Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.
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Articolo metodologico
Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Atrofia geografica (GA), la fine della fase di degenerazione maculare senile secca è caratterizzata da perdita dello strato del pigmento retinico epiteliale (RPE), che conduce a degenerazione successiva delle strutture retiniche vitali (ad es., fotorecettori) causando gravi problemi visivi. Allo stesso modo, perdita di RPE e diminuzione dell'acuità visiva è visto in seguito a lungo termine di pazienti con avanzato wet età degenerazione maculare senile (AMD) trattati intravitreale anti-vascolare fattore di crescita endoteliale (VEGF). Pertanto, da un lato, è fondamentale in modo efficiente derivare cellule RPE da una fonte illimitata che potrebbe servire come terapia sostitutiva. D'altra parte, è importante valutare il comportamento e l'integrazione delle cellule derivate in un modello della malattia che comportano chirurgica e metodi di imaging come vicino possibile a quelle applicate negli esseri umani. Qui, forniamo un dettagliato protocollo basato su nostre pubblicazioni precedenti che descrive la generazione di un modello preclinico di GA utilizzando l'occhio di coniglio albino, per valutazione della cellula staminale embrionale umana derivate cellule epiteliali del pigmento retinico (hESC-RPE) in un impostazione clinicamente rilevante. Differenziato hESC-RPE sono trapiantate in occhi ingenui o con NaIO3-indotto GA-come degenerazione retinica utilizzando una tecnica di 25 G transvitreal pars plana. Valutazione delle zone degenerate e trapiantati viene effettuata da multimodale ad alta risoluzione imaging non-invasivo in tempo reale.
Introduzione
Questo protocollo descrive la generazione di un modello preclinico dagli occhi grandi di atrofia geografica (GA) che permette la valutazione dell'integrazione dei trapiantati hESC-RPE nello spazio subretinal. I metodi descritti in dettaglio qui sono stati utilizzati in 3 pubblicazioni recenti che illustrano la produzione di una popolazione arricchita, pura e funzionale di cellule RPE da hESC1, come pure la creazione di danno retinico esterno e un fenotipo simile a GA indotto tramite l'iniezione subretinal di soluzioni saline fisiologiche (cioè, BSS e PBS) o NaIO3 , occhio del coniglio2,
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Protocollo
Il seguente protocollo segue le indicazioni di cura degli animali di Karolinska Instituet. Tutti gli esperimenti su animali utilizzando Nuova Zelanda conigli albini (Tabella materiali) sono stati approvati dal comitato di etica animale regionale (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permesso: dnr 56/15). L'uso di hESC (dnr 2011/745-31/3) e il trasferimento e la manipolazione di hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) è anche secondo la legislazione svedese e i regolamenti del Karolinska Institutet ed è stato approvato dalla (Comitato regionale etica umana Regionala Etikprövningsnämnden ho Stoccolma).
1. subretinal iniezione di iod....
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Risultati
Rappresentante in vivo immagini di BAF, IR-cSLO e SD-OCT di una retina di coniglio albino normale sono indicate nella Figura 2. Notare i diversi strati della retina con i loro caratteristici livelli di riflessione della luce catturata dallo strumento SD-OCT.
Nelle figure 1A e 1B di figura, è illustrato il programma di installazione.......
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Discussione
In questo protocollo, la generazione di un modello di grandi occhi di GA e suo uso preclinico per valutare hESC-RPE integrazione in vivo è descritto.
Per la traduzione di terapie rigenerative per GA e malattie correlate nella clinica7, è importante sviluppare e ottimizzare metodi che acquisire fedelmente i metodi clinici per trapianto e di imaging. Il coniglio è in questo aspetto attraente: ha un occhio relativamente grande che permette l'ambulatorio intraocula.......
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori hanno interessi concorrenti o conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Karolinska Institute, Fondazione della Crown Princess Margareta per i non vedenti, la Fondazione di Jordan Edwin per ricerca oftalmologica, la Fondazione svedese di occhio, il re Gustav V Foundation, la ARMEC Fondazione di Lindeberg e la Fondazione di Cronqvist.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NutriStem hESC XF mezzo di differenziazione - bFGF e – TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS senza Ca2+ e Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Filtro cellulare 40 μ m Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Ago 30 G 0,5' ’; 0,3 mm x 13 mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25 mm Filtro per siringa | Acrodisc | PN4612 | |
| 0,4% tripano blu | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Utilizzare allo 0,2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminolo, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Utilizzare 35 mg/kg di ketamina |
| Rompun veterinario, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Utilizzare 5 mg/kg di xilazina |
| Triescenza, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | per via intravitaria |
| , 0,75% + 2,5% | APL | 321968 | Utilizzare 1 goccia in ciascun occhio |
| Viscotears | Laboratoires Thé a | 597562 | |
| soluzione salina topica | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Utilizzare 100 mg/mL di pentobarbital |
| Tubo di prolunga (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25 G/38 G cannula sottoretinica | polytip MedOne Surgical Inc | 3219 | 25 G/38 G |
| Lente piatta monouso | Volk | ||
| Divaricatore per coperchi Barraquer Colibri | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Trocar senza valvola | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Pinze artigliate | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Macchina per vitrectomia | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomia TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| dispositivo SD-OCT | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Utilizzare Heidelberg Eye Explorer versione 1.9.10.0 |
| piastre a 24 pozzetti | Sarstedt | 83.3922 | |
| Emocitometro Neubauer | VWR | 631-0925 | |
| Conigli albini della Nuova Zelanda | Lidkö pings Rabbit Farm, Svezia | ||
| hESC-RPE | Vedere il numero di riferimento 1 | ||
| Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml | Dechra | 660500 | Utilizzare 0,5 mL di buprenorfina per via sottocutanea |
Riferimenti
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al.
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Ristampe e permessi
