Nuove strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa cardiaca richiedono studi estesi e dettagliati nei modelli animali preclinici grande prima che essi possono essere considerati per uso in esseri umani. Qui, dimostriamo una tecnica di iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto in conigli, che è importante per l'efficacia di tali terapie innovarici di verifica delle ipotesi.
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Articolo metodologico
L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Terapia cellulare e genica sono interessanti e promettenti strategie ai fini della rigenerazione cardiaca nella cornice di insufficienza cardiaca con ridotta frazione di eiezione (HFrEF). Prima che possano essere considerati per l'uso e implementati in esseri umani, i vasti studi preclinici sono tenuti nei grandi modelli animali per valutare la sicurezza, l'efficacia e destino di injectate (ad es., cellule staminali) una volta consegnato nel miocardio. Piccoli roditore modelli offrono vantaggi (per esempio, costo-efficacia, disponibilità per manipolazione genetica); Tuttavia, dato le limitazioni intrinseche di questi modelli, i risultati in queste raramente si traducono in clinica. Al contrario, grandi modelli animali come conigli e presentano vantaggi (per esempio, elettrofisiologia cardiaca simile rispetto agli esseri umani ed altri animali di grandi dimensioni), pur mantenendo un buon equilibrio economico. Qui, dimostriamo come eseguire una tecnica di iniezione (IMI) intramiocardico ecocardiografia-guida percutanea contrasto, che è minimamente invasivo, sicuro, ben tollerato e molto efficace per la somministrazione mirata di injectates, compreso le cellule, in diverse posizioni all'interno del miocardio di un modello di coniglio. Per l'implementazione di questa tecnica, abbiamo anche approfittato di un sistema di ecocardiografia clinica ampiamente disponibili. Dopo aver messo in pratica il protocollo descritto qui, un ricercatore con conoscenza di base di ultrasuono diventerà competente nello svolgimento di questa tecnica mini-invasiva e versatile per uso sistematico negli esperimenti, volto alla sperimentazione di ipotesi del capacità di rigenerativa cardiaca terapeutica nel modello di coniglio. Una volta ottenuta la competenza, l'intera procedura può essere eseguita all'interno di 25 min dopo anestetizzante il coniglio.
Introduzione
Terapie geniche e cellulari sono emozionanti e mai lo sviluppo di strategie per la rigenerazione o la riparazione del miocardio danneggiato in HFrEF. Alcuni studi hanno confrontato l'efficacia (ad es., tasso di ritenzione delle cellule) delle diverse vie di consegna delle cellule, che hanno sempre dimostrato la superiorità dell'IMI sulle rotte per via endovenosa o intracoronary1,2 , 3 , 4 , 5. così, non sorprende che gran parte degli studi su modelli traslazionale della terapia cellulare del miocar....
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Protocollo
Gli esperimenti descritti nel presente documento sono stati approvati dal comitato etico di ricerca dell'Università di Murcia, Spagna e sono stati eseguiti in conformità con la direttiva 2010/63/UE della Commissione europea. Le operazioni descritte sono state eseguite sotto protocolli operativi standard che facevano parte del piano di lavoro e non sono stati effettuati esclusivamente allo scopo di filmare il video allegato al presente documento.
1. preparazione delle cellule e vettore di espressione dei mammiferi
Nota: Qui, descriviamo brevemente un protocollo per la preparazione e la transfezione di una linea cell....
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Risultati
IMI di ecocardiografia-guida percutanea contrasto con InI:
Utilizzando il protocollo descritto sopra, e una volta che il posizionamento ottimale della punta dell'ago è stato confermato dall'ecocardiografia e l'iniezione ha avviato, il hyperechogenicity transmurale è stato osservato durante la consegna di InI (10% v/v in PBS) (Figura 2E) , così come poco dopo l'IMI alla regione di de.......
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Discussione
L'obiettivo primario era quello di sviluppare una tecnica mini-invasiva che poteva essere utilizzata per la fornitura di cellule staminali nel miocardio di conigli (un grande dimensione modello animale preclinico)17,18, traendo vantaggio dell'uso di un relativamente poco costoso imaging sistema prontamente disponibile in molte cliniche e centri di ricerca. Qui, ci mostrano che, utilizzando un sistema di ecocardiografia clinica, e aiutato da InI, un agente ampiame.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz e Manuel Molina per eccellente supporto fornito durante la raccolta dei dati e Carlos Bueno per fornire le cellule HEK-293 EGFP(+). Questo lavoro è stato supportato in parte dal: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spagna (JT) (concessione numero: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de I + D + I 2008-2011 (Grant no. RD12/0019/0001) (JMM), co-finanziato con fondi strutturali dell'Unione europea (FESR) (JMM); e, l'Università di Reading, Regno Unito (AG, GB) (finanziamento centrale). I finanziatori non avevano alcun ruolo ne....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ecografo HD11 XE | ecografico Philips | 10670267 | . |
| S12-4 | Philips | B01YgG | Trasduttore ad array di fase 4-12 MHz |
| Gel per trasmissione di ultrasuoni (Aquasone) | Parket laboratories Inc | N 01-08 | |
| Vasovet 24G | Braun | REF 381212 | catetere sopra l'ago |
| Omnifix-F siringa da 1 ml | Braun | 9161406V | |
| Imalgene (Ketamina) | Merial | RN 9767 | È necessaria la prescrizione veterinaria |
| Domtor (Medetomidina) | Esteve | CN 570686.3 | È necessaria la prescrizione veterinaria |
| Termoforo | |||
| Faber-Castel TG1 | Faber-Castel | 16 33 99 | India (Cina) Ink |
| Holter Syneflash | Ela medical | SF0003044S | sistema ECG Holter 24 ore. |
| Elettrodi Blue Sensor® | Elettrodi ECG Holter | Ambu (NUMED) | VLC-00-S |
| Microtomo | Leica Biosystems | RM2155 | |
| Microscopio | Olimpus | CO11 | |
| ABC Vector Laboratories | PK-6200 | Kit complesso di biotina Avidin. | |
| Anticorpo anti-GFP di pollo | Invitrogen | A10262 | Anticorpo primario. |
| Anticorpo IgG biotinilato capra-anti-pollo | Vector Laboratories | BA-9010 | Anticorpo secondario. |
| 3,30-diaminobenzidina tetracloridrato (DAB) | DAKO (Agilent) | S3000 | |
| Microscopio a fluorescenza | Carl Zeiss MicroImaging | Zeiss AX10 Axioskop | |
| Holter ECG | Elamedical | Syneflash SF0003044S | |
| Dulbecco' s Eagle medium modificato (DMEM) | Fisher Scientific | 11965084 | |
| 10% siero fetale di vitello (FCS) | Fisher Scientific 11573397 | ||
| 0,05% Tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Fisher Scientific | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 (Reagente di trasfezione lipidica) | Fisher Scientific | 11668019 | |
| Siero ridotto (Opti-MEM) | Fisher Scientific | ||
| Igromicina B | Calbiochem (MERCK) | 400051 | |
| Xilene (istologico) | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| Soluzione di perossido di idrogeno (H2O2) | Sigma | H1009 | |
| Pronasi | Fisher Scientific | 53-702-250KU |
Riferimenti
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
- Freyman, T., et al.
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Ristampe e permessi
