Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

Sommario

Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.

Abstract

Atrofia geografica (GA), la fine della fase di degenerazione maculare senile secca è caratterizzata da perdita dello strato del pigmento retinico epiteliale (RPE), che conduce a degenerazione successiva delle strutture retiniche vitali (ad es., fotorecettori) causando gravi problemi visivi. Allo stesso modo, perdita di RPE e diminuzione dell'acuità visiva è visto in seguito a lungo termine di pazienti con avanzato wet età degenerazione maculare senile (AMD) trattati intravitreale anti-vascolare fattore di crescita endoteliale (VEGF). Pertanto, da un lato, è fondamentale in modo efficiente derivare cellule RPE da una fonte illimitata che potrebbe servire come terapia sostitutiva. D'altra parte, è importante valutare il comportamento e l'integrazione delle cellule derivate in un modello della malattia che comportano chirurgica e metodi di imaging come vicino possibile a quelle applicate negli esseri umani. Qui, forniamo un dettagliato protocollo basato su nostre pubblicazioni precedenti che descrive la generazione di un modello preclinico di GA utilizzando l'occhio di coniglio albino, per valutazione della cellula staminale embrionale umana derivate cellule epiteliali del pigmento retinico (hESC-RPE) in un impostazione clinicamente rilevante. Differenziato hESC-RPE sono trapiantate in occhi ingenui o con NaIO₃-indotto GA-come degenerazione retinica utilizzando una tecnica di 25 G transvitreal pars plana. Valutazione delle zone degenerate e trapiantati viene effettuata da multimodale ad alta risoluzione imaging non-invasivo in tempo reale.

Introduzione

Questo protocollo descrive la generazione di un modello preclinico dagli occhi grandi di atrofia geografica (GA) che permette la valutazione dell'integrazione dei trapiantati hESC-RPE nello spazio subretinal. I metodi descritti in dettaglio qui sono stati utilizzati in 3 pubblicazioni recenti che illustrano la produzione di una popolazione arricchita, pura e funzionale di cellule RPE da hESC¹, come pure la creazione di danno retinico esterno e un fenotipo simile a GA indotto tramite l'iniezione subretinal di soluzioni saline fisiologiche (cioè, BSS e PBS) o NaIO₃ , occhio del coniglio^2,3. Abbiamo ulteriormente dimostrato che trapianti di sospensione sub-retinico di hESC-RPE formano monostrati vasti funzionali con fotorecettore soccorso capacità².

Diversi vantaggi accompagnano l'uso dell'occhio di coniglio per la generazione di un modello di GA di malattia. In primo luogo, la dimensione dell'occhio di coniglio, che è del 70% il volume di un occhio umano adulto, consente il trapianto clinicamente significativo usando una densità di cella che è molto inferiore di quanto abitualmente utilizzati per occhi piccoli roditori (1.000 cellule / µ l vs 50.000 cellule / µ l)^{4 , 5}. in secondo luogo, chirurgia nei roditori è di solito transscleral attraverso la coroide, che compromette la barriera della retina e potenzialmente attiva una risposta infiammatoria e un eventuale rifiuto⁶. Entrambi fattori insieme possono portare a multilayering e aggregazione delle cellule trapiantate e un'integrazione nel complesso scadente delle cellule trapiantate in un tessuto retinico nativo perturbato. Tuttavia, il modello di coniglio dagli occhi grandi consente di effettuare una tecnica chirurgica con strumentazione identica a una regolazione clinica. In terzo luogo, un modello di grandi dimensioni-eyed consente anche ad alta risoluzione in vivo imaging e monitoraggio delle cellule trapiantate e la retina sovrastante attraverso tempo^1,2,3. Così, descriviamo un modello preclinico clinicamente rilevante e costo-efficiente che dovrebbe essere un'alternativa attraente ai roditori per chiunque con un interesse nella ricerca della retina normale e malata e lo spazio sub-retinico.

Protocollo

Il seguente protocollo segue le indicazioni di cura degli animali di Karolinska Instituet. Tutti gli esperimenti su animali utilizzando Nuova Zelanda conigli albini (Tabella materiali) sono stati approvati dal comitato di etica animale regionale (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permesso: dnr 56/15). L'uso di hESC (dnr 2011/745-31/3) e il trasferimento e la manipolazione di hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) è anche secondo la legislazione svedese e i regolamenti del Karolinska Institutet ed è stato approvato dalla (Comitato regionale etica umana Regionala Etikprövningsnämnden ho Stoccolma).

1. subretinal iniezione di iodato di sodio (NaIO₃) in un modello animale di gran-eyed

1. Anestetizzare gli animali di somministrazione intramuscolare nella coscia con una miscela di 35 mg/kg ketamina e 5 mg/kg xylazina in Salina usando una siringa da 30 G, e dilatare le pupille con colliri topici utilizzando un mix di 0,75% di Ciclopentolato e 2,5% di fenilefrina. Amputate corretta è confermato se l'animale non reagisce a un pizzico duro della zampa posteriore.
2. Posizionare il coniglio sotto il microscopio chirurgico con la testa rivolta verso il chirurgo (Figura 1A). Utilizzare un riavvolgitore di coperchio per rimuovere le palpebre e nictitans membrana con un panno sterile per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Uso equilibrato di soluzione salina (BSS) per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia in entrambi gli occhi.
3. Per microchirurgia, uso una porta 2 (o 3-porta opzionale) 25 G transvitreal pars plana tecnica con trocar non valvolato per l'inserimento di microsurgical strumenti (Figura 1B). La macchina multifunzione vitrectomia ha porte per collegare una cannula infusione endoilluminazione, vitrector ed endolaser. Per preparazioni iniettabili subretinal, solo l'endoilluminazione è obbligatoria, che rende un set-up 2 porte sufficiente. Inserire il endoillumation attraverso il trocar sinistro superiore e utilizzare il trequarti destro superiore per la cannula iniezione subretinal.
   1. Per un set-up di 3-porta, utilizzare il trocar temporale inferiore per la cannula di infusione di BSS. Se gli strumenti opzionali (ad esempio un vitrector) sono utilizzati, inserirli attraverso il trocar di destro superiore.
   2. Inserire il 2 trocar superiore 1-2 mm dal limbus utilizzando artigliate pinze per afferrare e spostare la congiuntiva che ricopre il sito di inserimento.
   3. Assicurarsi che il trocar sono inseriti transsclerally ad un angolo di 30-45° limbus parallela e procedere verso il centro della punta del trocar. Poi girare il trocar 90° e avanzare nell'occhio, che mira al polo posteriore dell'occhio. Questa procedura sarà evitare perdite post-chirurgica dalla sclerotomies e anche diminuire il rischio di endoftalmite (cioè, infezione batterica nell'occhio). Vedi anche Figura 2B per le posizioni di trocar.
   4. Mettere una lente a contatto monouso piatto sulla cornea di visualizzare la retina, con le lacrime sintetiche come gel di contatto tra l'occhio e la lente a contatto (Figura 1A).
   5. Disegnare 500 µ l di NaIO₃ in una siringa da 1 mL, collegato ad un tubo di prolunga (operato dall'assistente) e una cannula di polytip 38 G (operati dal chirurgo).
   6. Inserire la sonda endoilluminazione attraverso il trocar di sinistra superiore e la cannula di iniezione attraverso il trocar di destra superiore e fare avanzare la cannula attraverso lo spazio vitreo verso la retina, con l'obiettivo per la zona appena sotto la testa del nervo ottico.
   7. Permettere che la punta della cannula lentamente toccare la retina fino a quando uno sbiancamento focale è visibile. L'iniezione stessa penetrerà la retina, permettendo per consegna subretinal. Non lasciare che la cannula penetrare la retina, poiché ciò potrebbe causare l'emorragia.
   8. Iniettare 50 µ l di NaIO₃ subretinally su un periodo di 5 s. Poiché c'è un aereo di fenditura naturale fra la retina e della coroide sottostante, una vescichetta semitrasparente chiaramente visibile dovrebbe formare gradualmente durante l'iniezione.
   9. Durante l'iniezione, lentamente, ritirare l'ago, ma assicurarsi che la punta sia mantenuta entro la vescichetta per minimizzare il reflusso.
   10. Dopo la rimozione della cannula endoillumation e iniezione, rimuovere il trocar usando il forcipe artigliato e applicare una leggera pressione per 30 s per il sclerotomies di sutura-meno autosigillante usando la punta o l'estremità smussata delle pinze.
4. Cappetta dare 10 mL di soluzione fisiologica per via sottocutanea per prevenire la disidratazione. Non do post-chirurgici steroidi topici o antibiotici. Per gli analgesici dare 0,5 mL di buprenorfina 0,3 mg/ml per via sottocutanea dopo l'intervento, come pure il giorno dopo l'intervento chirurgico.
5. Dopo l'uso, lavare tutti gli strumenti, immergerli per un paio di secondi in primo luogo in etanolo al 70%, in secondo luogo in etanolo al 45% e infine in acqua distillata. Asciugarli correttamente con un tovagliolo di carta.
6. Frequentare gli animali fino a che riprenda conoscenza sufficiente e metterli tutti singolo ingabbiato. Se necessario (ad esempio, per scopi di immunoistochimica), eutanasia animali tramite iniezione endovenosa di 100 mg/kg pentobarbital (Vedi Tabella materiali).
7. Attendere 7 giorni per procedere con il trapianto di cellule hESC-RPE.

2. subretinal trapianto di cellule hESC-RPE in animali trattati

1. Somministrare 2 mg (100 µ l) di triamcinolone intravitreal in animali anestetizzati utilizzando un ago per iniezione 30g inserito 1-2 mm dal limbus nel quadrante temporale inferiore 1 settimana prima del trapianto di CSE-RPE e ri-amministrarlo ogni 3 mesi. Assicurarsi di puntare la punta verso il polo posteriore dell'occhio per evitare un tocco di lente.
2. Un monostrato hESC-RPE come descritto in precedenza¹della coltura.
3. Media di differenziazione delle cellule (Vedi Tabella materiali), di un monostrato confluente 24 pozzetti hESC-RPE di rimuovere e lavare ogni bene con 500 µ l di PBS senza Ca^{2 +} e Mg^{2 +}. Ripetere questa azione ancora una volta, per un totale di 2 lavaggi.
4. Eliminare il surnatante, aggiungere 500 µ l di tripsina ogni pozzetto e incubare per 12 min a 37 ° C.
5. Inclinare il piatto e rimuovere con cautela la tripsina (celle devono rimanere agganciate alla piastra). Raccogliere le cellule in 800 µ l di fresco 37 ° C preriscaldati differenziazione media pipettando delicato, o raschiare anche se necessario, per ottenere una sospensione di singola cellula.
   Nota: Utilizzare un colino di cella di 40 µm se si osservano cellule ciuffi.
6. Numero di celle in una camera di un emocitometro usando 0.2% Trypan Blue, secondo le istruzioni del produttore.
7. Aggiungere 5 mL di differenziazione le cellule di media e centrifuga a temperatura ambiente, 300 x g per 5 min.
8. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in PBS appena sterilizzati con filtro (passato attraverso un filtro per siringa 25 mm) a una concentrazione finale di 1.000 cellule / µ l.
9. Aliquotare la precedente sospensione cellulare in 600 µ l aliquote e tenere il ghiaccio fino a e durante la chirurgia.
10. Anestetizzare gli animali di somministrazione intramuscolare nella coscia con una miscela di 35 mg/kg ketamina e 5 mg/kg xylazina salina utilizzando una siringa di 30 G. Dilatare le pupille con i eyedrops d'attualità usando amix di 0,75% di Ciclopentolato e 2,5% di fenilefrina. Amputate corretta è confermato se l'animale non reagisce a un pizzico duro nella sua gamba posteriore.
11. Posto il coniglio con la testa rivolta verso il chirurgo. Utilizzare un riavvolgitore di coperchio per rimuovere le palpebre e nictitans membrana con un panno sterile per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Utilizzare BSS per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia in entrambi gli occhi.
12. Per microchirurgia, uso una porta 2 (o 3-porta opzionale) 25 G transvitreal pars plana tecnica con trocar posizionato nella stessa posizione come descritto al punto 1.3 e Figura 2. Se il sclerotomies precedente sono visibili, eseguire inserimento trocar appena adiacente, ma non attraverso questi, per ridurre al minimo il rischio di perdita postoperatoria.
    1. Mettere una lente a contatto monouso piatto sulla cornea di visualizzare la retina, con le lacrime sintetiche come il gel di contatto tra l'occhio e la lente a contatto (Figura 1A).
    2. Dopo Punta corretto posizionamento (Vedi i passaggi 1.3.5 e 1.3.6), iniettare 50 µ l di una sospensione delicatamente miscelato hESC-RPE (50.000 cellule) subretinally. Obiettivo per il centro della zona di₃ pretrattati NaIO distinto da un riflesso di caratteristici "metallico" endo-illuminazione. La retina neurosensoriale dovrebbe separare facilmente creando una vescichetta chiaramente visibile. Filo dell'ago con sterile di H₂O tra conigli/dopo utilizzare per evitare ago intasamento grazie alla cella ciuffi. Cambia l'ago quando intasamento è notato.
    3. Durante l'iniezione, lentamente di ritrarre l'ago ma assicurarsi che la punta sia mantenuta entro la vescichetta per minimizzare il reflusso.
    4. Dopo la rimozione della cannula endoillumation e iniezione, rimuovere il trocar usando il forcipe artigliato e applicare una leggera pressione per 30 s per il sclerotomies di sutura-meno autosigillante usando la punta o l'estremità smussata delle pinze.
13. Cappetta dare 10 mL di soluzione fisiologica per via sottocutanea per prevenire la disidratazione. Non do post-chirurgici steroidi topici o antibiotici. Per gli analgesici dare 0,5 mL di buprenorfina 0,3 mg/ml per via sottocutanea dopo l'intervento, come pure il giorno dopo l'intervento chirurgico.
14. Dopo l'uso, lavare tutti gli strumenti, immergerli per un paio di secondi, in primo luogo in etanolo al 70%, in secondo luogo in etanolo al 45% e infine in acqua distillata. Asciugarli correttamente con un tovagliolo di carta.
15. Frequentare gli animali fino a che riprenda conoscenza sufficiente e metterli tutti singolo ingabbiato. Se necessario (ad esempio per scopi di immunoistochimica), eutanasia animali tramite iniezione endovenosa di 100 mg/kg pentobarbital.

3. in Vivo della retina e Subretinal Imaging

1. Utilizzare un dispositivo di (SD-OCT) la tomografia ottica di coerenza dominio spettrale con il software in dotazione (Vedi tabella materiali) per ottenere a sezione trasversale b-scansioni degli animali trattati, secondo le istruzioni del produttore. Per evitare la sfocatura dell'immagine, assicurarsi di mantenere umida la cornea irrigando con soluzione fisiologica topico ogni 30-60 s.
   1. Sistemare gli animali anestetizzati e pupilla dilatata (vedere i passaggi 1.1 e 2.10) in un supporto regolabile per ottenere un percorso senza ostacoli dalla sorgente di luce strumento alla retina di coniglio.
   2. Ottenere almeno 3 OCT scansioni con oftalmoscopia laser infrarosso-confocale simultanea scansione immagini di riferimento di riflettanza (IR-cSLO) che rappresenta la parte superiore, centrale e inferiore del sito di inoculo.
   3. Ottenere immagini del fondo it-viso con cSLO blu, verde, infrarossi e multicolor laser riflettanza (cioè, più colori laser simultanea), rispettivamente.
   4. Catturare immagini di autofluorescence luce blu (BAF) utilizzando la funzionalità blu-luce laser del dispositivo SD-OCT.

Risultati

Rappresentante in vivo immagini di BAF, IR-cSLO e SD-OCT di una retina di coniglio albino normale sono indicate nella Figura 2. Notare i diversi strati della retina con i loro caratteristici livelli di riflessione della luce catturata dallo strumento SD-OCT.

Nelle figure 1A e 1B di figura, è illustrato il programma di installazione...

Discussione

In questo protocollo, la generazione di un modello di grandi occhi di GA e suo uso preclinico per valutare hESC-RPE integrazione in vivo è descritto.

Per la traduzione di terapie rigenerative per GA e malattie correlate nella clinica⁷, è importante sviluppare e ottimizzare metodi che acquisire fedelmente i metodi clinici per trapianto e di imaging. Il coniglio è in questo aspetto attraente: ha un occhio relativamente grande che permette l'ambulatorio intraocula...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NutriStem hESC XF mezzo di differenziazione - bFGF e – TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS senza Ca2+ e Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Filtro cellulare 40 μ m Nylon	VWR	732-2757
Ago 30 G 0,5' ’; 0,3 mm x 13 mm	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 mm Filtro per siringa	Acrodisc	PN4612
0,4% tripano blu	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	Utilizzare allo 0,2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% Ethanol	Solveco AB	1047
Ketaminolo, 100 mg/mL	Intervet, Boxmeer	511519	Utilizzare 35 mg/kg di ketamina
Rompun veterinario, 20 mg/mL	Bayer Animal Health	22545	Utilizzare 5 mg/kg di xilazina
Triescenza, 40 mg/mL	Alcon Nordic A/S	412915	per via intravitaria
, 0,75% + 2,5%	APL	321968	Utilizzare 1 goccia in ciascun occhio
Viscotears	Laboratoires Thé a	597562
soluzione salina topica	Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL	Omnidea	77168	Utilizzare 100 mg/mL di pentobarbital
Tubo di prolunga (Hammer)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G cannula sottoretinica	polytip MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
Lente piatta monouso	Volk
Divaricatore per coperchi Barraquer Colibri	AgnTho's AB	42-020-030
Trocar senza valvola	Alcon Nordic A/S	8065751448
Pinze artigliate	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS Macchina per vitrectomia	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomia TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
dispositivo SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	Utilizzare Heidelberg Eye Explorer versione 1.9.10.0
piastre a 24 pozzetti	Sarstedt	83.3922
Emocitometro Neubauer	VWR	631-0925
Conigli albini della Nuova Zelanda	Lidkö pings Rabbit Farm, Svezia
		hESC-RPE	Vedere il numero di riferimento 1
Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml	Dechra	660500	Utilizzare 0,5 mL di buprenorfina per via sottocutanea