Articolo metodologico

Distinzione simultanea di monospecifici e modelli misti DFS70 durante lo Screening di ANA con un substrato romanzo HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout

DOI:

10.3791/56722

⸱

17 gennaio 2018

 , 
1Research & Development, Immco Diagnostics, A Trinity Biotech Company

In questo articolo

Sommario

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Gli autoanticorpi DFS70 imitano modelli comuni di malattia-collegati di anticorpo antinucleare rendendo interpretazione accurata impegnativo quando si utilizzano substrati convenzionali di HEp-2. Il protocollo descrive vantaggi di substrato di HEp-2 derivati dal romanzo su convenzionale HEp-2 a ANA screening e distinguere modelli DFS70 con elevata fiducia sia monospecifici e misti casi positivi di ANA.

Abstract

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Sistemica del tessuto connettivo autoimmuni è caratterizzato da anticorpi antinucleari (ANA). Anche se ci sono diverse tecnologie disponibili per lo screening di ANA, immunofluorescenza indiretta (IIF) usando umano epiteliale cellule-2 (HEp-2) substrato rimane il metodo principale e consigliato a causa della sua sensibilità superiore. Substrati HEp-2 in grado di rilevare una moltitudine di modelli derivanti dall'associazione di autoanticorpi per varie proteine e acidi nucleici autoantigeni distribuiti in tutto il nucleo ed il citoplasma delle cellule. La grande diversità di monospecifici e modelli misti derivanti da reazioni positive su substrato di HEp-2 anche complicare l'interpretazione e l'accuratezza della segnalazione. Un esempio specifico che ha recentemente ricevuto massima attenzione è il denso bene maculato 70 (DFS70) modello risultante da autoanticorpi che legano specificamente ad una proteina chiamata fattore di crescita dell'epitelio derivato lente (LEDGF). Mancanza di chiara associazione con una malattia autoimmune sistemica specifica e alta prevalenza in popolazioni sane hanno reso importante interpretazione accurata del modello DFS70. Distinzione esatta del modello DFS70 da pattern associati malattia utilizzando convenzionale substrato di HEp-2 è una sfida. Inoltre, la frequente co-occorrenza di pattern di DFS70 insieme a modelli di malattia-collegati come omogenea, macchiati e misto pattern omogeneo-macchiata complicano l'interpretazione di IIF. L'obiettivo di questa carta è di dimostrare che l'utilità di un romanzo progettato substrato di HEp-2 IIF che mantiene tutti i vantaggi di substrato di HEp-2 convenzionale fornendo al contempo la capacità di distinguere il modello DFS70 con elevata fiducia in entrambi monospecifici e misti esempi positivi di ANA. Il nuovo substrato ulteriore è in grado di smascherare i pattern degli ANA malattia-collegati in precedenza nascosto da DFS70 modello.

Introduzione

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ANAs sono un segno distintivo del tessuto connettivo autoimmuni sistemica mediata malattie1. Diversi metodi sono impiegati per lo screening e conferma dell'ANAs. Tecnica IIF utilizzando resti di substrato di HEp-2 il più ampiamente usato e spesso si consiglia di metodo per lo screening di ANAs1,2. Malgrado gli avanzamenti nelle metodologie di analisi diagnostica di fase solida come analisi dell'immunosorbente collegata enzima (ELISA), dosaggio immunoenzimatico (EIA), immunoassay di chemiluminescenza (CLIA) e analisi multiplex tallone-based, IIF di HEp-2 è la proiezione più prevalente Metodo per la sua utilità diagnostica e costo efficacia1,2,3. Le tecnologie di analisi suddette si basano su un insieme limitato di nativo purificato o autoantigeni ricombinanti, considerando che la preparazioni di monostrato di cellule HEp-2 sui pozzi di diapositive di vetro presentano una vasta gamma di autoantigeni nella loro forma naturale, distribuiti tra il nucleo ed il citoplasma, che reagiscono con i autoantibodies da sieri dei pazienti o controlli positivi, risultante in una moltitudine di modelli che sono associati con varie patologie autoimmuni. Questi modelli sono classificati in nucleare e citoplasmatiche mitotiche modelli sulla base della posizione dell'antigene nelle cellule. Ogni modello e l'antigene associati/antigeni e Stati di malattia sono ben caratterizzati4. Nel metodo IIF, paziente e controllo i sieri vengono incubati sui pozzi di diapositive di vetro che presentano una cultura dello strato monomolecolare delle cellule HEp-2 adeguatamente fissate a preservare una moltitudine di autoantigeni nella loro configurazione naturale. Gli autoanticorpi nel siero del paziente o controlli positivi possono associare ai autoantigens presentato da cellule HEp-2 sul substrato (vetrino ben) durante l'incubazione. Post incubazione, gli anticorpi non legati vengono lavati via e associati anticorpi della classe IgG vengono rilevati con anti-umani di fluoresceina/fluoresceina isotiocianato (FITC) coniugato IgG reagente. Riferito-coniugato non legato viene lavato via e le lamelle di vetro sono montate sopra le diapositive utilizzando un mezzo di montaggio che mantiene le reazioni e facilita l'osservazione sotto un microscopio a fluorescenza. Le reazioni sono osservate con un microscopio a fluorescenza equipaggiato con combinazione di filtro appropriato eccitazione-emissione è configurato secondo il reporter utilizzato (per reporter FITC, un microscopio diagnostico in genere utilizza filtri con gamma di eccitazione di 467 -498 nm e un intervallo di emissione di 513-556 nm). La presenza di ANA è dimostrata da una brillante fluorescenza verde delle strutture specifiche nelle cellule. A differenza delle piattaforme di test automatizzato, metodologia IIF si basa sul laborioso processo di seriale diluire i sieri e i visual determinazione positiva di pattern di colorazione che richiede utente significative competenze5,6. Nonostante queste limitazioni, IIF di HEp-2 rimane il più utilizzato e consigliato metodo per lo screening dell'ANAs a causa degli sforzi di standardizzazione verso nomenclatura e interpretazione del pattern dal consenso internazionale su ANA Comitato modelli (ICAP), maggiore disponibilità di soluzioni di automazione per l'elaborazione di diapositiva IIF e risultato interpretazione3.

Tra la moltitudine di modelli rilevato con il metodo di HEp-2 IIF, autoanticorpi targeting per il prodotto del gene psip1 (noto anche come LEDGF/p75/DFS70), hanno acquisito notevole interesse negli ultimi anni per vari motivi4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 autoanticorpi sono presenti in alti titoli nei comandi sani, e studi finora non sono riuscito a dimostrare un'associazione clinica distinta per la presenza di DFS70 autoanticorpi7,8,9 ,10,11,12,13. Le tariffe di segnalati risultati positivi per gli autoanticorpi DFS70 in vari Stati di malattia e sani coorti variate ampiamente tra gli studi6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Il modello monospecific DFS70 è ben differenziato da un modello omogeneo o macchiato ma interpretazione di modelli misti omogeneo-macchiata e anticorpi anti-DFS70 co-che si verificano con altri ANAs è impegnativo anche per i lettori esperti. L'attuale generazione di IIF DFS70 fase solida specifici dosaggi e metodi di screening non è in grado di differenziare un monospecific DFS70 reazione da modelli misti (Figura 1A, area gialla ombreggiata dell'algoritmo). Errata interpretazione del modello di DFS70 come omogenea, maculato, o modello misto o viceversa, può avere gravi implicazioni sulla cura del paziente. L'attuale protocollo comunemente utilizzato è il seguente: i laboratori clinici impiegano un numero di test di conferma in fase solida per ANAs malattia-collegati e/o un metodo di immunoadsorption per DFS70/LEDGF quando belle denso puntinato modello (AC-2) è ritenuta sospetto (Figura 1a)4,5.

L'obiettivo del presente protocollo è quello di dimostrare l'utilità di un romanzo progettato substrato HEp-2 IIF (HEp-2 ELITE/DFS70 knockout (KO), sarà essere denominati HEp-2 ELITE) che conserva tutti i vantaggi di HEp-2 convenzionali per lo screening di ANAs mentre simultaneamente distinguere DFS70 modello con elevata fiducia monospecific sia misto ANA casi positivi (Figura 1B, area gialla ombreggiata dell'algoritmo)5. Substrato di HEp-2 ELITE è composto da una miscela approssimativa di cellule HEp-2 convenzionali non modificate e cellule ingegnerizzate privo di antigene LEDGF/p75/DFS70 in rapporto 1:95. La procedura IIF per ELITE HEp-2 è identica al metodo convenzionale di HEp-2. La configurazione unica del substrato di HEp-2 ELITE non solo conserva tutti i vantaggi di HEp2 convenzionale ma può differenziare modelli omogenei, macchiati e misto di reazione dal reticolo di DFS70 allo screening iniziale o analisi di un campione (Figura 1B )5. I sieri dei pazienti per essere reagito su vetrini con substrato di HEp-2 IIF dovrebbero essere diluito 01:40 con diluizione di screening o secondo il criterio di laboratorio individuale. Una specifica reazione alle 01:40 o più alto titolo è considerata positiva.

In questo studio, i sieri positivi per omogeneo, maculato, centromero, nucleolare, citoplasmico reticolare/AMA e i pattern di DFS70 che ha prodotto un segnale positivo medio (riguardante il controllo negativo e positivo controllo ANA fornito dal kit) allo screening diluizione di 01:40 sono stati selezionati per simulare i modelli mono-specifici e misti su substrati HEp-2 (convenzionali ed ELITE HEp-2). Il 01:40 diluito DFS70 sieri positivi sono stati mescolati con 01:40 diluizioni di singole associati a malattia ANA pattern controlli (omogeneo, punteggiato, centromero, nucleolare, o citoplasmatica reticolare-AMA) in vari rapporti (controllo: DFS70 a 100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 e 0:100) e valutati su convenzionale e substrati HEp-2 ELITE seguendo la procedura standard di IIF descritta di seguito.

Protocollo

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Il protocollo segue le linee guida del comitato etico di Trinity Biotech ricerca umana istituzionale.

1. campione e preparazione del substrato

  1. Consentire sacchetti contenenti vetrini (vetro diapositive con 12 pozzi su ogni diapositiva che contiene HEp2 o HEp-2 + HEp2 KO miscela di cella) per stabilizzare a temperatura ambiente per ottenere prestazioni ottimali ed evitare la condensa di umidità sulla superficie del vetrino prima dei Aggiunta del campione. Questo dovrebbe richiedere approssimativamente tra 10-15 min.
  2. Una volta equilibrati a temperatura ambiente, rimuovere delicatamente i vetrini usando le dita senza che tocchino i lati del sacchetto.
  3. Marcare i vetrini e metterli in una camera di incubazione (a temperatura ambiente) foderato con carta assorbente inumiditi con acqua per evitare l'essiccazione di diapositive durante campione e incubazione del coniugato.
    Nota: Colorazione aspecifica può derivare da pozzi asciutti; un tovagliolo di carta bagnato all'interno della camera di incubazione fornisce umidità e previene la secchezza bene.

2. aggiunta di controlli e campioni

  1. Versare circa 50 µ l dei controlli negativo/positivo, combinazioni di sieri positivi DFS70-ANA come descritto in questo studio, o in campioni di siero del paziente sui pozzi di singola diapositiva.
  2. Dispensare controlli e campioni in ogni pozzetto sulla diapositiva.
  3. Per evitare la contaminazione incrociata bene, evitare di riempire eccessivamente i pozzetti. Mentre non riempire eccessivamente pozzi, garantire una copertura completa della superficie ben ed evitare bolle d'aria.
    Nota: Il volume consigliato è 50 µ l secondo passaggio 2.1.
  4. Mettere il coperchio sulla camera umida ed incubare i vetrini per 30 min a temperatura ambiente. Se c'è qualsiasi ANA presenti nel siero del paziente, esso si lega alle cellule presenti in ciascun pozzetto durante questo periodo di incubazione.
  5. Una volta terminato il periodo di incubazione, rimuovere il vetrino dalla camera umida. Tenere la diapositiva nella scheda delle estremità e risciacquare delicatamente con circa 10 mL Tampone fosfato salino (PBS) tampone di lavaggio fornito nel kit, utilizzando una pipetta o in un becher pieno di PBS per 10-15 s. trasferire immediatamente il vetrino in una vaschetta di Coplin con tampone di lavaggio PBS e lavaggio ( ammollo) per 10 min. Ripetere l'operazione con tutti gli altri vetrini.
    Nota: Quando si immissione più diapositive in una vaschetta di Coplin, accertarsi che il lato di cella della diapositiva non faccia contatto con un'altra diapositiva, come questo si tradurrà danneggiando le cellule aderito su vetrino.

3. aggiunta del coniugato fluorescente

  1. Togliere la vaschetta di Coplin solo una diapositiva alla volta. Per rimuovere il tampone di lavaggio PBS in eccesso dalla diapositiva, delicatamente toccare o asciugare il vetrino sul tovagliolo di carta. Ogni kit viene fornito con FITC etichettato coniugato fluorescente di IgG anti-umano. A ciascun pozzetto, applicare delicatamente 1 goccia (circa 50 µ l) del coniugato fornito.
  2. Incubare i vetrini nella camera di incubazione colorazione chiuso per 30 min.
    Nota: È consigliabile l'uso di Fc specifico IgG coniugato. Se c'è qualsiasi ANA presenti nel siero del paziente, il coniugato verrà associato alle cellule presenti in ciascun pozzetto durante questo periodo di incubazione, che provoca la fluorescenza specifica delle cellule presenti nei pozzetti. Il coniugato è sensibile alla luce. La camera di incubazione chiuso aiuterà a prevenire interferenza della luce con il coniugato reazione delle cellule presenti in ciascun pozzetto.
  3. Una volta terminato il periodo di incubazione, rimuovere il vetrino dalla camera umida. Tenere la fanno scorrere l'estremità della linguetta e risciacquare delicatamente con tampone di lavaggio circa 10 mL di PBS fornito nel kit, utilizzando una pipetta o in un becher pieno di PBS. Trasferire immediatamente il vetrino in una vaschetta di Coplin con tampone di lavaggio PBS e lavare (ammollo) per 10 min. Ripetere il processo con tutte le altre diapositive.
    Nota: Quando si immissione più diapositive in una vaschetta di Coplin, accertarsi che il lato di cella della diapositiva non faccia contatto con un'altra diapositiva, come questo si tradurrà danneggiando le cellule aderito su vetrino.
  4. Posto i coprioggetti forniti nel kit su un tovagliolo di carta a secco. Il supporto di montaggio è fornito con il kit. Al bordo inferiore del coprivetrino, applicare tra 3-4 gocce di mezzi di montaggio in una linea.
  5. Estrarre una diapositiva alla volta dal Vaso Coplin contenente il tampone di lavaggio. Per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso, delicatamente toccare o asciugare il vetrino sul tovagliolo di carta.
  6. Abbassare il vetrino delicatamente verso il coprioggetto posizionando il bordo inferiore della diapositiva per il bordo del coverslip. Questo consente il supporto di montaggio presente sul bordo inferiore coprivetrino di fluire verso il bordo superiore della diapositiva e minimizza la formazione di bolle d'aria, che può interferire con la lettura di ogni pozzo di una diapositiva.
    Nota: Pressione minima dovrebbe essere utilizzata per montare il vetrino di copertura sulla diapositiva. Una pressione eccessiva può causare il movimento laterale dei vetrini coprioggetto. Ciò può causare danni alla preparazione dello strato monomolecolare delle cellule e risultato in distorsione.
  7. Archiviare le diapositive al buio a 2-8 ° C. Esaminare le diapositive, non appena sono montati o entro 48h.
    Nota: Conservarli più a lungo possono provocare deterioramento del modello e del segnale fluorescente.

4. identificazione di risultati positivi e negativi

  1. Mostra i vetrini con un microscopio a fluorescenza utilizzando un set di filtro FITC, situato in una stanza buia.
  2. Esaminare la fluorescenza verde brillante specifica sotto un microscopio a fluorescenza a un ingrandimento di 200 X o versioni successive per rendere l'interpretazione finale per quanto riguarda la positività e modello. Osservare i controlli positivi e negativi.
    Nota: Il controllo positivo visualizzerà brillante fluorescenza verde nel nucleo (Figura 2A, omogeneo). Il controllo negativo non visualizzerà alcuna fluorescenza verde specifica con un microscopio a fluorescenza.
  3. Registrare il risultato positivo/negativo per ciascun pozzetto e includono il modello ANA per casi positivi.

Risultati

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Substrato di hEp-2 ELITE/DFS70 KO conserva classico ANA pattern e facilita la netta distinzione delle DFS70 Pattern:

Celle convenzionali e ingegnerizzate su substrato di HEp-2 ELITE/DFS70 KO sono identiche, conservando tutti gli autoantigeni fatta eccezione per il LEDGF/p75. Il controllo negativo fornito dal kit costituisce il segnale fluorescente della linea di base. Controlli positivi per pattern nucleolare e mitocondriale omogenea, maculato, centromero, su cellule HEp-2 ELITE producono un modello identico a modelli attesi su substrato di HEp-2 IIF convenzionale (Figura 2A). Questi modelli di riferimento sono stati descritti in dettaglio insieme con associazione antigene e malattia di ogni modello in precedenza4,29. Una breve descrizione dei modelli osservati in Figura 2A sono forniti nella tabella 1.

Modello DFS70 su cellule HEp-2 ELITE:

Circa il 10% delle cellule in ciascuna ben Visualizza un modello macchiato bene denso (ICAP assegnate nomenclatura: AC-2) che può essere osservato sul nucleo interfase e colorazione della cromatina associata è visto sui nuclei mitotici (Figura 2B). Su un substrato di HEp-2 convenzionale, tutte le celle avranno questo modello quando ha reagito con un campione positivo di DFS70. Il restante ~ 90% di cellule HEp-2 hanno il gene psip1 che codifica per l'antigene LEDGF eliminato e pertanto non produrrà un segnale o un pattern quando ha reagito con un monospecific DFS70 siero positivo (Figura 2B). Se il 10% delle cellule HEp-2 hanno fluorescenza più luminoso corrispondente al modello di DFS70 e resto dei cellule presenti ulteriori modelli (ad es., bene maculato o nucleolare), quindi questo indica la presenza di modelli misti. Esame più approfondito di tali modelli è essenziale per confermare tutte le specificità di autoanticorpi sono presenti oltre che il modello di DFS70. Dimostrare la capacità del substrato HEp-2 ELITE, un pannello di sieri campioni è stato creato con le varie concentrazioni di DFS70 e ANA positivi sieri di controllo e testato su entrambi convenzionali e substrati HEp-2 ELITE utilizzando un IIF standard protocollo (Figura 3 , Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7).

Interpretazione di DFS70 monospecifici e reazioni contrastanti su substrati d'ELITE convenzionale e HEp-2:

Per ogni modello specifico di ANA malattia-collegati (nella figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7), un monospecific ANA pattern sulla sinistra la maggior parte delle colonna e un monospecific DFS70 modello sulla destra la maggior parte delle colonna può essere osservato. Le tre colonne nel mezzo rappresentano vari rapporti di malattia-collegati e DFS70 modello controlli positivi. I modelli misti risultanti sono difficili da discernere il convenzionale substrato di HEp-2 (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, riga superiore). Tuttavia, con il substrato di Hep-2 ELITE romanzo, nella maggior parte dei campioni, la differenza di intensità tra cellule non modificate e ricostruite è distinto che non solo conferma la presenza di autoanticorpi DFS70 (quando il rapporto di maggiore luminosità meno cellule brillanti è 1:9), ma rivela anche un secondario ANA pattern. Nel caso di omogeneo-DFS70 o puntinato-DFS70 reazioni contrastanti, è impossibile prevedere con sicurezza il modello corretto che conduce ai laboratori optando per eseguire una serie di ulteriori saggi (Figura 1A). Nel caso di centromero-DFS70 e DFS70 nucleolare differenti reazioni, sospettando DFS70 positività è molto impegnativa (Figura 5, Figura 6). Con reazioni nucleolare e citoplasmatici reticolare/AMA, il modello di DFS70 non è dominante, fino a quando il rapporto di sieri raggiunge il 50%. In tutti gli esempi, il substrato di HEp-2 ELITE può presentare il modello DFS70 e il sottostante modello secondario su una più ampia gamma di intensità livelli e così facilita una più accurata interpretazione di ANA.

Per osservare da vicino i modelli misti, risultati per varie combinazioni di 50: 50 di ANA e DFS70 positivi i controlli erano allargata (Figura 8) per entrambi convenzionali e substrati HEp-2 ELITE. È incoraggiato ad osservare l'interfase e macchiatura mitotic per tutti i modelli di ANA compreso DFS70 su substrati HEp-2 per migliorare la precisione del modello riferito e interpretazione. Tuttavia, per modelli misti, il modello differenziale presentato dividendo i nuclei delle cellule può non essere sufficiente per facilitare la corretta interpretazione. Frecce rosse (Figura 8) indicano i nuclei mitotici in cella convenzionale e ingegnerizzato. Si può osservare che misto DFS70 reazioni sulla divisione delle cellule non conformi con l'insieme di regole per l'interpretazione della malattia associata stabilite ANA pattern. Le frecce gialle e blue indicano non modificati e derivati dal nuclei delle cellule HEp-2 (DFS70 KO), rispettivamente. In tutte le combinazioni (Figura 8), si osserva una differenza di intensità chiaro tra la cella non modificato nucleare colorazione (~ 10%) e la cella derivati dal nucleare (~ 90%) modello nello stesso campo di vista microscopico, che permette la selezione simultanea e conferma del modello DFS70.

Diagramma degli algoritmi di screening ANA utilizzando i metodi HEp-2, DFS70 IIF; ELISA, VIA per la diagnostica.
Figura 1: ANA screening algoritmi usando i metodi convenzionali di HEp-2 e cellule HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF. Schema (A) si dipana la carenza di convenzionale HEp-2 IIF nell'identificazione monospecifici e misto DFS70 modelli positivi nella fase di screening (area gialla ombreggiata) e l'impossibilità di escludere una secondaria associata a malattia ANA pattern che può essere nascosta da DFS70 modello. Inoltre, l'attuale generazione di DFS70 in fase solida specifici saggi di conferma non sono in grado di confermare la positività di DFS70 monospecifici che porta a ulteriori test di conferma per ANAs. (B) schema rivela la capacità di HEp-2 ELITE per lo screening dell'ANAs, distinzione simultanea di monospecifici e reazioni contrastanti di DFS70, ed eliminando la necessità di fase solida DFS70 saggi di conferma. Algoritmo utilizzando cellule HEp-2 ELITE significativamente semplifica l'ANA screening e riduce il numero di analisi di conferma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi del pattern ANA del substrato HEp-2; microscopia, identificazione di pattern, confronto di cellule DFS70.
Figura 2: modello Classic ANA e DFS70 sul substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO. (A) substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO conserva classico pattern degli ANA. Classica reazione omogenea e DFS70 le reazioni positive sono state prodotte utilizzando i controlli positivi forniti dal kit. Altre reazioni sono state prodotte utilizzando sieri di controllo positivi precedentemente stabilito per maculato, centromero, nucleolar e citoplasmico reticolare/AMA reazioni5. (B) substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO fornisce celle convenzionali e ingegnerizzate, che facilita facile distinzione del modello DFS70. Schema mostra la reazione di monospecific DFS70 risultante e il metodo di colorazione su interfase e dividendo nuclei cellulari per sia convenzionale che derivati dal cellule (DFS70-KO). Derivati dal cellule HEp-2 sono privi dell'antigene LEDGF/p75/DFS70 che consente la rilevazione simultanea dei modelli secondari sono solitamente nascoste da reazione di autoanticorpi DFS70 su substrati HEp-2 convenzionali. Frecce (giallo) indicano esempi dei nuclei delle cellule mitotiche. Barre della scala rappresentano 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Microscopia a fluorescenza, confronto della colorazione cellulare, cellule HEP-2, rilevamento di autoanticorpi DFS70.
Figura 3: DFS70 e sieri omogenei in combinazione. DFS70 monospecific sieri sono stati combinati con un controllo positivo pattern omogeneo in vari rapporti (100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 e 0:100) e testati su substrati HEp-2 (DFS70-KO) convenzionali e ingegnerizzati. Barre della scala rappresentano 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

microscopia a fluorescenza con cellule Hep-2; localizzazione delle proteine; risultati dell'esperimento; nuclei cellulari; motivo maculato.
Figura 4: DFS70 e screziati sieri in combinazione. DFS70 monospecific sieri sono stati combinati con un controllo positivo pattern punteggiato in vari rapporti (100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 e 0:100) e testati su substrati HEp-2 (DFS70-KO) convenzionali e ingegnerizzati. Barre della scala rappresentano 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Microscopia a immunofluorescenza, cellule HEP-2, centromero vs colorazione anticorpale DFS70, intensità di fluorescenza.
Figura 5: sieri DFS70 e centromero in combinazione. DFS 70 monospecific sieri sono stati combinati con un controllo di modello positivo centromero in vari rapporti (100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 e 0:100) e testati su substrati HEp-2 (DFS70-KO) convenzionali e derivati dal. Barre della scala rappresentano 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Microscopia a fluorescenza di cellule HEP-2 con colorazione nucleolare DF570; risultati dell'esperimento e dell'analisi.
Figura 6: DFS70 e nucleolare sieri in combinazione. DFS 70 monospecific sieri sono stati combinati con un controllo positivo pattern nucleolare in vari rapporti (100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 e 0:100) e testati su substrati HEp-2 (DFS70-KO) convenzionali e derivati dal. Barre della scala rappresentano 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Immunofluorescenza delle cellule Hep-2, pattern reticolare citoplasmatico, anticorpo DFS70, risultati della microscopia.
Figura 7: DFS70 e citoplasmico reticolare/AMA sieri in combinazione. DFS70 monospecific sieri sono stati combinati con un controllo positivo pattern mitocondriale in vari rapporti (100:0, 80: 20, 50: 50, 20: 80 e 0:100) e testati su substrati HEp-2 (DFS70-KO) convenzionali e ingegnerizzati. Barre della scala rappresentano 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Confronto al microscopio a fluorescenza di cellule HEp-2 e DFS70-KO, analisi dei modelli di colorazione nucleare.
Figura 8: misto modelli (rapporto di 50: 50) prodotte su convenzionale e substrati HEp-2 ELITE. Differenze tra i due substrati vengono rivelate. Le frecce rosse indicano i nuclei mitotici nelle cellule sia convenzionali che ingegnerizzati su entrambi i substrati. Per queste combinazioni, il modello differenziale presentato dividendo i nuclei delle cellule su substrato di HEp-2 convenzionale non è sufficiente per la corretta interpretazione di modelli misti. Si può osservare che reazioni contrastanti di DFS70 sulla divisione delle cellule possono perturbare l'insieme di regole per l'interpretazione della malattia associata stabilite ANA pattern. Le frecce gialle e blue indicano non modificati e derivati dal nuclei delle cellule HEp-2 (DFS70 KO), rispettivamente. I risultati ottenuti per tutte le combinazioni testato su derivati dal substrato: una differenza di intensità chiaro tra il modello nucleare di interfase appartenendo a non modificato cellule (~ 10%) e cellule ingegnerizzate (~ 90%) è stato osservato, che ha permesso simultanea rilevazione e la conferma del modello DFS70. Barre della scala rappresentano 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Modello di ANADescrizione
OmogeneoL'intero nucleo reagisce in uniformemente con un modello di macchiatura diffuso.
PuntinatoDiscreti, grossolano di multare le macchioline di fluorescenza in tutto il nucleo.  Sono state descritte multa modelli maculate maculate e grossolane.
NucleolareI nucleoli macchiano come corpi solidi o chiazze multiple all'interno del nucleo. Sottotipi sono stati descritti precedentemente.
CentromeroGrandi macchie di numero finito. Antigene reattivo segrega con i cromosomi condensati in cellule che subiscono la mitosi.
Citoplasmatica reticolare/AMAIl citoplasma appare granulare con la macchiatura positiva dei mitocondri.
DFS70Le cellule HEp-2 lancio: un modello macchiato bene denso è osservato il nucleo di interfase e cromatina associata colorazione è visto sui nuclei mitotici.
•Engineered KO DFS70 cellule: gli anticorpi Anti-DFS70 producono macchiatura negativa
HEp-2 Elite / DFS70 KO ha cellule convenzionali e ingegnerizzate (DFS70 KO) in rapporto di circa 1:9. Producono celle convenzionali modello tipico di DFS70 e cellule ingegnerizzate producono un modello negativo quando ha reagito con un DFS70 monospecific/isolato reazioni positive.

Tabella 1: Descrizione del pattern degli ANA.

Discussione

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Autoanticorpi verso antigeni nucleari e citoplasmatici sono altamente prevalenti nelle malattie autoimmuni sistemiche. Sebbene nessun singolo test fornisce la migliore possibile sensibilità e specificità, IIF di HEp-2 è ampiamente considerato come un metodo di screening altamente sensibile e conveniente per malattie autoimmuni sistemiche2,3,4 . Nonostante la prevalenza del protocollo IIF per più di 50 anni, precisione di dosaggio IIF è altamente dipendente dalla bravura del tecnico, attenta esecuzione dei singoli passaggi del protocollo e corretta interpretazione dei risultati utilizzando un ben mantenuto microscopio a fluorescenza. Diagnosi di malattia autoimmune sistemica non dovrebbe essere basata sui risultati di un singolo test serologico ad esempio IIF di HEp-2.

Ricostituzione dei reagenti usando alta qualità dell'acqua (acqua distillata/deionizzata), utilizzare dei componenti kit standardizzati (diapositive con monostrati di cellule HEp-2, diluente per campioni, controlli positivi e negativi, FITC-coniugato ottimizzato pre-diluito e mezzo di montaggio) avere un impatto positivo sui risultati. Ignorare l'aggiunta dei controlli o dei campioni su pozzi può incoraggiare false interpretazioni negative. Essiccazione di diapositive in qualsiasi punto dopo l'aggiunta del campione o controllo può provocare artifactual reazioni falsamente positive e/o modelli impropri. Troppo tampone di lavaggio lasciato sulla diapositiva o essiccazione dei pozzi di diapositiva prima della dispensazione di mezzo di montaggio può provocare artefatti. Aggiunta di insufficiente quantità di mezzo di montaggio o la generazione di bolle sulla superficie del vetrino prima di piazzare un vetrino coprioggetti può provocare reazioni che sembrano sfocate o fuori fuoco quando osservate al microscopio. Diapositive montate devono essere conservati a 2-8 ° C e analizzati all'interno della finestra raccomandata di tempo per ridurre al minimo i risultati falsi negativi o artifactual.

Utilizzando un microscopio di epi-fluorescente ben tenuto che ospita una sorgente di luce LED/Hg/Xenon appropriata e lenti componenti inclusi filtri di eccitazione e di emissione che non siano danneggiati è fondamentale per ottenere risultati accurati di IIF. Formazione per intensità di reazione positiva/negativa discriminante e interpretazione dei modelli dell'utente finale è fondamentale. Analisi di IIF HEp-2 sono vulnerabili alla mancanza di standardizzazione in procedure, configurazione del microscopio e formazione degli utenti finali o abilità. I modelli di nomenclatura e rappresentante di consenso ed esempi di immagini acquisite utilizzando vari produttori sono messi a disposizione da ICAP (< www.ANApatterns.org>) per scopi didattici4. Un albero di classificazione HEp-2 cella modello fornito da ICAP per vari modelli di nucleare e citoplasmatiche mitotiche è una risorsa preziosa per imparare le sottili differenze tra vari modelli che possono sembrare simili a4occhi non addestrati. Uno degli esempi principali di un modello impegnativo è il DFS70 che manca anche un'associazione distinta con una condizione autoimmune, e come descritto nelle sezioni precedenti questo modello è altamente prevalente in popolazioni sane5.

Secondo lo studio, la prevalenza di autoanticorpi anti-DFS70 variare tra coorti di sani, ANA screening popolazioni e individui positivi ANA senza prova della malattia autoimmune sistematica9,16,20 ,30,31. DFS70 autoanticorpi sono stati segnalati per accadere nell'isolamento, così come con altri modelli di ANA malattia-collegati. Isolato o monospecific DFS70 modello è segnalato in 2-22% dei controlli sani, ma in meno dell'1% dei casi con malattia reumatica autoimmune32. Basato su queste tendenze, modello mono-positivi DFS70 è stato proposto come criterio per escludere nelle malattie reumatiche autoimmuni di ICAP Comitato3,31,32. Il Comitato ICAP, istituito per promuovere l'armonizzazione della nomenclatura di prova del autoantibody e interpretazione dei risultati IIF HEp-2, raccomanda reporting DFS70 positività nel segnalare ANA screening risultati4.

Prima di escludere una malattia autoimmune sistemica basata su DFS70 mono-positività, è vitale per esaminare lo stato degli attuali metodi di screening e di conferma (in particolare quelli specifici per DFS70). Accordo tra positività di HEp-2 IIF e analisi confermativa di fase solida cioè ELISA DFS70, CLIA e metodi line immunoassay/dot blot) varia ampiamente tra i vari studi13,22,25,33 . IIF interpretazione e analisi confermativa parametri che contribuiscono a questo disaccordo sono stati discussi in precedenza5,13,34. Un approccio di immunoadsorption recentemente proposto per la conferma dell'anticorpo anti-DFS70 affronta alcune delle carenze di analisi corrente fase solida (per DFS70) ma richiede i laboratori per eseguire un ulteriore passaggio nella procedura IIF su campioni sospetti, che aumenta il tempo di costo e turnaround per la segnalazione risultati13. Questo ulteriore passo non è necessario quando le cellule HEp-2 ELITE/DFS70 KO vengono utilizzate per lo screening di routine ANA. Questo riduce i costi complessivi e inoltre non c'è nessun impatto sui tempi di consegna come DFS70 modello è discernuta nella selezione iniziale passo27. Un ulteriore svantaggio di utilizzando il metodo convenzionale di IIF HEp-2 è che è incapace di distinguere DFS70 modello co-che si verificano con altri ANA pattern nella fase di screening. Tuttavia, questo svantaggio è superato con l'uso di cellule HEp-2 ELITE/DFS70 KO27.

Valutazione comparativa delle convenzionali HEp-2 e il nuovo ingegnerizzati HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) utilizzando controlli positivi ANA e loro combinazioni con un controllo di DFS70 di mono-positivo, dimostrare l'utilità della capacità del nuovo substrato di simultaneamente dello schermo per ANAs e confermare il modello DFS70 (Figura 1). Il protocollo IIF per il nuovo substrato è identico al metodo convenzionale IIF HEp-2. Schema di interpretazione per malattia-collegati tutti i pattern degli ANA è identico con l'eccezione del modello DFS70 (tabella 1). Interpretazione dei modelli di DFS70 sia mono-positivo e misti era relativamente più facile utilizzando il nuovo metodo e non garantisce ulteriori saggi (Figura 1B). Attuazione di questo nuovo metodo nel laboratorio clinico semplifica la sfida connessa con l'interpretazione di DFS70 schema e migliora la precisione complessiva dell'ANA di screening rivelando ulteriore malattia-collegati ANA pattern precedentemente nascosta da DFS70 (miscelata modelli).

Dichiarazioni

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Gli autori Kishore Malyavantham e Lakshmanan Suresh sono dipendenti di Trinity Biotech, Stati Uniti d'America.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Andrew Zenger per eseguire gli esperimenti IIF e raccolta di immagini.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
HEp-2 ELITE / DFS70-KO Vetrino a 12 pozzetti sigillato singolarmente in bustaTrinity Biotechparte del kit # 1108, 1108-120, 1108-240
Controllo positivo ANATrinity Biotech parte del kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Controllo positivo dell'anticorpo DFS70Trinity Biotechparte del kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Controllo negativoTrinity Biotechparte del kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Coniugato FITC IgG anti-umano contenente la controcolorazione blu di EvanTrinity Biotechparte del kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Diluente tampone per sieroTrinity Biotechparte del kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Trinity Biotechparte del kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Mezzo di montaggioTrinity Biotechparte del kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Vetrini Trinity Biotechparte del kit # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sigillato singolarmente inbusta Trinity Biotechparte del kit# 1103, 1103-240
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Materiali utilizzati nello studio ma non forniti dai kit
Microscopio diagnostico a fluorescenzaNikon Eclipse 50iDotato di una fotocamera spot dignostica, modello 2.2.1
Camera di incubazioneTrinity Biotechfornita ai clienti (nessun catalogo #)
Barattolo Coplinn/aArticoli da laboratorio generici
Asciugamani di cartan/aForniture generali di laboratorio
Acqua distillata/deionizzatan/aForniture generali di laboratorio

Riferimenti

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