Genica mirata di editing con CRISPR/Cas9 ha notevolmente facilitato la comprensione delle funzioni biologiche dei geni. Qui, utilizziamo la metodologia CRISPR/Cas9 a modello calreticulina mutazioni in cellule ematopoietiche citochina-dipendente al fine di studiare la loro attività oncogena.
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Articolo metodologico
Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) è un sistema di immunità adattativa nei procarioti che è stato reimpiegato dagli scienziati per generare nucleasi RNA-guidato, come ad esempio CRISPR-collegata (Cas) 9 per site-specific genoma eucariotico di editing. Ingegneria del genoma da Cas9 viene utilizzato per in modo efficiente, robusta e facilmente modificare geni endogeni in molte linee cellulari di mammifero biomediche pertinenti e organismi. Qui vi mostriamo un esempio di come utilizzare la metodologia CRISPR/Cas9 per comprendere la funzione biologica di mutazioni genetiche specifiche. Abbiamo il modello calreticulina (CALR) mutazioni in murino interleukin-3 (mIL-3) pro-B (Ba/F3) le celle dipendenti dalla consegna di guida singola RNAs (sgRNAs) targeting per il locus Calr endogeno nella regione specifica dove inserimento e/o cancellazione (indel ) CALR mutazioni si verificano in pazienti con neoplasie mieloproliferative (MPN), un tipo di tumore del sangue. La sgRNAs creare doppio filo (DSBs) nella regione mirata che sono riparati da non-omologo fine unirsi (NHEJ) per dare indels di varie dimensioni. Utilizziamo quindi il test di trasformazione cellulare Ba/F3 standard per comprendere l'effetto dell'espressione di livello fisiologico di Calr mutazioni sulla trasformazione cellulare ematopoietico. Questo approccio può essere applicato ad altri geni di studiare la loro funzione biologica in varie linee cellulari di mammifero.
Introduzione
CRISPR/Cas9 tecnologia recentemente ha rivoluzionato l'editing genomico mirato negli organismi e cellule viventi. È divenuto uno strumento estremamente potente per la ricerca biomedica e attualmente viene utilizzato come un viale potenziale per la terapia di malattie genetiche1. La base per tutti gli strumenti di editing del genoma si basa sulla creazione di una nucleasi-indotta rottura del DNA doppia filamento (DSB) presso il locus genomico per essere modificato. Il DSBs può essere riparato da fine-unirsi non-omologo (NHEJ) o riparazione omologia-diretto (HDR)2,3. Il vantaggio della nu....
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Protocollo
1. sgRNA Design utilizzando strumenti Online13
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Progettazione sgRNAs targeting per il gene di interesse utilizzando gli strumenti disponibili gratuitamente online.
- Copiare e incollare la sequenza di Riferimento NCBI del gene di interesse lo strumento di progettazione web sgRNA Broad Institute: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
Nota: Questo strumento identifica sgRNA sequenze con siti di taglio all'interno degli esoni e coloro che abbracciano il limite di essone / dell'introne ma ancora unirà all'interno dell'esone. - Scarica e Apri il file di output di te....
- Copiare e incollare la sequenza di Riferimento NCBI del gene di interesse lo strumento di progettazione web sgRNA Broad Institute: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
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Risultati
Utilizzando il metodo descritto qui, l'obiettivo di questo esperimento è quello di studiare gli effetti funzionali dell'introduzione di mutazioni indel al locus Calr endogeno sulla trasformazione delle cellule ematopoietiche. Il sistema CRISPR/Cas9 è usato come uno strumento per creare endogeno Calr mutazioni nelle cellule Ba/F3. Due sgRNAs sono stati scelti per indirizzare essone 9 di Calr (Figura 1), nella regione dove gli inserim.......
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Discussione
Qui dimostriamo l'uso di CRISPR/Cas9 gene editing per studiare la funzione biologica di CALR mutazioni nelle cellule ematopoietiche. Il successo di questo protocollo è altamente dipendente da molteplici fattori. In primo luogo, è importante sapere quali tipi di mutazioni possono essere responsabili del fenotipo che è desiderato. In questo protocollo, la lettura è la trasformazione delle cellule Ba/F3 per mIL-3 indipendenza e i tipi di mutazioni sono indels in essone 9 di CALR. Tuttavia, se la mutazione .......
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Dichiarazioni
Non abbiamo conflitti di interesse relativi alla presente relazione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH (R01HL131835), un premio di ricercatore clinico di Damon Runyon e il Consorzio di cancro Starr.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidina | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromicina | Life Technologies | A1113803 | |
| celle Stbl3 | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | ||
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillina/streptomicina/L-glutammina | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polibrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE tampone | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmide #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligasi | New England Biolabs | M0202S | |
| Kit di purificazione PCR | Qiagen | 28104 | |
| Kit Miniprep | Qiagen | 27104 |
Riferimenti
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360(2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and tar....
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Ristampe e permessi
