo protoni, ma anche del lattato^7,8,9, abbiamo anche stabilito un metodo di coltura che imita acidosi indotta da lattato di aggiunta del lattato, invece di ridurre il concentrazione di bicarbonato. Inoltre, indotta da HCl acido pHe nel medio permette di escludere la possibilità che risposte cellulari a pH acido di coltura non sono dovuti a una ridotta concentrazione di bicarbonato. Inoltre, utilizzando vari mezzi di comunicazione con un pH di 6.4 a 7.4 con concentrazione di bicarbonato differenti, possiamo valutare l'entità degli effetti di pHe su risposte cellulari.

Protocollo

1. preparazione del terreno di coltura acida

1. Preparazione del controllo (pH 7,4) e terreno di coltura di basso pH (pH 6,8)
   1. Sciogliere 4,75 g di polvere DMEM senza L-Glutammina in 500 mL di acqua.
   2. Preparare 0,33 M NaHCO₃ soluzione in una bottiglia a tenuta di pressione.
      Attenzione: È importante utilizzare una bottiglia di tenuta pressione poiché NaHCO₃ emette CO₂ gas quando riscaldato e decomposizione termica.
   3. Autoclave il mezzo e soluzione. Consentire i buffer raffreddare a 25 ° C.
   4. Aggiungere 5 mL di 200 mM L-Glutammina, 5 mL di penicillina-streptomicina e 50 mL di siero fetale bovino a 500 mL di DMEM senza bicarbonato.
   5. Per mezzo di controllo (pH 7.4), aggiungere 2,4 mL di soluzione di 0,33 M NaHCO₃ per 100 mL di DMEM senza bicarbonato. Per mezzo di basso pH (pH 6,8), aggiungere 0,6 mL di soluzione di 0,33 M NaHCO₃ per 100 mL di DMEM senza bicarbonato.
   6. Controllare il pH medio dopo 24 h di incubazione a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂.
      Nota: La quantità di soluzione di NaHCO₃ deve essere regolato a seconda del pH medio, che possa differire a seconda del contenuto di CO₂ del incubatrice e pressione dell'aria. Idealmente, per la prima volta, è meglio misurare il pH medio con varie concentrazioni di bicarbonato per determinare la quantità appropriata di NaHCO₃ soluzione per aggiungere a DMEM.
      1. Raccogliere il terreno di coltura immediatamente dopo aver tolto la piastra di coltura dell'incubatrice di CO₂ e misurare il pH utilizzando un pH-metro. Mantenere la temperatura media a 37 ° C con un bagno d'acqua se necessario. Misurare il pH medio tre volte in modo indipendente.
         Nota: NaHCO₃ soluzione deve essere conservata a 4 ° C e ogni mass media deve essere preparata. Prodotti disponibili in commercio che possono essere utilizzati in questo studio sono elencati in Tabella materiali.
2. Preparazione terreno di coltura acida indotta da lattato o indotta da HCl
   1. Aggiungere 100 mL di terreno di controllo (preparata al punto 1.1.5) 74 µ l di soluzione del lattato o 125 µ l di 1 M HCl.
   2. Controllare il pH medio dopo 24 h di incubazione a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂.
      Nota: La quantità di lattato o soluzione di HCl deve anche essere regolata secondo il pH medio, che possa differire a seconda del contenuto di CO₂ nel incubatrice e pressione dell'aria. Idealmente, è meglio misurare il pH medio con seriale lattato o concentrazioni di HCl per determinare la quantità appropriata per la regolazione del pH desiderato del mezzo.

2. raccolta e trattamento di cellule

1. Iniziare a coltivare le cellule a 37 ° C, inferiore al 5% di CO₂ almeno 1 settimana prima di eseguire esperimenti.
   Nota: Le linee cellulari utilizzate in questo studio sono elencate in Tabella materiali.
2. Cellule di passaggio quando raggiungono confluency di 70-90%. Non permettono alle cellule di diventare confluenti. Modificare il mezzo ogni 2-3 giorni durante la coltivazione quotidiana.
3. Lavare le cellule aggiungendo 5 mL di PBS. Aspirare il PBS e aggiungere enzima distaccante quali 1 mL di tripsina.
4. Incubare a 37 ° C fino a quando le cellule vengono arrotondate e iniziano a staccare.
5. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura le cellule indipendenti e disattivare degli enzimi. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare per 3 min a 300 x g. aspirare il supernatante e risospendere le cellule con terreno di coltura.
6. Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e blu di Trypan.
7. Seme 5,0 x 10⁵ cellule/pozzetto di un piatto di 10 cm in 10 mL di terreno. Incubare le cellule per 24 h a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂.
8. Aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule con 5 mL di PBS e aggiungere 10 mL di terreno di coltura acido preparato nella sezione 1. Incubare le cellule per 24 h a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂.

3. RNA isolamento

1. Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con 5 mL di PBS. Frantumare le cellule con l'aggiunta del reagente di estrazione di RNA (Vedi Tabelle materiali).
2. Raschiare il piatto brevemente, quindi rimuovere il reagente di estrazione di RNA con una pipetta e depositare il RNA estrazione reagente/lysate delle cellule in una provetta da 1,5 mL. Lasciare a temperatura ambiente per 5 min.
3. Aggiungere 250 cloroformio µ l e agitare la provetta per lasciare circa 15 s. a temperatura ambiente per 5 min e centrifugare a ≥ 8, 000 x g per 5 min.
4. Rimuovere con cautela la fase acquosa utilizzando una pipetta. Lasciare dietro alcuni della fase acquosa. Posto in un'altra provetta da 1,5 mL.
5. Aggiungere 550 µ l isopropanolo alla fase acquosa e mescolare delicatamente. Lasciare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare a massima velocità (≥ 20, 000 x g) per 20 min a 4 ° C.
6. Versare fuori l'isopropanolo e aggiungere 1 mL di etanolo al 75% in DEPC acqua trattata. Mescolare delicatamente. Centrifugare a 8.000 x g per 5 min.
7. Pipettare fuori l'etanolo e lasciare che asciugare all'aria il pellet.
8. Aggiungere che circa 15-25 µ l (a seconda del rendimento) di DEPC acqua trattata per la pallina del RNA. Mescolare accuratamente.
9. Misurare la concentrazione di RNA isolato misurando l'assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro.

4. sintesi del cDNA

1. Combinare i seguenti componenti in un tubo di reazione di PCR: fino a 5 µ g RNA totale, 1 µ l Oligo dT (50 µM) o Primer Mix (60 µM), 1 µ l 10 mM dNTP e acqua priva di nucleasi per un volume totale di 14 µ l.
2. Mescolare e centrifugare brevemente i componenti utilizzando una centrifuga da banco piccolo (~ 5 s). Denaturare il campione primer di RNA per 5 min a 65 ° C. Girare brevemente (~ 5 s) utilizzando un piccolo benchtop centrifugare e mettere il campione immediatamente in ghiaccio per almeno 1 min.
3. Aggiungere i seguenti componenti: 4 µ l 5 x buffer della trascrizione inversa, 1 µ l della trascrittasi inversa (200 U / µ l), 1 µ l della RNAsi inibitore (40 U / µ l).
   Nota: Esempi di kit commercialmente disponibili sono mostrati in Tabella materiali
4. Richiudere la provetta, mescolare e poi Centrifugare brevemente il contenuto utilizzando una centrifuga da banco piccolo (~ 5 s). Incubare la miscela di reazione combinata a 50-55 ° C per 10 min.
5. Inattivare la reazione incubando a 80 ° C per 10 min.

5. misurazione dell'espressione genica acido-sensibli a reagire mediante PCR in tempo reale

1. Combinare i seguenti componenti in una piastra 384 pozzetti di reazione: 1 µ l modello cDNA, 0,75 µ l 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µM 50 µ l in avanti Primer, 0,3 µ l 50 µM reverse primer, 1 µ l Taq polimerasi, 2,5 µ l 10 x buffer della polimerasi di Taq, 2,5 µ l 20 mM dNTP, 16.65 µ l acqua.
   Nota: Esempio di kit commercialmente disponibili vengono visualizzati nella Tabella materiali. Nella tabella 1viene visualizzato un elenco degli iniettori. Una piastra a 96 pozzetti di reazione può essere utilizzata anche in questo passaggio. Altre sonde (ad es., sonda Taqman) possono anche essere utilizzate.
2. Impostare l'esperimento e il seguente programma PCR su un sistema di PCR in tempo reale: 50 ° C per 2 min, 1 ciclo; 95 ° C per 10 min, 1 ciclo; 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 1 min, 40 cicli; 95 ° C per 15 s, 1 ciclo; 60 ° C per 15 s, 1 ciclo; 95 ° C per 15 s, 1 ciclo.
3. Posizionare la piastra nello strumento qPCR. Avviare il programma.
   Nota: Upregulation dei geni reattivo pH MSMO1, INSIG1e IDI1 può essere misurata dai livelli della proteina.

Risultati

Per determinare la concentrazione di bicarbonato appropriato, abbiamo preparato DMEM al gamma di 0 - 8 mM NaHCO₃ (concentrazione finale nel terreno di coltura) e riuscì a preparare terreni di coltura con pH che vanno da 6.4-7,4 (Figura 1). Abbiamo preparato DMEM con 8mm NaHCO₃ (pH 7.4) come un mezzo di controllo e 2 mM NaHCO₃ (pH 6,8) come un mezzo con pH acido secondo un precedente rapporto, affermando che il pH extracellular...

Discussione

Qui, abbiamo descritto un sistema di coltura semplice pH acido e il suo processo di valutazione. La combinazione dei tre metodi di acidificazione medio, vale a dire, concentrazione ridotta di bicarbonato, aggiunta di lattato e aggiunta di HCl, ci ha permesso di indagare a fondo il meccanismo di pH-risposta e di confrontare la risposta cellulare ad altro tumore condizioni microambientali come ipossia o nutriente inedia.

La chiave di questo metodo consiste nel determinare le concentrazi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Aquila modificata di Dulbecco" Nissui" 2	Nissui	05919
Siero fetale bovino	Thermo Fisher	10438
NaHCO3	Wako	191-01305
Soluzione di L-glutammina	Thermo Fisher	25030-081
Soluzione mista di penicillina-streptomicina (stabilizzata)	Nacalai	09367-34
0,5 g/l-tripsina/0,53 mmol/l-EDTA, con rosso fenolo	Nacalai	32778-05
Soluzione di colorazione blu di tripano allo 0,5%	Nacalai	29853-34
Soluzione di acido lattico	Sigma-Aldrich	252476
Soluzione di acido cloridrico	Sigma-Aldrich	H9892
RNeasy Plus Mini Kit	QIAGEN	74134
SuperScript IV Sistema di sintesi a primo filamento	Thermo Fisher	18091
Power SYBR Green PCR Master Mix	Biosistemi Applicati	4368702
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Linee cellulari
PANC-1	ATCC	CRL-1469
AsPC-1	ATCC	CRL-1682
KMS-6	JCRB Banca di cellule
		TIG	JCRB
JCRB0432 MRC9	ATCC	CCL-212
HUVEC	ATCC	CRL-1730
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipment
NanoDrop One Spettrofotometro UV-Vis a microvolume con Wi-Fi	Thermo Fisher	ND-ONE-W
QuantStudio 5 Sistema PCR in tempo reale	Thermo Fisher	CRL-1682

Bancadi cellule