Distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive può essere osservato in un sottogruppo di tumori al seno e genera dilemmi clinici. Qui, presentiamo un protocollo affidabile ed economico per definire, quantificare e confrontare eterogeneità genetica intra-tumore di HER2 in un'ampia serie di cancri al seno eterogeneo trasformati.
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Articolo metodologico
Costruire una piattaforma di High-throughput Screening per valutare l'eterogeneità dell'amplificazione del Gene HER2 nei cancri al seno
In questo articolo
Sommario
Abstract
Terapie mirate contro il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) hanno cambiato radicalmente il risultato dei pazienti con tumori al seno HER2-positivo. Tuttavia, una minoranza dei casi viene visualizzata una distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive, che genera grandi sfide cliniche. Fin qui, nessun protocolli affidabili e standardizzati per la caratterizzazione e la quantificazione dell'amplificazione del gene HER2 eterogenei in larghe coorti sono state proposte. Qui, presentiamo una metodologia di alto-rendimento per valutare contemporaneamente lo stato di HER2 in diverse aree topografiche dei cancri al seno più. In particolare, vi illustriamo la procedura di laboratorio per la costruzione di microarrays di avanzata del tessuto (TMAs) incorporando una mappatura mirata dei tumori. Tutti i parametri di TMA sono stati ottimizzati in modo specifico per l'argento in situ ibridazione (SISH) di formalina-fisso la tessuti del seno di paraffina (FFPE). L'analisi di Immunohistochemical dei biomarcatori prognostici e predittivi (cioè, ER, PR, Ki67 e HER2) deve essere eseguita utilizzando procedure automatizzate. Un protocollo personalizzato di SISH è stato implementato per consentire un'analisi molecolare di alta qualità attraverso tessuti multipli che ha subito diverse procedure di fissazione, elaborazione e archiviazione. In questo studio, forniamo un prova-de-principio che sequenze specifiche del DNA potrebbero essere tumori della mammella localizzate simultaneamente in distinte aree topografiche della multipla ed eterogeneo trasformati utilizzando un metodo efficiente ed economico.
Introduzione
HER2 è un proto-oncogene che è overexpressed ed amplificato in 15-30% di tutti i invasivo al seno tumori1,2. Iperespressione di HER2 è dedotto dalla presenza di > 10% di cellule con membrana forte immunoistochimica (IHC) colorazione (3 +), mentre l'amplificazione del gene può essere valutato quando il rapporto di HER2/centromero è ≥ 2 oppure il numero di copie del gene è ≥ 6, sul conteggio almeno 20 celle di in situ di ibridazione (ISH)3.
Eterogeneità genetica intra-tumorale è stata ampiamente descritta nei cancri al seno, essendo un contrib....
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dalla Institutional Review Boards da IRCCS Ca' Granda Foundation, ospedale Policlinico, Milano, Italia.
1. selezione dei pazienti e dei campioni di tessuto
- Recuperare le diapositive archiviazione di tutti i casi per essere analizzati, compresi tutti i disponibile ematossilina ed eosina (H & E) e diapositive IHC dalla diagnosi originale e, se presente, un H & E di abbinati tessuto neoplastico mammario (ad es., margine chirurgico) .
-
Eseguire revisioni di caso.
Nota: Per questa attività, almeno due patologi con esperienza in patologia mammaria dovrebbero discuter....
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Risultati
Nel complesso, al seno invasivo 444 cancri sono stati incorporati in 15 TMAs specificamente ottimizzato per analisi ISH. Tra i luoghi di 2.664 campionati, 2.651 (99,5%) fossero rappresentative delle zone precedentemente selezionate e quindi considerati suscettibili per analisi successive. Eterogeneità intra-tumorale è stata determinata mediante IHC e SIH, con un focus particolare sulle distribuzioni eterogenee dei cloni di HER2-positive nelle distinte aree topografiche dei tumori.
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Discussione
Qui, noi abbiamo dettagliato le strategie di laboratorio per eseguire analisi di SISH del gene HER2 e suo centromero corrispondente in TMAs ad alto rendimento dei cancri al seno eterogeneo trasformati. Questo metodo è conveniente e può essere effettuato nella maggior parte dei laboratori per lo studio dell'eterogeneità di amplificazione genica di HER2 in larghe coorti di seno tumori Estratto forma patologia archivi.
Data l'importanza clinica di HER2 test nel cancro al seno e .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germania, UE | 39601006 | Terreno di inclusione tissutale, 56 gradi C punto di fusione |
| Eosin Y soluzione acquosa all'1 | Bio Optica, Milano, Italia, UE | 510002 | Eosin giallastra, solubile |
| in acqua Carazzi' s hematoxylin | Bio Optica, Milano, Italia, UE | 506012 | Ematossilina allume maturata utilizzando iodato di potassio |
| Qualità del diamante | Laboindustria, Arzergrande, Italia, UE | 33533 | Vetrini per microscopio 26x76 mm |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germania, UE | 14046430011 | Mezzo di montaggio, senza monomeri, a base di polimeri di butilmetacrilato in xilene |
| Vetrini per microscopio FLEX IHC | Tecnologie Agilent (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Vetrini per microscopio rivestiti per l'adesione di FFPE per l'uso nel sistema medico IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana, Tucson, AZ, USA | Sistema di colorazione dei vetrini | N750-BMKU-FS |
| CONFIRM anti-recettore degli estrogeni (ER) (SP1) Anticorpo monoclonale primario di coniglio | Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Anticorpo primario, pronto all'uso |
| CONFIRM anti-recettore del progesterone (PR) (1E2) Anticorpo primario monoclonale di coniglio | Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Anticorpo primario, pronto all'uso |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Anticorpo primario monoclonale di coniglio | Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Anticorpo primario, pronto all'uso |
| PATHWAY HER2 (4B5) Anticorpo primario monoclonale di coniglio | Sistema medico, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Anticorpo primario, |
| kit di rilevamento DAB universale ultraView | Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Sistema indiretto privo di biotina per il rilevamento di anticorpi primari IgG di topo, IgM di topo e coniglio |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe | Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | Saggio INFORM HER2 Dual ISH - Ibridazione in situ a doppio colore Test automatizzato approvato dalla FDA per determinare lo stato del gene HER2 nei pazienti con carcinoma mammario. |
| Kit di rilevamento ultraView Silver ISH DNP | Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| Kit di rilevamento ultraView Red ISH DIG | medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Proteasi 3 | Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Utilizzato nel processo ISH per rimuovere la proteina che circonda le sequenze di DNA bersaglio di interesse |
| Ematossilina | Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Reagente antimacchia ematossilina di Gill modificato |
| Ematossilina II Sistema | medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Reagente antimacchia ematossilina di Meyer modificato |
| Sistema | medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Soluzione acquosa di carbonato di litio tamponato per la brunitura di sezioni colorate con ematossilina su vetrini |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Tampone a base di formammide per saggi ISH |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Soluzione concentrata per la rimozione della paraffina da campioni di tessuto durante le reazioni IHC e ISH e per diluire 1:10. |
| Tampone SSC (10X) | Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Cloruro di sodio La soluzione tampone di citrato di sodio viene utilizzata per lavaggi rigorosi e per risciacquare i vetrini tra le fasi di colorazione e fornire un ambiente acquoso stabile per le reazioni di ibridazione in situ. Diluire 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Soluzione coprioggetti prediluita (pronta all'uso) utilizzata come barriera tra i reagenti acquosi e l'aria per prevenire l'evaporazione nelle reazioni IHC e ISH Tampone |
| reazione (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Soluzione tampone a base di Tris (pH 7,6 ± 0,2) per risciacquare i vetrini tra le fasi di colorazione durante IHC e ISH. Diluire 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Fasi di pretrattamento nell'elaborazione di campioni di tessuto durante IHC e ISH. Pronto all'uso. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| Sistema medico ultraView Silver Wash II | Ventana, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Soluzione pronta all'uso per il risciacquo dei vetrini tra le fasi di colorazione IHC e ISH |
| Microtomo | Leica Biosystems, Wetzlar, Germania, UE | RM 2255 | Multistainer rotativo automatizzato |
| per microtomoLeica Biosystems, Wetzlar, Germania, EU | ST 5020 | Workstation per colorazione e vetrino coprioggetti automatizzato | |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, Francia, EU | 00-MICO-1 | Arrayer semiautomatico per la costruzione di TMA con software integrato TMA Designer 2 |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germania, UE | K080254 | Dispositivo di acquisizione immagini - scanner patologico digitale |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe BV | 4135 | |
| Cassetta Tissue-Tek Paraform Stampo di base standard | Sakura Finetek Europe BV | 7055 | Stampo in metallo di base in acciaio inossidabile |
Riferimenti
- Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
- Montemurro, F., Scaltriti, M.
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Ristampe e permessi
