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Articolo metodologico

L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande

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DOI:

10.3791/56699

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21 gennaio 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cardiovascular and Metabolic Research, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 3Institute of Virology and Immunology (IVI), 4Departamento de Anatomía y Anatomía Comparada, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 5Unidad de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular, Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, IMIB, Universidad de Murcia

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Nuove strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa cardiaca richiedono studi estesi e dettagliati nei modelli animali preclinici grande prima che essi possono essere considerati per uso in esseri umani. Qui, dimostriamo una tecnica di iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto in conigli, che è importante per l'efficacia di tali terapie innovarici di verifica delle ipotesi.

Abstract

Terapia cellulare e genica sono interessanti e promettenti strategie ai fini della rigenerazione cardiaca nella cornice di insufficienza cardiaca con ridotta frazione di eiezione (HFrEF). Prima che possano essere considerati per l'uso e implementati in esseri umani, i vasti studi preclinici sono tenuti nei grandi modelli animali per valutare la sicurezza, l'efficacia e destino di injectate (ad es., cellule staminali) una volta consegnato nel miocardio. Piccoli roditore modelli offrono vantaggi (per esempio, costo-efficacia, disponibilità per manipolazione genetica); Tuttavia, dato le limitazioni intrinseche di questi modelli, i risultati in queste raramente si traducono in clinica. Al contrario, grandi modelli animali come conigli e presentano vantaggi (per esempio, elettrofisiologia cardiaca simile rispetto agli esseri umani ed altri animali di grandi dimensioni), pur mantenendo un buon equilibrio economico. Qui, dimostriamo come eseguire una tecnica di iniezione (IMI) intramiocardico ecocardiografia-guida percutanea contrasto, che è minimamente invasivo, sicuro, ben tollerato e molto efficace per la somministrazione mirata di injectates, compreso le cellule, in diverse posizioni all'interno del miocardio di un modello di coniglio. Per l'implementazione di questa tecnica, abbiamo anche approfittato di un sistema di ecocardiografia clinica ampiamente disponibili. Dopo aver messo in pratica il protocollo descritto qui, un ricercatore con conoscenza di base di ultrasuono diventerà competente nello svolgimento di questa tecnica mini-invasiva e versatile per uso sistematico negli esperimenti, volto alla sperimentazione di ipotesi del capacità di rigenerativa cardiaca terapeutica nel modello di coniglio. Una volta ottenuta la competenza, l'intera procedura può essere eseguita all'interno di 25 min dopo anestetizzante il coniglio.

Introduzione

Terapie geniche e cellulari sono emozionanti e mai lo sviluppo di strategie per la rigenerazione o la riparazione del miocardio danneggiato in HFrEF. Alcuni studi hanno confrontato l'efficacia (ad es., tasso di ritenzione delle cellule) delle diverse vie di consegna delle cellule, che hanno sempre dimostrato la superiorità dell'IMI sulle rotte per via endovenosa o intracoronary1,2 , 3 , 4 , 5. così, non sorprende che gran parte degli studi su modelli traslazionale della terapia cellulare del miocardio danneggiato, consegnare il injectate via IMI eseguita sotto visione diretta in un torace aperto procedura6,7 . Tuttavia, questo approccio presenta diverse limitazioni, tra cui la natura invasiva della procedura, che comporta il rischio di mortalità peri-procedurale (spesso sotto-segnalata)8. Inoltre, un IMI sotto visione diretta non elimina la possibilità per l'involontaria iniezione nella cavità ventricolare. Nella pratica clinica un IMI durante l'ambulatorio aperto della cassa potrebbe essere un metodo appropriato per la consegna di terapeutica delle cellule, per esempio, nel corso dell'arteria coronaria di bypass coronarico (CABG); Tuttavia, questo approccio potrebbe non essere appropriato per la consegna delle cellule in cardiomiopatia globale di origine non-ischemica (ad es., HFrEF secondario a cardiomiopatia indotta da antraciclina (AICM)).

Non c'è dubbio che la malattia cardiaca ischemica (IHD) è la causa più comune di HFrEF (~ 66%)9,10; tuttavia, cardiomiopatia non ischemica, tra cui AICM, colpisce ancora una percentuale significativa di pazienti con HFrEF (33%)9 . Infatti, recenti progressi in oncologia clinica hanno provocato più di 10 milioni i superstiti di cancro negli Stati Uniti da solo11, con stime di un numero simile in Europa, coerenza con una generale tendenza verso una migliore sopravvivenza dei malati di cancro12 ,13. Così, esplorare i benefici delle terapie innovarici come trapianto di cellule staminali per cardiomiopatia non ischemica, come pure la trialing di un percorso efficace e minimamente invasivo di cellule staminali consegna è della massima importanza, dato il crescente numero di pazienti influenzato dalla cardiotossicità secondaria a farmaci antitumorali.

Da notare, gli studi che utilizzano la terapia della cellula formativa con l'obiettivo di riparazione/rigenerare il miocardio danneggiato frequentemente di verifica delle ipotesi prevede l'utilizzo di piccoli roditori (ad es., topi e ratti). Questi modelli richiedono spesso costosi ad alta frequenza ultrasuoni per la valutazione della funzione del miocardio, solitamente dotata di trasduttori di allineamento lineare che hanno alcune limitazioni intrinseche associato (ad es., riverbero)14. Tuttavia, altri modelli come i conigli, che rappresenta un grande modello preclinico, avere alcuni vantaggi per test di ipotesi di terapie con cellule staminali in HFrEF. Così, contrariamente ai ratti e topi, conigli mantengono un sistema di trasporto di Ca+ 2 e di elettrofisiologia cellulare simile a quella degli esseri umani e altri animali di grandi dimensioni (ad esempio, cani e maiali)15,16,17 ,18,19. Un altro vantaggio, è la loro disponibilità per ecografia cardiaca imaging utilizzando relativamente poco costoso e l'ecocardiografia clinica ampiamente disponibili sistemi dotati di relativamente alta frequenza fase matrice trasduttori, per esempio, 12 MHz, come quelli frequentemente utilizzati in cardiologia pediatrica e neonatale. Questi sistemi consentono un'eccellente immagine ecocardiografica con tecnologia d'avanguardia, e sfruttano la superiorità di harmonic imaging20. Inoltre, test di ipotesi ricca di potenziale delle terapie rigenerative cardiache (ad es., terapia con cellule staminali), loro sicurezza, efficacia, cardiomiogenici potenziale, nonché valutazione del destino della per iniettato una volta immessa la miocardio, è obbligatorio prima di essi possono essere considerati per uso umano, e richiedono l'uso di grandi modelli animali preclinici, come ad esempio il coniglio17,19. Qui, descriviamo una tecnica mini-invasiva per la consegna delle cellule tramite ecocardiografia di contrasto percutanea guidata IMI utilizzando un sistema di ecocardiografia clinica, che si rivolge a terapia a base di trapianto della cellula formativa per cardiomiopatia non ischemica20 . Inoltre descriviamo i vantaggi dell'inchiostro di India (InI, noto anche come inchiostro di China) come un ultrasuono contrasto agente ed in situ dell'elemento tracciante di injectate nel cuore di coniglio.

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Protocollo

Gli esperimenti descritti nel presente documento sono stati approvati dal comitato etico di ricerca dell'Università di Murcia, Spagna e sono stati eseguiti in conformità con la direttiva 2010/63/UE della Commissione europea. Le operazioni descritte sono state eseguite sotto protocolli operativi standard che facevano parte del piano di lavoro e non sono stati effettuati esclusivamente allo scopo di filmare il video allegato al presente documento.

1. preparazione delle cellule e vettore di espressione dei mammiferi

Nota: Qui, descriviamo brevemente un protocollo per la preparazione e la transfezione di una linea cellulare (embrionali umane del rene 293 (HEK-293)); Tuttavia, specifici protocolli di cella appropriata per il tipo di cella di interesse dovrebbero essere ottimizzato (per esempio, cellule staminali).

  1. Mantenere le cellule HEK-293 in alto glucosio Dulbecco s modified esente Eagle (DMEM) completati con 10% siero fetale del vitello (FCS), piruvato di sodio 1%, 2 mM glutammina, 1% di penicillina/streptomicina e incubate a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% CO2 . Una volta che le cellule sono sub-confluenti, dividere con un rapporto di 1:3.
  2. Iniziare a spaccare le cellule aspirando i media, poi lavata una volta con fosfato sterile tampone salino (PBS), rimuovere l'eccesso di PBS e poi incubare con 2,5 mL di 0.5 x acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) (5 min, 37 ° C).
    1. Aggiungere un volume di media DMEM (completato come descritto sopra) per arrestare la reazione e poi staccare le cellule aspirando lentamente e delicatamente su e giù con una pipetta elettronica.
  3. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un apposito contenitore (ad esempio, provetta conica per centrifuga 15-50 mL). Centrifugare in un secchio di oscillazione (100 x g), scartare il surnatante e lavare la pallina due volte con PBS sterile.
  4. Risospendere il pellet in fresco DMEM media e seme ad una densità di cella appropriata (ad es., 1 x 106 cellule in una boccetta di2 cm 75) in matracci di cultura fresco o grandi piatti secondo le pratiche di laboratorio locale.
    1. Sostituire il supporto esistente con i media freschi ogni 2 giorni.
      Nota: Il vettore di espressione è stato derivato da pIRES1hyg e utilizzato secondo le istruzioni del produttore come descritto in precedenza21. p(EGFP) IRES1hyg è stato generato da subcloning EGFP cDNA come un BamHI + NotI inserire da pEGFP-N1 il BamHI + NotI digeriti pIRES1hyg21.
  5. 1 giorno prima della trasfezione, seme HEK-293 cellule ad una densità di 0.5 x 105 cellule/cm2 a 12 o a 24 pozzetti piastre di coltura del tessuto.
  6. Il giorno della transfezione, preparare complessi di reagente di transfezione DNA-lipidico in microcentrifuga separata 1,5 mL (1 tubo/pozzetto).
    1. Iniziamo con l'aggiungere 250 µ l di siero riduttore terreno in ogni provetta e quindi aggiungere 4 µ g del DNA (mescolare delicatamente).
    2. Successivamente, aggiungere 250 µ l da un mix precedentemente preparato di reagente di transfezione di 10 µ l del lipido e 250 µ l di siero riduttore terreno, ad ogni provetta (mescolare dolcemente).
    3. Infine, procedere con transfezioni, incubando le cellule HEK-293 con complessi di reagente di transfezione del lipido DNA per 4 h e quindi sostituire con medium DMEM completate come descritto in precedenza (punto 1.1) e incubare per un altro 48 h. Esegui selezione della droga della scuderia Transfectants con 100 µ g/mL igromicina B.
  7. Staccare le cellule HEK-293 con tripsina, come descritto in precedenza (punto 1.2). Dopo aver lavato le cellule in PBS sterile, risospendere in un veicolo adatto (per esempio, 10% v/v InI in PBS), per ottenere una concentrazione di cella finale di 5 x 106/ml.

2. preparazione del coniglio

Nota: Il posizionamento del coniglio e il trasduttore per l'IMI non è ottimo per valutare morfologia e funzione del cuore dell'animale. Pertanto, si consiglia di eseguire un esame ecocardiografico completo20 prima l'IMI (Vedi sotto) e a intervalli di tempo successivi, come definito dal disegno sperimentale. Questo mirerà a valutare le caratteristiche al basale anatomico e funzionale del cuore nell'animale che riceverà un'iniezione e valutare anche gli effetti, dell'IMI nella funzione del cuore.

  1. Eseguire questo esame in cieco e seguendo le linee guida del Comitato ecocardiografia dell'American College of Veterinary Internal Medicine e la società di ecocardiografia/europea associazione americana per l'Imaging cardiovascolare 22 , 23 , 24.
  2. Ottenere un analisi simultanea 1-piombo elettrocardiogramma (ECG) in tutto lo studio intero ecocardiografico.
  3. Anestetizzare il coniglio con ketamina 10 mg/kg, combinato con medetomidina 200 µ g/kg, iniezione intramuscolare (I.M.).
  4. Verificare il livello di anestesia dopo 10-20 min dopo la somministrazione dell'anestesia.
  5. Utilizzando un tagliatore di capelli rimuovere i peli del torace ampiamente (ad es., sotto il collo alla regione sub-xifoide) (Figura 1A).
  6. Radersi ulteriori regioni dell'1-2 cm,2 nella faccia interna dell'arto anteriore destro (regione mediocubital) e di entrambi gli arti posteriori (regione mediotibial) (Figura 1B).
  7. Posizionamento degli elettrodi ECG adesivi rasate regioni degli arti in modo sincrono monitorare il ritmo cardiaco durante la procedura (Figura 1).
  8. Metti l'animale in decubito supino su una coperta termica, con le membra Tesate utilizzando nastro chirurgico associato alla tabella (Figura 1).
    1. Assicurarsi che le orecchie sono flesso all'indietro dietro la testa/parte posteriore del coniglio e in una posizione che è inferiore agli arti anteriori, poiché questo aiuta a mantenere il corretto posizionamento del torace dell'animale durante tutta la procedura.
  9. Permettere all'animale di respirare spontaneamente, mentre la somministrazione di ossigeno dalla maschera di protezione durante l'intera procedura (100%, 2-3 L/min).

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Figura 1. Preparazione del coniglio per IMI. (A) Clip di capelli dal torace; (B) Clip capelli dalle membra; (C) collegare gli elettrodi e posizionare il coniglio con le gambe distese su una coperta termica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. percutanea contrasto IMI ecocardiografia-Guida tecnica nel coniglio

  1. Pulire e disinfettare la pelle del torace con una soluzione a base di clorexidina.
    1. Utilizzare una tecnica asettica durante tutta la procedura, secondo le migliori pratiche attuali.
    2. Quando possibile e se ragionevolmente possibile, eseguire una procedura completamente sterile, compresi, ma non limitato a, l'uso di materiale sterile, come abiti, guanti, ferite chirurgiche teli, materiale di medicazione sterile per la tabella, nonché un ultrasuono sterile copertura del trasduttore e gel per ultrasuoni sterile. Questo ridurrà al minimo il rischio di introdurre patogeni per l'animale riceve IMI ed è pratica standard in ambito clinico (ad es., durante la puntura cardiaca).
      Nota: Si consiglia di procedere sempre in linea con le norme locali e nazionali di ricerca animale applicabile all'ente locale e il paese di pratica.
  2. Applicare il gel per ultrasuoni trasmissione al torace e/o al trasduttore e con il cavo del trasduttore al collo dello sperimentatore, eseguire una scansione rapida finestra del cuore dell'animale, che è spesso utile visualizzare l'anatomia e per pianificare l'IMI.
  3. Posizionare il trasduttore manualmente presso lo spazio intercostaleth dith-6 4, 2-3 cm dalla linea parasternale destra con un angolo di incidenza di ~ 90 ° rispetto al lato destro della parete toracica (Figura 2A).
  4. Regolare la posizione del trasduttore rispetto lo spazio intercostale, nonché sua anteroposteriore e dorsoventral angolo per ottimizzare una vista modificate asse corto a livello dei muscoli papillari. Identificare in questa visualizzazione il ventricolo di destra (RV), ventricolo sinistro (LV), setto interventricolare (IVS), parete posteriore (PW), come pure anterolateral (AL) e muscoli papillare posteromedial (PM) (Figura 2B).
    1. Hanno un ampio campo di vista aumentando significativamente la profondità utilizzando il controllo appropriato sul sistema (ad esempio, pulsante, quadrante).
    2. Prestare particolare attenzione all'ottenimento di un'immagine simmetrica in questa vista, così come adeguata differenziazione dei contorni endocardial e dell'epicardio e, se necessario, regolare attraverso controlli di ottimizzazione di immagine (ad es., guadagno).
  5. Una volta che la visualizzazione ecocardiografica ottima si ottiene (Figura 2B), mantenere questa posizione per tutto il resto della procedura, mentre un secondo operatore esegue l'IMI (Vedi sotto).
    1. Tenendo il trasduttore, evitare di nascondere la tacca di orientamento del trasduttore, che dovrebbe sempre essere rivolto in avanti, permettendo così l'allineamento con l'ago nei passaggi successivi (Figura 2A, C).
  6. Con un ago 24 G attaccato ad una siringa da 1 mL, inserire l'ago vicino alla pelle del hemithorax di sinistra in posizione simmetrica del mirroring rispetto il trasduttore. Quindi, allineare manualmente l'ago con la tacca di orientamento del trasduttore con un angolo di ~ 90° (Figura 2) e far avanzare lentamente l'ago attraverso la pelle e nella cavità toracica.
    Nota: L'inserimento dell'ago percutaneo in questa posizione e l'orientamento facilita la visualizzazione dell'ago nel piano del fascio di ultrasuoni (Figura 2D, E), permettendo così il monitoraggio in tempo reale e, quando necessario, regolazione della la posizione dell'ago riguardante la regione di destinazione del miocardio (Figura 2, G, H).
  7. Con la punta nella posizione di destinazione, lentamente consegnare il injectate (fino a 0,25 mL per sito di inoculo) entro 10-30 s (Figura 2E), mentre lentamente e delicatamente ritrarre l'ago durante l'iniezione per aumentare la portata del miocardio trattati.
    1. Utilizzare InI 10% (v/v) diluito in PBS per la standardizzazione della tecnica e come un elemento tracciante in situ mentre l'acquisizione di competenza, anche quanto a confermare il successo di targeting di tutti i quattro siti IMI all'interno del miocardio da patologia lorda e istopatologia (Vedi Rappresentante risultati). Una volta ottenuta la competenza, InI potrebbe essere sostituito da un agente di contrasto di ultrasuono commerciale adatto se lo si desidera.
      Nota: Consegna del 10% (v/v) InI diluito in PBS con o senza cellule nel produce miocardio transmurale hyperechogenicity (cioè, aspetto brillante Eco) presso il sito di destinazione di iniezione (Figura 2E, F). Transitorio rallentamento o accelerazione della frequenza cardiaca, associata a contrazioni ventricolari premature (ad es., isolato, distici e terzine) sono frequentemente osservate anche dal primo contatto dell'ago con l'epicardio, nonché durante e/o poco dopo IMI. Tuttavia, nessuna aritmia pericolose sono sviluppate ed effetti avversi acuti sono osservati raramente utilizzando fino a 0,25 mL (1,25 x 106 cellule) di injectate per sito di inoculo di IMI (Vedi Rappresentante risultati e discussione).
  8. Eseguire cambiamenti sottili nell'angolo di incidenza dell'ago come necessario per completare le iniezioni di 0,25 mL di ciascuno dei quattro destinazione IMI siti (tre nella parte ventricolare di sinistra libera parete (LVFW) e una in IVS).
  9. Dopo aver completato la procedura IMI ecocardiografia-guida percutanea contrasto, valutare il ritmo cardiaco (ad es., tramite seriale ECG traccia e/o 24 h Holter ECG) ed eseguire scansioni ecocardiografiche finestra seriale per verificare l'assenza di complicazioni, fino a quando l'animale è completamente recuperato da anestesia e solo poi il trasferimento in una camera del ciclo di luce.
    1. Qui, usiamo 24 h Holter ECG per monitorare gli effetti dell'IMI con InI sul ritmo cardiaco per 24 h. Per questo, abbiamo confrontato un gruppo di 6 conigli con fenotipo normale (gruppo normale) e un gruppo di 6 conigli che hanno ricevuto la somministrazione endovenosa di doxorubicina (una cardiotossico delle antracicline droga, comunemente usata per il trattamento del cancro; Gruppo DOX) ad una dose di 2 mg/kg/settimana per 8 settimane e quindi entrambi coorti ricevuto IMI con InI.

figure-protocol-2
Figura 2 . L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto nel coniglio. (A) posizionamento del trasduttore nel giusto hemithorax ad un angolo di ~ 90 °. (B) immagine rappresentativa di una vista di asse corto parasternale (PSSX) del cuore a livello dei muscoli papillari nel coniglio. (C) allineamento dell'ago con un angolo di ~ 90 ° rispetto la tacca di orientamento del trasduttore. (D) posizione dell'ago nel sito di destinazione in una vista PSSX del cuore (Nota che l'ago è facilmente visualizzato nel piano del fascio di ultrasuoni). (E e F) dimostrazione di hyperechogenicity presso il sito di destinazione su iniezione intramiocardica con inchiostro di India (punte di freccia evidenzia il hyperechogenicity transmurale). (G) posizione accidentale dell'ago nella camera di LV (punte di freccia evidenziare l'albero dell'ago). (H) riposizionamento dell'ago per la parete libera di LV (punte di freccia evidenziare l'albero dell'ago). RV = ventricolo destro; LV = ventricolo sinistro; IVS = setto interventricolare; PW = parete posteriore; AL = muscolo papillare anterolateral; PM = muscolo papillare posteromedial. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. post IMI analisi

  1. Eseguire l'analisi istopatologica dei campioni di tessuto del cuore dai conigli.
    1. Difficoltà tessuto per 24 h in formaldeide al 10%, seguita da disidratazione con aumento delle concentrazioni di etanolo come segue:
      • 1 x a 70% (60 min)
      • 1 x 95% ethanol/5% metanolo (60 min)
      • 1 x a 100% (60 min)
      • 1 x a 100% (90 min)
      • 1 x a 100% (120 min)
      Nota: Tutte le incubazioni di cui sopra sono condotte a temperatura ambiente (TA). Quindi, sostituire due volte con 100% xilene (1h, RT) e infine incorporare in paraffina in due passaggi (60 min, 58 ° C)25.
    2. Eseguire 4-5 µm sezioni di tessuto con un microtomo25. Montare profili sulle diapositive.
    3. Eseguire la colorazione con ematossilina-eosina e Masson tricromica metodi25,26,27.
  2. In sezioni di tessuto trapiantati cuori, eseguire esame immuno-istochimico per rilevare le cellule HEK-293 EGFP(+) (ad es., utilizzando il metodo (ABC) complesso avidina-biotina), brevemente:
    1. De-cera sezioni di 4-5 µm spessore cuore 100% xilene (10 min, a RT). Reidratare il tessuto mediante lavaggio con la diminuzione della soluzioni di concentrazione di etanolo (2x in 100% (2 min); 2x in 95% (2 min); 1x in 70% (2min); 1 x in 50% (2 min); 1x in 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) a TA.
    2. Eseguire l'inibizione della perossidasi endogena coprendo le sezioni con 100 µ l del 3% H2O2 diluito in metanolo (preparato con 5 mL di soluzione di riserva del 30% di H2O2e l'aggiunta di metanolo fino ad un volume totale di 50 mL) ( Incubare 30 min, RT) e poi lavare per immersione con Tris buffered saline (TBS; pH 7,6).
    3. Eseguire antigene smascheramento tramite trattamento enzimatico, coprendo le sezioni con 100 µ l di 0,1% Pronase (preparato con 0,01 g Pronase diluito in 10 mL di TBS) (Incubare 12 min, RT), poi lavare con TBS (5 min, RT).
    4. Incubare in soluzione (siero di capra normale al 10% in TBS) di blocco utilizzando 100 µ l per far scorrere (30 min, RT) e lavare con TBS (5 min, RT).
    5. Incubare con proteine fluorescenti pollo anti-verde (GFP) come anticorpo primario (1: 500 in TBS) (1h e 30 ° C) e lavare con TBS (5 min, RT).
    6. Incubare con anticorpo secondario biotinilato capra-anti-pollo IgG (1: 250 in TBS) (1h e 30 ° C) e poi lavare con TBS (5 min, RT).
    7. Incubare con complesso avidina-biotina (20 min, 30 ° C) e quindi l'etichetta utilizzando tetrahydrochloride 3,30-diaminobenzidina (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Infine, disidratare mediante lavaggio con aumento delle concentrazioni di etanolo (1x nel 30% (2 min); 1 x in 50% (2 min); 1x in 70% (2min); 2x in 95% (2 min); 2x in 100% (2 min)) a RT, controcolorazione sezioni utilizzando il metodo di ematossilina-eosina25e poi montare coperchio diapositive. Sono positivi, negativi, così come controlli di isotipo.
      Nota: Il protocollo breve descritto sopra non è inteso per l'uso di immunohistochemistry generali; ottimizzazione per il tessuto di interesse e condizioni è necessario.

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Risultati

IMI di ecocardiografia-guida percutanea contrasto con InI:

Utilizzando il protocollo descritto sopra, e una volta che il posizionamento ottimale della punta dell'ago è stato confermato dall'ecocardiografia e l'iniezione ha avviato, il hyperechogenicity transmurale è stato osservato durante la consegna di InI (10% v/v in PBS) (Figura 2E) , così come poco dopo l'IMI alla regione di de...

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Discussione

L'obiettivo primario era quello di sviluppare una tecnica mini-invasiva che poteva essere utilizzata per la fornitura di cellule staminali nel miocardio di conigli (un grande dimensione modello animale preclinico)17,18, traendo vantaggio dell'uso di un relativamente poco costoso imaging sistema prontamente disponibile in molte cliniche e centri di ricerca. Qui, ci mostrano che, utilizzando un sistema di ecocardiografia clinica, e aiutato da InI, un agente ampiame...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz e Manuel Molina per eccellente supporto fornito durante la raccolta dei dati e Carlos Bueno per fornire le cellule HEK-293 EGFP(+). Questo lavoro è stato supportato in parte dal: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spagna (JT) (concessione numero: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de I + D + I 2008-2011 (Grant no. RD12/0019/0001) (JMM), co-finanziato con fondi strutturali dell'Unione europea (FESR) (JMM); e, l'Università di Reading, Regno Unito (AG, GB) (finanziamento centrale). I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ecografo HD11 XEecografico Philips10670267.
S12-4PhilipsB01YgGTrasduttore ad array di fase 4-12 MHz
Gel per trasmissione di ultrasuoni (Aquasone)Parket laboratories IncN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212  catetere sopra l'ago
Omnifix-F siringa da 1 mlBraun9161406V
Imalgene (Ketamina)MerialRN 9767È necessaria la prescrizione veterinaria
Domtor (Medetomidina)EsteveCN 570686.3È necessaria la prescrizione veterinaria
Termoforo
Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99India (Cina) Ink
Holter SyneflashEla medicalSF0003044Ssistema ECG Holter 24 ore.
Elettrodi Blue Sensor®Elettrodi ECG HolterAmbu (NUMED)VLC-00-S
MicrotomoLeica BiosystemsRM2155
MicroscopioOlimpusCO11
ABC Vector LaboratoriesPK-6200Kit complesso di biotina Avidin.
Anticorpo anti-GFP di polloInvitrogenA10262Anticorpo primario.
Anticorpo IgG biotinilato capra-anti-polloVector LaboratoriesBA-9010Anticorpo secondario.
3,30-diaminobenzidina tetracloridrato (DAB)DAKO (Agilent)S3000
Microscopio a fluorescenzaCarl Zeiss
MicroImaging		Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco' s Eagle medium modificato (DMEM) Fisher Scientific11965084
10% siero fetale di vitello (FCS)Fisher Scientific 11573397
0,05% Tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA)Fisher Scientific25300054
Lipofectamine 2000 (Reagente di trasfezione lipidica)Fisher Scientific11668019
Siero ridotto (Opti-MEM)Fisher Scientific
Igromicina BCalbiochem (MERCK)400051
Xilene (istologico)Fisher ScientificX3S-4
Soluzione di perossido di idrogeno (H2O2)SigmaH1009
PronasiFisher Scientific53-702-250KU
Sistema .31985070

Riferimenti

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
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