Articolo metodologico

Costruire una piattaforma di High-throughput Screening per valutare l'eterogeneità dell'amplificazione del Gene HER2 nei cancri al seno

DOI:

10.3791/56686

⸱

5 dicembre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pathology, Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2School of Medicine, University of Milan, 3School of Biology, University of Pavia, 4Division of Breast Surgery, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 5Division of Medical Oncology, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 6Department of Biomedical, Surgical, and Dental Sciences, University of Milan

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive può essere osservato in un sottogruppo di tumori al seno e genera dilemmi clinici. Qui, presentiamo un protocollo affidabile ed economico per definire, quantificare e confrontare eterogeneità genetica intra-tumore di HER2 in un'ampia serie di cancri al seno eterogeneo trasformati.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie mirate contro il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) hanno cambiato radicalmente il risultato dei pazienti con tumori al seno HER2-positivo. Tuttavia, una minoranza dei casi viene visualizzata una distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive, che genera grandi sfide cliniche. Fin qui, nessun protocolli affidabili e standardizzati per la caratterizzazione e la quantificazione dell'amplificazione del gene HER2 eterogenei in larghe coorti sono state proposte. Qui, presentiamo una metodologia di alto-rendimento per valutare contemporaneamente lo stato di HER2 in diverse aree topografiche dei cancri al seno più. In particolare, vi illustriamo la procedura di laboratorio per la costruzione di microarrays di avanzata del tessuto (TMAs) incorporando una mappatura mirata dei tumori. Tutti i parametri di TMA sono stati ottimizzati in modo specifico per l'argento in situ ibridazione (SISH) di formalina-fisso la tessuti del seno di paraffina (FFPE). L'analisi di Immunohistochemical dei biomarcatori prognostici e predittivi (cioè, ER, PR, Ki67 e HER2) deve essere eseguita utilizzando procedure automatizzate. Un protocollo personalizzato di SISH è stato implementato per consentire un'analisi molecolare di alta qualità attraverso tessuti multipli che ha subito diverse procedure di fissazione, elaborazione e archiviazione. In questo studio, forniamo un prova-de-principio che sequenze specifiche del DNA potrebbero essere tumori della mammella localizzate simultaneamente in distinte aree topografiche della multipla ed eterogeneo trasformati utilizzando un metodo efficiente ed economico.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HER2 è un proto-oncogene che è overexpressed ed amplificato in 15-30% di tutti i invasivo al seno tumori1,2. Iperespressione di HER2 è dedotto dalla presenza di > 10% di cellule con membrana forte immunoistochimica (IHC) colorazione (3 +), mentre l'amplificazione del gene può essere valutato quando il rapporto di HER2/centromero è ≥ 2 oppure il numero di copie del gene è ≥ 6, sul conteggio almeno 20 celle di in situ di ibridazione (ISH)3.

Eterogeneità genetica intra-tumorale è stata ampiamente descritta nei cancri al seno, essendo un contributo potenzialmente negative per valutazione di biomarcatori e trattamenti risposta4. Secondo la College di patologi americani (PAC), eterogeneità di HER2 esiste se HER2 è amplificato > 5% e < 50% di infiltrazione del tumore cellule5. Purtroppo, l'incidenza effettiva della eterogeneità spaziale HER2 nei cancri al seno rimane un argomento di polemica tra patologi, con alcuni autori sostenendo che è un evento eccessivamente raro, e altri che suggeriscono che fino al 40% dei casi sono HER2-eterogenei1,5,6,7,8,9,10. Nonostante i meccanismi biologici che sono alla base di questa condizione non sono ancora completamente chiariti, l'impatto prognostico e clinico di eterogeneità di intra-tumore HER2 è cruciale per seno cancro pazienti11.

Recentemente, luminoso-campo tecniche molecolari, quali ISH cromogenica (CISH) e argento ISH (SISH), sono emersi come metodi affidabili per rilevare HER2 eterogeneità nei tessuti FFPE, con alcuni vantaggi rispetto al fluorescenti ISH (pesce)12. Purtroppo, l'analisi di massa di singoli casi rimane impraticabile in studi di coorte di grande ricerca. Parecchi gruppi hanno suggerito che la combinazione di istochimica, IHC e ISH con tecnologie TMA potrebbe rappresentare una strategia utile nello studio della biologia del cancro13,14,15,16. Con questo metodo ampiamente adottato, campioni di tessuto da pazienti diversi possono essere analizzati contemporaneamente, riducendo al minimo il tessuto e i reagenti impiegati e promuovendo così l'analisi uniforme di una grande serie di casi14. Tuttavia, nessun protocolli sono disponibile per la caratterizzazione molecolare di alto-rendimento simultanea di più campioni di tessuto che ha subito diverse elaborazione in termini di reagenti, tempi di fissazione e metodi di conservazione autonomi, tali come archivio storico blocchi.

Date le implicazioni cliniche e prognostiche di eterogeneità spaziale HER2 nei cancri al seno, abbiamo sviluppato una piattaforma integrata molecolare per valutarlo in ampia serie di casi eterogeneo trasformati. Qui, abbiamo ritrarre le strategie di laboratorio per generare e analizzare l'eterogeneità intra-tumorale di amplificazione di HER2 in high yield TMAs di cancro al seno per mezzo di SISH. Il seguente protocollo è stato sviluppato per i tumori di misura > 5 mm (> pT1b secondo il TNM 2017)17. Per le più piccole lesioni, si consiglia di eseguire l'analisi su sezioni di serie integrale. La nostra procedura consente l'analisi simultanea di IHC e SISH di fino a 30 cancri al seno, che comprende una media di 6 zone distinte (gamma 4-8) per ciascun caso. Complessivamente, 180 nuclei di tessuto di 1 mm di diametro, con 500 µm tra il core e 2 mm tra la griglia e bordi verranno generati per ogni blocco TMA.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato approvato dalla Institutional Review Boards da IRCCS Ca' Granda Foundation, ospedale Policlinico, Milano, Italia.

1. selezione dei pazienti e dei campioni di tessuto

  1. Recuperare le diapositive archiviazione di tutti i casi per essere analizzati, compresi tutti i disponibile ematossilina ed eosina (H & E) e diapositive IHC dalla diagnosi originale e, se presente, un H & E di abbinati tessuto neoplastico mammario (ad es., margine chirurgico) .
  2. Eseguire revisioni di caso.
    Nota: Per questa attività, almeno due patologi con esperienza in patologia mammaria dovrebbero discutere le diapositive diagnostiche e risolvere disaccordi collegialmente. Utilizzare un microscopio convenzionale o strumenti di telepatologia (quest'ultimo in studi multicentrici di favore). Se del caso, escludere tutti i casi discordanti.
    1. Eseguire la ri-classificazione istologica di tutti i casi secondo l'ultima edizione della classificazione World Health Organization (WHO) dei tumori del seno18.
    2. Assicurarsi che il tessuto normale per ogni caso, se presenti nei campioni clinici archivistici, comprende almeno una unità duttale lobulare terminale non-neoplastico.
    3. Identificare tutte le aree neoplastiche che mostrano eterogenee citologico, architettonico, o caratteristiche IHC usando un microscopio a campo chiaro (da effettuarsi congiuntamente da un patologo e il tecnico che costruirà il TMAs).
  3. Evidenziare le aree topografiche discrete con un pennarello su vetrino o con l'apposito attrezzo sul software diapositiva digitale (Figura 1A).
  4. Basato su diapositive selezionate, recuperare i corrispondenti blocchi FFPE dagli archivi.
    Nota: Per ottimizzare la TMA costruzione, per evitare lo svuotamento del tessuto e per preservare la TMA punch integrità strutturale, casi con < 1 mm di spessore tessuto residuo dovrebbe essere escluso.

2. progettare e costruire TMAs basato sulla tecnica Kononen

  1. Creare e aprire un nuovo file di foglio di calcolo che incorporano i record delle zone distinte di ogni caso. Includere i seguenti dati su colonne separate, come esemplificato nella tabella 1: caso ID, ID del blocco, Area ID, tipo di tessuto (ad es., tessuto normale, componente invasiva istotipo, in situ componente istotipo), topografia (ad es., nucleo del tumore, invasivo anteriore), morfologia (ad es., grado nucleare, architettura, mitosi, caratteristiche citologiche), lo stato di biomarcatori (cioè, ricevitore dell'estrogeno (ER), ricevitore del progesterone (PR), Ki67 e HER2) e tutte le altre caratteristiche IHC disponibili.
    1. Salvare il documento.
  2. Creare un progetto TMA.
    1. Installare e aprire il software di progettazione di TMA.
    2. Definire il destinatario TMA blocchi: accesso tramite il menu File > New > blocco o utilizzando CTRL + B.
    3. Fai clic nel campo primo di riempire o premere il tasto Tab e digitare nelle dimensioni del blocco paraffina: larghezza 35 mm, altezza 20 (mm). Tipo "2" come il valore di "margine" (cioè, la distanza dal bordo di paraffina in mm) (Figura 1B). Salvare i dati facendo clic sul pulsante appropriato. Il nuovo modello di destinatari bloccati verranno salvate e pronto per essere utilizzato nei nuovi modelli di matrice del tessuto.
    4. Creare un progetto di matrice del tessuto: accesso al menu File > New > tessuto matrice o utilizzando CTRL + T.
    5. Immettere il nome della matrice del tessuto, commenti e autore, quindi fare clic su "Avanti". Fare clic sull'icona di "importazione", scegliere il file di modello di destinatari bloccati precedentemente creato e fare clic su "Avanti".
    6. Scegliere 1 mm come la dimensione dello spot facendo clic sul pulsante rotondo. Scegliere 500 µm come spaziatura spot che è lo spazio tra i due centri dei luoghi vicini. Fare clic sull'icona calcolatrice per calcolare il numero totale di punti creati, che dovrebbe essere 231. Fare clic su "Avanti".
    7. Definire le modalità di numerazione spot facendo clic una volta su di esso. Fare clic sul pulsante "definire" per creare reti e sotto-reti. Elimina la central line (linea 6) e le colonne 8 e 15. Mantenere 3 punti della linea 1 per l'orientamento. La mappa finale dovrebbe comprendere un numero totale di 183 macchie, come rappresentato nella Figura 2.
    8. Definire l'elenco di tipi di tessuto: accesso tramite il menu File > New > elenco di tipi di tessuto o utilizzando CTRL + L.
    9. Inserire le descrizioni di tessuto precedentemente definite. Premere freccia giù oppure fare clic sul pulsante + per aggiungere una riga.
    10. Definire il progetto: accesso tramite il menu File > nuovo > progetto Booster o utilizzando CTRL + P.
    11. Immettere il nome della matrice di tessuto, commenti e autore, quindi fare clic su "Avanti". Importare il file di foglio di calcolo, elenco di tipi di tessuto e modello di matrice del tessuto creato in precedenza cliccando le icone corrette.
    12. Fare clic su "Seleziona tutto" e definire il numero di punti per ogni tipo di tessuto; fare clic sul pulsante "partita" per applicare le impostazioni. Verrà visualizzata una tabella che elenca il numero totale di core che verranno campionate e trasferito al destinatari blocchi in questo progetto. Salvare il progetto e chiudere il programma.
  3. Preparare i blocchi accettore (Figura 1B).
    1. Riempire detersa stampi in metallo con inserti paraffina a 65 ° C.
    2. Lasciare i blocchi di paraffina a raffreddare a temperatura ambiente durante la notte all'interno di stampi in metallo.
    3. Estrarre i blocchi di paraffina da stampi in metallo. In caso di crepe, scartare il blocco e ripetere i passi 2.3.1-2.3.3.
  4. Costruire la TMA utilizzando un arrayer automatizzata o semi-automatico19.
    1. Recuperare tutti i selezionati FFPE blocchi e le corrispondenti sezioni H & E con annotazioni.
    2. Accendere il arrayer e inserire i blocchi di ricettore sulla giostra arrayer.
    3. Aprire il software arrayer control station, cliccare su "Nuovo tessuto Array" e caricare il progetto creato in precedenza (Figura 1).
    4. Fare clic su "Continua" e selezionare la posizione di blocco il donatore dal menu.
    5. Definire la posizione iniziale su ogni blocco di destinatari: utilizzare i tasti freccia per spostare la luce laser e allinearlo con il bordo superiore sinistro sulla paraffina del blocco destinatario.
    6. Fare clic su "Avanti" e ripetere per l'allineamento verticale.
    7. Fare clic su "Avanti" per creare automaticamente un buco nella coordinata precedentemente definita del blocco destinatario (accettore).
    8. Svuotare il pugno.
    9. Posizionare il blocco di donatori per il campionamento e rimuovere un nucleo di tessuto dalla zona precedentemente annotata di interesse.
    10. Inserire il nucleo del tessuto donatore nel foro del blocco di destinatario (accettore).
    11. Rimuovere il blocco di donatore dal arrayer.
    12. Ripetere i passaggi 2.4.5-2.4.11 fino al completamento della TMA.
  5. Mettere il lato del tessuto del blocco TMA appena generato su una diapositiva vuota sterile e metterli in forno laboratorio a 45 ° C per 5 min.
  6. Premere delicatamente il blocco sulla diapositiva per 5 s per appiattire i nuclei di tessuto. Ripetere una volta (per un totale di 2 volte).
  7. Rimuovere il blocco TMA insieme con la diapositiva dal forno, capovolgerli e staccare delicatamente il blocco dalla diapositiva.
  8. Coprire la superficie del tessuto TMA con un sottile strato di paraffina elasticizzato a 65 ° C.
  9. Lasciare il blocco TMA a temperatura ambiente per 2 h.
  10. Trasferimento del blocco TMA a 4 ° C per 24 h.
    Nota: Il blocco TMA può essere memorizzato a 4 ° C fino ad esaurimento.

3. istochimiche e Immunohistochemical analisi

  1. Tagliare sezioni TMA.
    1. Posizionare i blocchi di accettore TMA con il paraffina-lato verso il basso su una superficie di-10 ° C per 10 min raffreddare la paraffina.
    2. Riempire una vasca di galleggiamento con acqua ultrapura e impostare calore a 38 ° C.
    3. Inserire una nuova lama su un microtomo rotativo e inserire il blocco nel mandrino microtomo così il blocco di cera si affaccia la lama ed è allineato sul piano verticale.
    4. Avvicinarsi con cautela il blocco con la lama e tagliare alcune sezioni sottili per garantire che il posizionamento è corretto; regolare se necessario.
    5. Tagliare 3 µm di spessore sezioni.
    6. Pick up le sezioni usando la pinzetta e li galleggiare sulla superficie della vasca dell'acqua.
    7. Scegli le sezioni fuori il bagno di acqua su vetrini IHC/ISH e regolari.
    8. Porre i vetrini in un rack e memorizzarli in forno a 45 ° C durante la notte.
      Nota: Una volta preparato, le sezioni TMA dovrebbero essere macchiate entro 24 h.
  2. Eseguire la colorazione istochimica (H & E) utilizza un autostainer.
    1. Inserire le diapositive nel rack autostainer e metterli a 60 ° C per 10 min.
    2. Aprire il cassetto di caricamento del autostainer e Inserisci che il rack con TMA i vetrini in una delle stazioni di carico con una clip standard di H & E rivolto verso l'esterno.
    3. Una volta che il cassetto è chiuso, il clip verrà riconosciuto automaticamente dal sistema e verrà avviato il seguente protocollo: Stazione forno a 37 ° C (6 min), xilene (2 min), xilene (2 min), etanolo 100% (2 min), etanolo 100% (2 min), etanolo 95% (2 min), etanolo 95% (2 min) , acqua distillata acqua (4 min), ematossilina di Carazzi (9 min), acqua corrente a bassa pressione (2 min), eosina 1% (1 min), acqua corrente a bassa pressione (2 min), etanolo 95% (20 s), etanolo 95% (20 s), etanolo 95% (20 s), etanolo 95% (20 s), etanolo 100% (15 s), etanolo 100% (15 s) , xilene (30 s), xilene (30 s).
    4. Scaricare il rack dal cassetto e montare il vetrino con un vetrino coprioggetto.
      1. Raccogliere una goccia di montaggio con una pipetta e metterlo su un bordo esterno della diapositiva coperchio.
      2. Posizionare il lato bagnato del coprioggetto sul vetrino e lasciare il Monte asciugare per 30 min.
  3. Eseguire IHC che macchia per ER, PR, Ki67 e HER2 utilizzando un immunostainer automatizzato.
    Nota: Prima di iniziare a correre colorazione, avviare il sistema e controllare i flaconi di reagenti consumabili (Tabella materiali) e contenitori di rifiuti.
    1. Porre i vetrini TMA per analizzare a 60 ° C per 10 min.
    2. Avviare lo strumento di immunostainer ed il software.
    3. La vista Home, fare clic sul pulsante di protocolli e quindi fare clic su Crea/modifica protocolli.
    4. Selezionare standard DAB (3, 3'-diaminobenzidina) procedura di IHC per modificare il modello di base.
    5. Bandiera "Sparaffinatura" nell'elenco della casella e impostare la temperatura media a 72 ° C.
    6. La soluzione che smaschera cc1 di flag, impostare la temperatura media a 95 ° C e il tempo di incubazione a 36 min.
    7. Contrassegnare la casella di anticorpo primario, inserire l'ID del dispenser inline ER (software dello strumento riconoscerà l'erogatore sulla giostra reagente) e impostare il tempo di incubazione a 16 min.
    8. Contrassegnare la casella controcolorazione, selezionare ematossilina io e impostare il tempo di incubazione a 12 min.
    9. Fare clic sul pulsante "Salva con nome" e il nome del protocollo.
    10. Ripetere la procedura 3.3.3-3.3.9 per i restanti anticorpi usando i seguenti tempi di incubazione gli anticorpi primari: PR 16 min, Ki67 16 min e HER2 12 min utilizzare anticorpi pre-diluito ready-to-use (RTU).
    11. La vista Home, fare clic sul pulsante Crea etichetta.
    12. Fare clic sul pulsante di protocolli e aggiungere i protocolli ER, PR, Ki67 e HER2 per ciascuna della TMA per analizzare.
    13. Fare clic sul pulsante Chiudi /Print.
    14. Come il modello di etichetta viene visualizzata, immettere gli ID di TMA per l'etichetta.
    15. Fare clic sul pulsante stampa per stampare le etichette e quindi applicarli sulle diapositive TMA.
    16. Fare clic sull'icona dello strumento e impostare la modalità di avvio dello strumento come "Pronto".
    17. Aprire il cappuccio che copre il carosello di reagenti, collocare il sistema di rilevamento e gli anticorpi primari, quindi chiudere il cofano.
    18. Fare clic sul pulsante frontale su un cassetto scorrevole per aprirlo, caricare i vetrini TMA e chiudere il cassetto facendo clic sul pulsante stesso.
    19. Impostare la modalità di avvio dello strumento come "in esecuzione" e seguire le istruzioni.
    20. Alla fine dell'esecuzione, scarico TMA diapositive premendo l'aperto tutti i cassetti con risciacquo e completato diapositive pulsante sullo strumento controllo Slide in caldo acqua e sapone per rimuovere eventuali reagenti restanti.
    21. Lavare i vetrini sotto acqua corrente fredda a bassa pressione, disidratare i vetrini TMA e applicare un vetrino coprioggetti a ogni diapositiva.
  4. Eseguire analisi IHC di ER, PR e HER2 seguendo la società americana di oncologia clinica (ASCO) / CAP linee guida e di Ki67 secondo le raccomandazioni dell'internazionale Ki67 nel gruppo di lavoro di cancro al seno (tabella 2).
    Nota: Questa analisi deve essere eseguita separatamente nei punti discreti del tessuto da un patologo con un'esperienza in patologia mammaria.
    1. Valutare l'espressione di ER come positiva se ≥ 1% dei nuclei delle cellule del tumore sono immunoreactive20,21,22,23.
    2. Valutare l'espressione di PR come positiva se ≥ 1% dei nuclei delle cellule del tumore sono immunoreactive20,21,22,23.
    3. Valutare l'espressione di HER2 come: a) Punteggio 3 + se membrana circonferenza macchiatura completo e intenso, b) Punteggio 2 + se colorazione circonferenziale della membrana è incompleta e/o debole/moderata e all'interno di > 10% delle cellule del tumore invasivo o completa e colorazione di membrana della circonferenza è intenso e ≤ 10% delle cellule del tumore invasivo, c) score 1 + se membrana incompleta colorazione è debole/appena percettibile e all'interno di > 10% delle cellule del tumore invasivo, d) negativo se nessuna macchiatura è presente o membrana la colorazione è incompleta e debole/appena percettibile e all'interno di ≤ 10% del tumore invasivo cellule3,24.
    4. Valutare l'indice di Ki67, come la percentuale di cellule con colorazione nucleare in almeno 1.000 cellule neoplastici casualmente selezionati oltre 10 campi ad alta potenza (ingrandimento, 400 X)25.

4. SISH analisi di HER2

  1. Tagliare sezioni TMA (ripetere il punto 3.1).
  2. Eseguire SISH per HER2 utilizzando un immunostainer automatizzato.
    1. Porre i vetrini TMA per analizzare a 60 ° C per 10 min.
    2. Avviare lo strumento di immunostainer ed il software.
    3. La vista Home, fare clic sul pulsante di protocolli e quindi fare clic su Crea/modifica protocolli.
    4. Selezionare la procedura di "U Dual ISH CKT" per modificare il modello di base.
    5. Bandiera "Asciugatura" nell'elenco della casella e impostare la temperatura a 63 ° C per 20 min.
    6. Bandiera "Cella condizionata" nell'elenco della casella, quindi "cella condizionata CC2" e impostare la temperatura a 86 ° C e a incubazione a 4 min.
    7. Bandiera mite CC2 (ciclo 1), Standard (ciclo 2) ed Extended (ciclo 3) per 8 min, 12 min e 8 min, rispettivamente.
    8. Bandiera "ISH-proteasi 3" nell'elenco della casella e impostare il tempo di incubazione a 16 min.
    9. Selezionare le sonde HER2DNP e CHR17DIG e impostare il tempo di incubazione a 6 h.
    10. Impostare il lavaggio a 76 ° C per 8 minuti.
    11. Impostare il tempo di incubazione multimer (SIL ISH DNP HRP) SISH a 32 min.
    12. Impostare il tempo di incubazione di argento Cromogeno (SIL ISH DNP CHRC) a 4 min.
    13. Impostare il tempo di incubazione multimer rosso (rosso ISH scavare AP) a 24 min.
    14. Impostare il tempo di incubazione di cromogeno rosso (rosso ISH scavare FR) a 8 min.
    15. Bandiera "controcolorazione" nell'elenco della casella, selezionare "Ematossilina II" e impostare il tempo di incubazione a 8 min.
    16. Bandiera "post-Counterstaining" nell'elenco della casella, selezionare "Reagente blu" e impostare il tempo di incubazione a 4 min.
    17. Ripetere i passaggi da 3.3.11-3.3.15 (selezionare modificato protocollo U Dual ISH CKT).
    18. Aprire il cappuccio che copre il carosello di reagenti, posizionare il lavaggio e i sistemi di rilevamento di ISH, quindi chiudere il cofano.
    19. Ripetere i passaggi da 3.3.18-3.3.21.
  3. Eseguire analisi SISH per HER2: valutare l'amplificazione del gene HER2 come positivo se il rapporto di /CEP17 di HER2è  2,0 con una media HER2 copia numero ≥4.0 segnali per cella e negativa se il rapporto di /CEP17 di HER2è < 2.0 con una media di HER2 copia numero < 4.0 segnali/cella3,24.
    Nota: Simile a IHC, questa analisi deve essere eseguita separatamente nei punti discreti del tessuto da un patologo con esperienza in patologia mammaria.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nel complesso, al seno invasivo 444 cancri sono stati incorporati in 15 TMAs specificamente ottimizzato per analisi ISH. Tra i luoghi di 2.664 campionati, 2.651 (99,5%) fossero rappresentative delle zone precedentemente selezionate e quindi considerati suscettibili per analisi successive. Eterogeneità intra-tumorale è stata determinata mediante IHC e SIH, con un focus particolare sulle distribuzioni eterogenee dei cloni di HER2-positive nelle distinte aree topografiche dei tumori.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, noi abbiamo dettagliato le strategie di laboratorio per eseguire analisi di SISH del gene HER2 e suo centromero corrispondente in TMAs ad alto rendimento dei cancri al seno eterogeneo trasformati. Questo metodo è conveniente e può essere effettuato nella maggior parte dei laboratori per lo studio dell'eterogeneità di amplificazione genica di HER2 in larghe coorti di seno tumori Estratto forma patologia archivi.

Data l'importanza clinica di HER2 test nel cancro al seno e ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, Germania, UE39601006Terreno di inclusione tissutale, 56 gradi C punto di fusione
Eosin Y  soluzione acquosa all'1Bio Optica, Milano, Italia, UE510002Eosin giallastra, solubile
in acqua Carazzi' s hematoxylinBio Optica, Milano, Italia, UE506012Ematossilina allume maturata utilizzando iodato di potassio
Qualità del diamanteLaboindustria, Arzergrande, Italia, UE33533Vetrini per microscopio 26x76 mm
Leica CV MountLeica Biosystems, Wetzlar, Germania, UE14046430011Mezzo di montaggio, senza monomeri, a base di polimeri di butilmetacrilato in xilene
Vetrini per microscopio FLEX IHCTecnologie Agilent (Dako),  Santa Clara, CA, USAK8020Vetrini per microscopio rivestiti per l'adesione di FFPE per l'uso nel sistema medico IHC
BenchMark ULTRAVentana, Tucson, AZ, USASistema di colorazione dei vetriniN750-BMKU-FS
CONFIRM anti-recettore degli estrogeni (ER) (SP1) Anticorpo monoclonale primario di coniglioSistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA790-4324Anticorpo primario, pronto all'uso
CONFIRM anti-recettore del progesterone (PR) (1E2) Anticorpo primario monoclonale di coniglioSistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA790-2223Anticorpo primario, pronto all'uso
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Anticorpo primario monoclonale di coniglioSistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA790-4286Anticorpo primario, pronto all'uso
PATHWAY HER2 (4B5) Anticorpo primario monoclonale di coniglioSistema medico, Tucson, AZ, USA790-4493Anticorpo primario,
kit di rilevamento DAB universale ultraViewSistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA760-500Sistema indiretto privo di biotina per il rilevamento di anticorpi primari IgG di topo, IgM di topo e coniglio
INFORM HER2 Dual ISH DNA ProbeCocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA780-4422Saggio INFORM HER2 Dual ISH - Ibridazione in situ a doppio colore Test automatizzato approvato dalla FDA per determinare lo stato del gene HER2 nei pazienti con carcinoma mammario.
Kit di rilevamento ultraView Silver ISH DNPSistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA800-098
Kit di rilevamento ultraView Red ISH DIGmedico Ventana, Tucson, AZ, USA800-505
ISH Proteasi 3Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA780-4149Utilizzato nel processo ISH per rimuovere la proteina che circonda le sequenze di DNA bersaglio di interesse
EmatossilinaSistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA760-2021Reagente antimacchia ematossilina di Gill modificato
Ematossilina II Sistemamedico Ventana, Tucson, AZ, USA790-2208Reagente antimacchia ematossilina di Meyer modificato
Sistemamedico Ventana, Tucson, AZ, USA760-2037Soluzione acquosa di carbonato di litio tamponato per la brunitura di sezioni colorate con ematossilina su vetrini
HybReadyVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4409Tampone a base di formammide per saggi ISH
EZ Prep (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-102Soluzione concentrata per la rimozione della paraffina da campioni di tessuto durante le reazioni IHC e ISH e per diluire 1:10.
Tampone SSC (10X)Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA950-110Cloruro di sodio La soluzione tampone di citrato di sodio viene utilizzata per lavaggi rigorosi e per risciacquare i vetrini tra le fasi di colorazione e fornire un ambiente acquoso stabile per le reazioni di ibridazione in situ. Diluire 1:5.
ULTRA LCSVentana medical system, Tucson, AZ, USA650-210Soluzione coprioggetti prediluita (pronta all'uso) utilizzata come barriera tra i reagenti acquosi e l'aria per prevenire l'evaporazione nelle reazioni IHC e ISH Tampone
reazione (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-300Soluzione tampone a base di Tris (pH 7,6 ± 0,2) per risciacquare i vetrini tra le fasi di colorazione durante IHC e ISH. Diluire 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA950-223Fasi di pretrattamento nell'elaborazione di campioni di tessuto durante IHC e ISH. Pronto all'uso.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)Sistema medico Ventana, Tucson, AZ, USA950-224
Sistema medico ultraView Silver Wash IIVentana, Tucson, AZ, USA780-003Soluzione pronta all'uso per il risciacquo dei vetrini tra le fasi di colorazione IHC e ISH
MicrotomoLeica Biosystems, Wetzlar, Germania, UERM 2255Multistainer rotativo automatizzato
per microtomoLeica Biosystems, Wetzlar, Germania, EUST 5020Workstation per colorazione e vetrino coprioggetti automatizzato
Minicore 1Alphelys, Plaisir, Francia, EU00-MICO-1Arrayer semiautomatico per la costruzione di TMA con software integrato TMA Designer 2
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Germania, UEK080254Dispositivo di acquisizione immagini - scanner patologico digitale
Tissue-Tek III Uni-CassetteSakura Finetek Europe BV4135
Cassetta Tissue-Tek Paraform Stampo di base standardSakura Finetek Europe BV7055Stampo in metallo di base in acciaio inossidabile
% pronto all'uso Sistema di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923(2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. , Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. , 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93(2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Eterogeneit del tumore al senoibridazione in situ argenticacostruzione di microarray tissutalifissato in formalina e incluso in paraffinaanalisi immunoistochimicaenumerazione cromosomica di HER2mappatura dell area topograficacoloratore immunoistochimico automatico

Articoli correlati