Articolo metodologico

Un additivo tecnica di fabbricazione per la Facile e rapida realizzazione di Micromachines base di idrogel con componenti magneticamente reattivi

10.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/56727

⸱

18 luglio 2018

 ,  ,  , 
1Molecular Engineering Laboratory, Biomedical Sciences Institute, Agency for Science Technology and Research, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

In questo articolo

Sommario

È stata sviluppata una strategia di produzione di additivi per il trattamento UV-reticolabili idrogeli. Questa strategia consente il montaggio di strato dopo strato di microfabbricati idrogel strutture così come il montaggio di componenti indipendenti, producendo dispositivi integrati che contengono parti in movimento che sono sensibili ad azionamento magnetico.

Abstract

Polietilenglicole (PEG)-base di idrogeli sono idrogeli biocompatibili approvati dalla FDA per uso in esseri umani. Tipico basato su PEG idrogeli sono semplici architetture monolitiche e spesso funzione come materiali per applicazioni di ingegneria tissutale per ponteggi. Più sofisticate strutture in genere prendere molto tempo per fabbricare e fare non contengono parti in movimento. Questo protocollo descrive un metodo di fotolitografia che consente la facile e rapida microfabbricazione di PEG strutture e dispositivi. Questa strategia comporta una fase di fabbricazione sviluppate in-House che permette per la rapida realizzazione di strutture 3D costruendo verso l'alto in modo strato dopo strato. Indipendente di parti in movimento possa essere allineati e assemblati sulle strutture di sostegno per formare dispositivi integrati. Questi componenti indipendenti sono drogati con nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico che sono sensibili ad azionamento magnetico. In questo modo, possono essere azionati i dispositivi fabbricati utilizzando magneti esterni per produrre il movimento dei componenti all'interno. Quindi, questa tecnica permette la fabbricazione di sofisticati dispositivi MEMS-come (micromachines) che sono composti interamente da un idrogel biocompatibile, in grado di funzionare senza una sorgente di alimentazione di bordo e rispondere a un metodo senza contatto di azionamento. Questo manoscritto descrive la fabbricazione di sia il set-up di fabbricazione, nonché il metodo passo-passo per la microfabbricazione di questi dispositivi MEMS-come base di idrogel.

Introduzione

Dispositivi MEMS hanno trovato una moltitudine di applicazioni soprattutto nel campo dei dispositivi medici. Sebbene essi prestano un sacco di funzionalità aggiunta e la natura di questi dispositivi miniaturizzata li rendono attraenti per uso come implantables1,2,3, questi dispositivi spesso hanno biocompatibilità e sicurezza intrinseca problemi, come essi sono composti da materiali che potrebbero essere dannosi per il corpo umano (ad esempio, metalli, batterie, ecc.)4,5,6. Idrogel a base di PEG sono reti di polimeri liquidi gonfie e sono stati usati frequentemente per applicazioni quali impalcature ingegneria del tessuto in gran parte in parte a causa della loro elevata biocompatibilità7,8. Idrogel a base di PEG sono stati approvati dalla FDA per uso in esseri umani9,10,11. Tuttavia, a causa delle proprietà del materiale di idrogel, essi non facilmente sopportare normali lavorazioni quali tecniche utilizzate nel tipico microfabbricazione basate sul silicio. Così, costrutti di base di idrogel sono in genere limitati a semplici architetture monolitiche. Gli sforzi attuali alle microfabbricazione di idrogeli hanno portato in strutture con caratteristiche di dimensioni micron; Tuttavia, queste strutture sono spesso di un singolo strato e un singolo materiale12,13 e mancanza di movimento componenti14,15,16.

In un precedente lavoro, descriviamo una strategia per la realizzazione di micromachines che sono composti interamente da un materiale biocompatibile a base di PEG idrogel17. Caratteristiche dimensioni micron possono essere fabbricati facilmente utilizzando un metodo di fotolitografia e queste strutture possono essere realizzate verso l'alto utilizzando un metodo a strati, attivato dal movimento preciso dell'asse z del substrato su cui gli idrogeli sono polimerizzati. Idrogeli di composizioni differenti possono essere fabbricati adiacente a vicenda. Inoltre, questi dispositivi hanno componenti in movimento che possono essere azionati tramite un magnete esterno. Questa tecnica versatile è anche adatta per la lavorazione di qualsiasi materiale morbido o idrogel che è foto-polimerizzabile. Così, questa tecnica è particolarmente adatta per la realizzazione di sofisticati dispositivi MEMS-come composti interamente di idrogel.

Protocollo

1. fase di montaggio

  1. Montare il set-up di fabbricazione (Figura 1) costituito da un in-House costruito tappa e PDMS alloggiamento in cui i componenti di idrogel sono polimerizzati. La fase di fabbricazione è composto da un top acrilico, in cui tracce e canali sono stati lavorati per consentire connessioni vuoto, un supporto per il fissaggio di una testina micrometrica entro la fase di vuoto-permessi e filettati alberini d'acciaio che consentono l'intera fase di essere fissato sulla base per la stabilizzazione in acciaio.
  2. Fissare la testa del micrometro con un pezzo di acrilico che è lavorato per avere tracce per attacco a vuoto. Connessioni vuoto consentono all'utente di tenere giù la camera di PDMS, nonché spostare la membrana flessibile all'interno della camera PDMS.
  3. Posizionare una sorgente di luce UV (320-500 nm) sopra la fase di fabbricazione, tale che l'angolo di incidenza della luce è perpendicolare al piano orizzontale della fase (complementare figura 1).

2. fabbricazione di camera di PDMS e determinare il suo livello "Zero"

  1. Fare un alloggiamento PDMS, in cui nel caso degli idrogeli verrà essere polimerizzati (Vedi Figura 1A, camera di PDMS). Questa camera è costituito da un PDMS bene con una membrana flessibile su cui è legato un vetrino coprioggetti. Il vetrino coprioggetti che sono legato alla membrana flessibile PDMS sono ulteriormente trattati per impedire l'adesione di idrogeli (punto 2.1.7).
    1. Preparare una base PDMS 9 parte a 1 parte di miscela di agente di polimerizzazione (in peso).
    2. Mescolare bene con una bacchetta di vetro per garantire che gli agenti di vulcanizzazione e base sono ben miscelati. Centrifugare a 1.000 x g per rimuovere le bolle d'aria.
    3. Accuratamente e versare il composto PDMS in due capsule di Petri vetro per produrre uno strato spesso (~ 3 mm) e un sottile strato (~0.2 mm). Luogo pieno di PDMS capsule di Petri su un piatto, superficie piana e cura durante la notte a temperatura ambiente o per 30 minuti in un forno con temperatura impostata a un minimo di 75 ° C.
      Nota: Un sottile strato di PDMS è richiesto per la base della camera PDMS quanto garantisce la generazione di uno strato flessibile che può essere facilmente spostato nella direzione z dal micrometro a vite. Gli strati PDMS devono essere piatto e livello per garantire che i livelli di idrogelo polimerizzato siano di spessore uniforme.
    4. Quando il PDMS è completamente asciugato, tagliate un cerchio del diametro di 4 cm lo strato spesso usando un bisturi o un temperino. Sbucci la spessa coltre PDMS fuori dal vetro di Petri. Posizionare lo spesso strato PDMS (lato inferiore in alto) e il sottile strato PDMS (ancora nel bicchiere di Petri) in forno al plasma.
    5. Al plasma trattare i due strati PDMS (30 s, plasma ad aria) e bond il lato inferiore dello spesso strato PDMS al lato superiore dello strato sottile PDMS. Togliere i pezzi incollati dal vetro di Petri per formare un pozzo circolare con il sottile strato formando una membrana flessibile base.
      Nota: Prima della rimozione degli strati incollati dal vetro di Petri, i due strati possono essere collocati su una piastra calda a 95 ° C per favorire l'incollaggio degli strati.
    6. Al plasma si lega un vetrino coprioggetti (n. 2, 22 x 22 mm) con il lato superiore della membrana flessibile PDMS; al plasma trattare sia il vetrino coprioggetti e camera di PDMS dal passaggio 4 per 30 s (plasma ad aria) e posto il vetrino coprioggetti in contatto con il lato superiore della membrana flessibile base per incollare alla membrana.
    7. Vapor silanizzare la camera di PDMS con Silano tricloro (1h, 1h, 2H, 2h - perfluottani) (PFOTS) per almeno 30 minuti; Posizionare la camera di PDMS in un essiccatore sotto vuoto con un piccolo piatto di Petri con 60 µ l di PFOTS e collegare un essiccatore sigillato per il sistema di vuoto del laboratorio centrale. Lasciare un essiccatore collegato all'impianto del vuoto per almeno 30 minuti.
      1. Assicurarsi che la guarnizione sotto vuoto di un essiccatore viene generata e che la goccia di PFOTS "bolle" dopo 5-10 minuti. Vapor silanizzazione della camera PDMS permette facile rimozione di idrogel formate strati e previene la forte adesione di polimerizzato PEG idrogeli alla superficie del vetro dopo un uso prolungato.
  2. Per determinare il livello "zero" della camera PDMS, posizionarlo su un palco vuoto-permessi (collegato al sistema centrale di vuoto di laboratorio).
    1. Applicare una pressione negativa per la camera di PDMS tenendo premuto. Le strutture di idrogel di PEG saranno essere polimerizzate in questo Emiciclo PDMS (Figura 1A, area di montaggio).
    2. Collocare un vetrino coprioggetti di vetro non trattato sopra la camera di PDMS tale che copre il pozzo. La distanza tra il piano in vetro vetrino coprioggetti (substrato superiore) e il fondo vetrino coprioggetti (substrato di fondo) definisce lo spessore dello strato idrogel che si forma all'interno della camera PDMS.
    3. Utilizzando la testina micrometrica, spingere il substrato di fondo verso l'alto fino a quando è a contatto con il substrato superiore. Utilizzare la lettura sulla testa micrometro come il livello "zero" della camera PDMS e come riferimento quando si definisce lo spessore degli strati dell'idrogelo polimerizzato.

3. Photomask Design per fotopolimerizzazione di microstrutture di idrogel

  1. Per progettare le fotomaschere, utilizzare software CAD.
  2. Progettare ogni livello unico della struttura idrogel che deve essere fabbricato. Fare riferimento alla Figura 2 per il dispositivo di esempio fabbricato utilizzando questo protocollo. La figura 2 Mostra 3D schematica di questo dispositivo, i livelli corrispondenti ad essere fabbricato così come le maschere fotografiche che sono stati progettati per la fabbricazione di questi singoli strati.
  3. Maschere fotografiche di progettazione in campo scuro; caratteristiche per essere polimerizzati dovrebbero essere trasparente e lo sfondo è opaco (Figura 2 C, complementare figura 2).
  4. Segni di allineamento incorporano nei disegni di fotomaschere per facilitare l'allineamento delle fotomaschere durante il processo di fabbricazione.
  5. Stampare i disegni come delle maschere di trasparenza alla massima risoluzione disponibile e alle densità di pixel ad alta.

4. trattamento delle lamelle di vetro per impedire l'adesione di idrogeli

  1. Per creare superfici che respingono l'idrogel di PEG polimerizzato, lamelle di vetro sono rivestite con un sottile strato di PDMS.
  2. Preparare PDMS (9:1 base per rapporto catalizzatore di vulcanizzazione) e centrifugare a 1.000 x g per rimuovere le bolle d'aria.
  3. Applicare un sottile strato di PDMS lamelle di vetro pulito e lasciare agire per curare su una superficie piana all'interno di un forno (> 75 ° C, 30 min).

5. strato dopo strato fabbricazione di idrogeli: strutture di sostegno di strato di tenuta superiore e inferiore

  1. Per creare uno strato di idrogel che verrà successivamente utilizzato per sigillare il dispositivo formato, utilizzare un pezzo non trattato di vetrino coprioggetti (numero 2) come un "coperchio" per l'alloggiamento PDMS. Questo "coperchio" si riferisce a come il substrato superiore.
    1. A partire dal livello "zero" del dispositivo, abbassare il substrato di fondo utilizzando la testina micrometrica all'altezza desiderata. La distanza tra i supporti superiore e inferiore definisce lo spessore del primo strato di idrogel (Z1, Figura 3A).
    2. Depositare un piccolo volume del prepolimero PEGDA (ad esempio, una miscela di 400Da PEGDA con 1% Darocur 1173), sufficiente a coprire il substrato di fondo.
    3. Posizionare il substrato superiore della camera PDMS.
      Nota: È importante garantire che non ci sono nessun bolle d'aria intrappolate tra i substrati superiore e inferiore.
    4. Posizionare un photomask con disegno desiderato in cima il substrato superiore (Figura 2 (i)). Assicurarsi che la maschera sia a pieno contatto con il substrato superiore e allineata al substrato di fondo.
    5. Esporre il prepolimero idrogel per UV luce attraverso il photomask (passaggio 1, Figura 3A). Garantire che l'esposizione avviene all'interno di uno spazio chiuso che impedisce l'esposizione alla luce UV randagio alla zona circostante.
      Attenzione: Indossare protezione UV (ad es., UV occhiali) quando il sistema operativo.
      Nota: La potenza e la durata dell'esposizione dipende dal tipo di sistema UV e prepolimero PEGDA usato.
    6. Ad esempio, per una lampada UV W 200 e il 99% PEGDA (400 Da PEGDA con fotoiniziatore 1% (v/v)) soluzione prepolimero, impostare l'alimentazione lampada al 16% (corrispondente a ~2.3 W/cm2) e completamente curare nel caso degli idrogeli entro 4 secondi. La durata dell'esposizione dovrebbe essere aumentata con diminuzione potenza della lampada e aumentando la lunghezza della catena PEG del prepolimero utilizzato.
    7. Dopo lo strato di idrogel ha stato polimerizzato, sollevare il substrato superiore della camera PDMS. Lo strato polimerizzato deve essere rispettato sul substrato superiore (inserto per il passaggio 1, Figura 3A). Riserviamo questo strato aderito per uso più tardi sigillare il dispositivo assemblato. Scudo di questo strato polimerizzato dalla luce.
      Nota: Mantenere questo strato polimerizzato lontano dalla luce e bagnato con prepolimero reticolato in eccesso per evitare lo strato da secchezza e screpolature.
  2. Per creare le strutture di sostegno inferiore, utilizzare lamelle di vetro rivestite con PDMS come il substrato superiore della camera PDMS.
    1. Deposito più idrogel prepolimero sul substrato inferiore e coprire il PDMS bene con un coprioggetto in vetro rivestite con PDMS. Questo è per assicurare che gli strati polimerizzati rimangano sul substrato di fondo, permettendo all'utente di costruire strati verso l'alto (passaggio 2, Figura 3A).
    2. Ripetere i passaggi da 5.1.4 e 5.1.5 con il design di fotomaschere desiderata (Figura 2 c (iii)).
    3. Rimuovere il substrato superiore e aggiungere ulteriori prepolimero PEGDA e abbassare il substrato di fondo utilizzando la testina micrometrica al livello desiderato. Questo livello dovrebbe corrispondere allo spessore dello strato 2nd di idrogel di essere polimerizzato (Z2, passo 3, Figura 3A).
    4. Coprire il PDMS bene con il substrato superiore (vetro rivestite con PDMS) e ripetere i passaggi da 5.1.4 e 5.1.5.
    5. Costruire continuamente strati di idrogel come desiderato utilizzando punti 5.2.1 e 5.2.2 fino a quando non si formano le strutture di supporto desiderato.

6. montaggio e tenuta la periferica basata su idrogel

  1. Per assemblare e sigillare il dispositivo, prima di rimuovere il substrato superiore (vetro rivestite con PDMS) e utilizzando un paio di pinzette, posizionare componenti pre-formate idrogel (ad es., ingranaggi, componenti ferro-drogati) sulle strutture di sostegno (parte (i), punto 4, Figura 3A ).
    Nota: Un magnete permanente può essere utilizzato per allineare i componenti ferro-drogati (fare riferimento al doping di ossido di ferro di idrogel componenti per la procedura di fabbricazione).
  2. Per sigillare il dispositivo, prima di portare il substrato di fondo all'altezza desiderata finale del dispositivo assemblato utilizzando il micrometro a vite. Questo dovrebbe essere l'altezza finale del dispositivo, tenendo conto dello spessore degli strati, componenti interni ed eventuali rimozioni dati per lo spostamento di componenti (Z4, punto 5, Figura 3A)
    1. Posto il livello pre-formate idrogel aderito sul coprioggetto di vetro non trattato da 5.1 sul dispositivo parzialmente assemblato (parte (ii), passaggio 4, Figura 3A). Posizionare il livello pre-formato tale che che sia correttamente allineato alle strutture di sotto di esso.
    2. Posizionare un photomask che permette per la sigillatura del dispositivo, ma protegge l'interno componenti in movimento da esposizione ai raggi UV. Garantire che le parti in movimento non sono polimerizzate ai bordi del dispositivo, impedendo il loro movimento durante l'azionamento.
    3. Esporre l'intera struttura alla luce UV (parte (i), punto 5, Figura 3A).
    4. Sollevare il vetrino coprioggetti dalla fase di fabbricazione. Il dispositivo sigillato dovrebbe aderire al substrato superiore ((parte (ii), punto 5, Figura 3A).
      Nota: Se il dispositivo rimane aderito al substrato di fondo, sollevare con cautela il dispositivo con un paio di pinzette (non Seghettato) di punta piatta o una spatola piatta.
    5. Rimuovere con attenzione PEGDA non polimerizzata in eccesso mediante aspirazione di vuoto e sollevare con cautela il dispositivo spento il vetrino coprioggetti usando un paio di pinzette piatte o spatola piatta.
    6. Posizionare il dispositivo in soluzione fisiologica o DI acqua. Idrogeli si gonfiano in soluzione. Lasciare il dispositivo nella soluzione per almeno 30 minuti per permettere di stabilizzazione e di espansione del dispositivo e i componenti interni.
      Nota: Se il dispositivo deve essere utilizzato per l'impianto in vivo , è importante risciacquare e liscivia fuori qualsiasi prepolimeri di reticolato. Questo può essere fatto modificando la soluzione in cui il dispositivo viene incubato in ogni ora (almeno 3 risciacqui) e lasciare il dispositivo in soluzione durante la notte e risciacquo fuori con più soluzione.
    7. Eliminare l'aria all'interno del dispositivo inserendo il dispositivo all'interno di una capsula di Petri riempita DI acqua o soluzione salina all'interno di una camera a vuoto (collegata a sistemi di vuoto del laboratorio centrale) per almeno 30 minuti. Questo si tradurrà in degasaggio del dispositivo e il dispositivo sarà riempito di soluzione una volta che la pressione negativa viene rimosso.
      Nota: Tenete la soluzione/idratata del dispositivo in ogni momento. Il dispositivo potrebbe incrinarsi dovrebbe esso essere messo ad per asciugare.

7. ossido di ferro Doping di idrogel componenti

  1. Preparare una soluzione di prepolimero PEGDA con 1% fotoiniziatore (ad es., 99% (v/v) PEGDA (Da 400) con 1% Darocur 1173).
    1. Utilizzando questa soluzione prepolimero, fare una soluzione al 5% (p/v) di ossido di ferro (II, III) soluzione di nanoparticelle. Pesare 5 mg di nanoparticelle di ossido di ferro e aggiungere 100 µ l del prepolimero PEGDA. Pipetta su e giù e vortex per garantire la miscelazione uniforme.
    2. Garantire che le nanoparticelle sono omogeneamente dispersi all'interno del prepolimero PEGDA prima di ogni utilizzo come le nanoparticelle si sedimenti nel tempo.
  2. Dispensare una piccola quantità di ossido di ferro - miscela prepolimero PEGDA sul substrato di fondo della camera PDMS.
  3. Coprire il PDMS bene con il substrato superiore (vetro rivestite con PDMS) che nel caso degli idrogeli formato restino sul substrato di fondo.
  4. Portare il substrato di fondo all'altezza desiderata utilizzando la testina micrometrica.
    Nota: Strati sottili (200 µm) di PEGDA drogato con ossido di ferro dovrebbero essere polimerizzati con ogni singola esposizione. Questo è dovuto alla diminuzione di profondità di penetrazione del UV luce come l'ossido di ferro le nanoparticelle sono opachi e sono in grado di assorbire e bloccare i raggi UV.
  5. Utilizzando un photomask che definisce la forma del segmento per essere drogato con ossido di ferro all'interno del componente commovente, esporre il sottile strato di ossido di ferro prepolimero drogato alla luce UV (Figura 4(i)).
    Nota: Il tempo di esposizione UV dovrebbe essere aumentata per garantire che il segmento drogato con ferro è completamente cross-linked (~ 10 secondi).
  6. Abbassare il substrato di fondo e ripetere il passaggio 6, costruire il segmento drogato con ferro in strati sottili ogni volta all'altezza desiderata (Figura 4(ii)). Un totale di 5 strati dovrebbe essere polimerizzato per produrre un segmento di drogati con ferro alto 1mm.
  7. Dopo il segmento drogato con ferro è completa (Figura 4(iii)), rimuovere qualsiasi prepolimero drogato con ferro in eccesso mediante aspirazione di vuoto. Non rimuovere il segmento di ferro-drogato dalla fase di fabbricazione.
  8. Depositare il prepolimero PEGDA (non drogato) sul segmento di ferro-drogati polimerizzato. Portare il substrato di fondo per l'altezza finale del componente per essere completato. Coprire il PDMS bene con il substrato superiore (vetro rivestite con PDMS).
  9. Usando un photomask che definisce l'intera forma del componente commovente, esporre il prepolimero PEGDA, come pure il segmento ferro-drogati, ai raggi UV (Figura 4(iv)).
  10. Rimuovere il supporto superiore e prepolimero PEGDA in eccesso non polimerizzato mediante aspirazione di vuoto. Un componente di PEG con un segmento di ossido di ferro drogato dovrebbe rimanere sul substrato di fondo. Sollevare delicatamente questo componente utilizzando un paio di pinzette.
  11. Riserviamo questo componente ferro-drogati per montaggio su strutture di supporto di un dispositivo basato su PEG (parte (i), punto 4, Figura 3A). Proteggere questo componente dalla luce e garantire che esso rimanga bagnato con reticolato prepolimero prima dell'uso.

8. l'azionamento del dispositivo assemblato

Nota: I componenti all'interno del dispositivo assemblato drogato con ferro da stiro possono essere azionati per spostare utilizzando un forte magnete permanente come neodimio (N52 forza). Fare attenzione a non pizzicare i pericoli come questi magneti sono molto fortemente attratti da materiali ferromagnetici.

  1. Posto un magnete al neodimio sotto o sopra il dispositivo entro 1-2 cm dal dispositivo. Mentre il magnete mobile, il movimento dei componenti di drogati di ossido di ferro dovrebbe nascondere il movimento del magnete.
    Nota: Un attuatore può essere costruito utilizzando un motore che è collegato con un magnete. Azionamento rotazione del componente drogati ferro dovrebbe consentire la rotazione del motore.

Risultati

Figura 3B Mostra le immagini degli strati di idrogeli polimerizzati impianto di fabbricazione. Figura 3B (i) Mostra un fabbricato 400 µm spessore base strato con apertura 600 µm. Figura 3B (ii) Mostra un ulteriore due strati che sono state stratificate sopra lo strato di base; un perimetro alto 500 µm e un asse alto 800 µm nel mezzo. Il tempo di fabbricazione totale per questi tre strati era meno di 3 minuti, tenendo conto di 4 secondi di esposizione per ogni strato e il tempo impiegato per regolare l'altezza del substrato di fondo e allineamento di fotomaschere. Precedente lavoro svolto sulla stessa impostazione di fabbricazione dimostra che una varietà di disegni può essere fabbricata con risoluzioni alto come 100 µm.

I componenti di idrogel potrebbero anche essere facilmente drogati con nanoparticelle di ossido di ferro. I tempi di esposizione sono stati ottimizzati per assicurare strati sottili (200 µm) di prepolimeri PEGDA drogati con ossido di ferro le nanoparticelle potrebbero essere completamente polimerizzate. Figura 5A Mostra il photomask utilizzato per definire la forma del segmento di ossido di ferro per essere polimerizzati. Il prepolimero PEGDA ONU-drogato può essere polimerizzato completamente entro 4 secondi di esposizione ai raggi UV. Tuttavia, quando il prepolimero drogati di ossido di ferro è stato esposto per 4 secondi per UV, l'idrogel risultante non era completamente polimerizzato, come si può vedere in Figura 5. Il segmento generato era più sottile (rispetto ad un segmento completamente reticolato mostrato in figura 5B), e i bordi erano irregolari con fedeltà compromessa rispetto la forma definita dal strato di fotoresist. Esposizione ai raggi UV di 10 secondi è stato richiesto per completamente Croce Collegare il segmento di ossido di ferro e figura 5B Mostra il segmento di ossido di ferro che è stato generato; il segmento polimerizzata ossido di ferro è di spessore completo (200 µm) con bordi dritti, e forma fedeltà è strettamente mantenuta rispetto alla strato di fotoresist (Figura 5A). Al contrario, un'esposizione prolungata (> 15 secondi) a luce UV generati segmenti di ossido di ferro che erano oltre polimerizzati. Figura 5 Mostra un over polimerizzato segmento che ha fedeltà forma scadente ed è più grande la forma definita dal strato di fotoresist.

Figura 6A Mostra un dispositivo completo dopo la sigillatura con un allineamento corretto utilizzando maschere fotografiche con segni di allineamento. L'ingranaggio all'interno del dispositivo è interamente all'interno del vuoto centrale del dispositivo ed è così reattivo ad azionamento magnetico. Figura 6B Mostra un dispositivo con un strato di sigillante non allineato. Figura 6 Mostra gli strati di fondo di idrogel e l'ingranaggio si è chiarito con contorni neri e Figura 6 Mostra la sigillatura non allineata dello strato superiore dell'idrogelo delucidato in contorni bianchi. Come si può vedere dalla Figura 6, porzioni dell'ingranaggio che rientrano nelle regioni dove polimerizzazione avrebbe avuto luogo durante la sigillatura (riempimento mostrato in rosso) risultati in porzioni dell'ingranaggio essendo ancorato per la maggior parte del materiale idrogel. Ciò impedisce che l'ingranaggio lo spostamento durante l'azionamento.

La figura 7 Mostra un dispositivo funzionale singolo ingranaggio che è stato fabbricato (tempo di fabbricazione ~ 15 minuti totale). Lo spessore totale del dispositivo è di 2 mm e la dimensione più lunga del dispositivo è di 13 mm. Gli strati superiore e inferiore del dispositivo è 400 µm di spessore e l'ingranaggio ha un'altezza di 1 mm. Questo design permette per una distanza di 100 µm sulla superficie superiore e inferiore dell'ingranaggio per permettere il movimento. Lo strato superiore e la maggior parte del dispositivo ha un'apertura di µm 600 e l'asse per l'ingranaggio è 400 µm di diametro. Figura 5B Mostra le immagini del dispositivo quando è azionata con un magnete tale che l'ingranaggio esegue una rotazione completa, come si può osservare dalla variazione di posizione del segmento dell'ossido di ferro da (i) attraverso (vi).

figure-results-1
Figura 1 . Predisposizione montaggio base di idrogel micromachines. A) schema di fase di fabbricazione. Questo schema mostra i vari componenti dell'assetto fabbricazione tra cui la camera PDMS in cui nel caso degli idrogeli è formate all'interno dell'area di fabbricazione, una fase di vuoto-permessi che tiene giù la camera di PDMS così come si attacca la membrana flessibile per un testina micrometrica per il controllo di altezza e superiore substrato costituito da un vetrino coprioggetti non trattato o rivestito con PDMS. B) schema di vista superiore della fase fabbricazione (senza camera di PDMS). La sorgente di luce UV viene quindi posizionata tale che l'angolo di incidenza della luce è perpendicolare al piano orizzontale della fase di fabbricazione (non mostrato in figura). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2 . Schematica del dispositivo basato su idrogel di singolo-gear e maschere fotografiche utilizzate per ogni strato. A) schema di vista superiore e obliquo di un dispositivo basato su idrogel tipico che possa essere fabbricato usando questa strategia. Questo dispositivo è costituito da un singolo ingranaggio che contiene un segmento di ferro-drogati che consente un controllo magnetico. B) schema di strati individuali e dei componenti all'interno del dispositivo. Questo dispositivo singolo-gear è composto da un top di tenuta strato (i), strutture di supporto come il post per l'ingranaggio di ferro-drogati e le pareti del dispositivo (ii) come pure un strato di fondo (iii). C) Photomask disegni utilizzati per fabbricare il dispositivo single-gear. Le fotomaschere sono progettato buio del campo; mentre lo sfondo è scuro, vengono lasciate trasparente caratteristiche desiderate. Questo pannello mostra i disegni di fotomaschere corrispondente alla parte superiore di tenuta strato (i), strutture di sostegno (ii) e strato inferiore (iii). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3 . Fotolitografia strato-da-strato di base di idrogel micromachines. A) schema di procedura guidata per la fabbricazione di dispositivi all'interno dell'area di fabbricazione della camera PDMS. 1: un piccolo volume di prepolimero PEGDA è pipettato sul vetrino coprioggetti legato alla membrana flessibile della camera PDMS (substrato di fondo). Un pezzo di vetro non trattato coprioggetto è usato come il substrato superiore e un photomask è posto sulla cima di questo substrato superiore. L'altezza del substrato di fondo è portato all'altezza desiderata (Z1) utilizzando la testina micrometrica. Il prepolimero idrogel viene quindi esposto ai raggi UV luce attraverso strato di fotoresist. Il substrato superiore può essere sollevato quindi la camera di PDMS e idrogel resti aderiti al substrato superiore (nel riquadro). Questo strato è quindi riservato per un utilizzo successivo. 2: passaggio 1 viene ripetuto, ma il substrato superiore viene ora sostituito con vetro rivestite con PDMS. L'idrogelo polimerizzato rimarrà aderito al substrato di fondo. 3: l'altezza del substrato di fondo si abbassa (Z2> Z1) e più prepolimero possa essere aggiunti alla zona di fabbricazione. Viene utilizzato un secondo strato di fotoresist e il prepolimero viene esposto a luce UV ancora una volta. 4: passaggio 3 può essere ripetuto (Z3 > Z2) fino a quando vengono create le strutture di supporto desiderato. (i) una volta che le strutture di sostegno sono state completate, il substrato superiore può essere rimosso per consentire l'accesso all'area di fabbricazione per l'introduzione di eventuali componenti di idrogel preformati (ad es., ferro-drogati gear). (ii) una volta che i componenti preformati sono stati posizionati e allineati correttamente, lo strato di idrogel dal punto 1 possa essere poste sulla parte superiore della struttura fabbricata e allineato. 5: tutti i livelli vengono quindi esposte ai raggi UV luce attraverso un photomask che sigilla i bordi del dispositivo. (i) il passo di tenuta guarnizioni l'intero dispositivo, mentre i componenti interni sono schermati da ulteriore esposizione ai raggi UV. (ii) il dispositivo sigillato la camera di fabbricazione può essere sollevato quindi come esso avrebbe preferenzialmente aderire al substrato superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4 . Passaggi per doping di nanoparticelle di ossido di ferro dei componenti di idrogel. (i) luce UV viene esposto tramite un photomask definisce il segmento drogato con ossido di ferro all'interno l'ingranaggio di idrogel. (ii) sottile (200 µm) strati di idrogel drogato con ossido di ferro è polimerizzato ogni volta e impilati uno su altro. (iii) il livello di strati sottili crea un segmento con altezza totale di 1 mm. Questo segmento viene lasciato nel livello di fabbricazione. (iv) delle Nazioni Unite-drogato prepolimero è poi depositato nella zona di fabbricazione e un photomask che definisce la forma completa dell'ingranaggio viene quindi utilizzata durante il cross-linking. In questo modo la formazione dell'ingranaggio completo con un segmento drogato con ossido di ferro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5 . Fotopolimerizzazione di idrogel drogato con ossido di ferro componenti. A) Photomask del segmento gear per essere drogati con nanoparticelle di ossido di ferro. B) idrogel drogato con ossido di ferro che è stato perfettamente polimerizzato (10 s esposizione). C) idrogel drogato con ossido di ferro che è stato sotto-polimerizzati (4 s esposizione). D) idrogel drogato con ossido di ferro che è stato eccessivamente polimerizzato (20 s esposizione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6 . Allineamento di idrogel strati durante la sigillatura del dispositivo. A) immagine mostra il corretto allineamento di strati di idrogel con movimento libero dell'ingranaggio che è interamente all'interno il vuoto del dispositivo. B) immagine dispositivo visualizzando con strati di idrogel disallineati (B, C e D sono immagini del dispositivo stesso, ma con diversi strati evidenziati). C) stessa immagine come in (B) ma con contorni neri delucidamento fondo strati che sono correttamente allineati. L'ingranaggio è posizionato correttamente all'interno degli strati di fondo. D) stessa immagine come in (B) ma con contorni bianchi risultati di livello superiore non allineato di idrogel. L'ingranaggio è stato parzialmente polimerizzato durante la fase di tenuta e porzioni dell'ingranaggio (riempimento rosso) è stata ancorata per materiale alla rinfusa del dispositivo. Questo rende il dispositivo non funzionante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-7
Figura 7 . Azionamento di un singolo-gear basato su idrogel micromachine. A) immagine che mostra il dispositivo fabbricato. B) immagini che mostrano i diversi orientamenti dell'ingranaggio all'azionamento. (i) dall'orientamento iniziale (0°), l'ingranaggio viene ruotato per (ii) 60°, (iii) 120°, (iv) di 180°, (v) 240° e 300°. Barra della scala è di 1 mm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-8
Figura 8 . Montaggio versatile di vari disegni per base di idrogel micromachines. A) una semplice saracinesca che controlla il rilascio di farmaci da un singolo serbatoio. Il movimento lineare del componente idrogel drogato con ossido di ferro cancelli la diffusione di un ipotetico farmaco fuori attraverso e la presa. B) un collettore lineare con cancello che controlla il rilascio di farmaci da più serbatoi. Ciascun serbatoio contiene droghe ipotetici e il movimento delle porte della componente drogato con ossido di ferro il movimento dei farmaci fuori questi serbatoi attraverso una finestra di idrogel che permette per la diffusione di queste droghe fuori verso l'esterno. C) un semplice rotore può essere azionato per far girare attorno ad un asse. D) un design sofisticato basato sull'unità di Geneva. Un ingranaggio di azionamento con un pin è in grado di coinvolgere un più grande ingranaggio condotto e produrre movimento intermittente; una rotazione completa dell'ingranaggio di azionamento consente di ruotare l'ingranaggio condotto di 60°. Tutte le barre della scala sono di 1 mm. Dal mento, S. Y. et al. Additive produzione di materiali a base di idrogel per la prossima generazione di dispositivi medici impiantabili. Scienza robotica. 2 (2), (2017). Ristampato con il permesso da AAAS17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questa tecnica è un metodo facile e rapido per fotolitografia strato dopo strato di microstrutture di idrogel. Utilizzando un additivo approccio di produzione, possiamo costruire facilmente una varietà di strutture 3D fuori materiali biocompatibili e perfino incorporare parti in movimento. Ciò consentirebbe così la formazione di microdispositivi completamente biocompatibile. La tecnica si basa sulla semplice ripetizione di passaggi di Litografia, che è abilitato per il controllo preciso dell'altezza del substrato di fondo tramite una testina micrometrica. Le tecniche di fabbricazione tradizionali utilizzate nel settore dei MEMS, che coinvolge duro tecniche e i materiali sacrificale, spesso non è compatibile con l'elaborazione di idrogeli morbidi. Altri metodi per idrogeli di stampa 3D, ad esempio metodi basati su estrusione, sono limitati a risoluzioni spaziali sopra 200 µm e stampa velocità mm/s per strutture semplici che non includono lo spostamento di parti18,19. Stereolitografia (SLA) e progetto luce digitale (DLP) basato bioprinters forse essere in grado di raggiungere la migliore risoluzione, ma sono anche molto più costoso per l'installazione. Queste strategie di fabbricazione non sono anche in grado di stampare facilmente le sporgenze senza il supporto del materiale di substrato, che potrebbero essere difficile da introdurre e rimuovere dal dispositivo completato. Abbiamo qesto allineando e polimerizzando un strato di sigillante pre-formato alla struttura portante fabbricato come passo finale per formare il dispositivo completato. La progettazione dell'allestimento fabbricazione dà all'utente l'accesso facile alle strutture fabbricate e consente la semplificano l'allineamento dei vari componenti con l'uso di indicatori di allineamento.

La strategia presentata qui è anche molto più veloce rispetto ad altre tecniche di risoluzioni simili; il tempo totale impiegato per la fabbricazione dimostrata del dispositivo con una rotazione è a circa 15 minuti. Un altro aggiunto vantaggio di questa strategia di fabbricazione, anche se non ha dimostrato in questo protocollo, ma illustrato nel nostro precedente lavoro17, è la possibilità per l'utente a rapidamente e facilmente modificare il tipo di polimero utilizzato tra i passaggi che possono essere fatto in piccoli volumi . In questo modo, si possono creare dispositivi che sono costituiti da diversi tipi di idrogeli. Il dispositivo fabbricato utilizzando questa strategia inoltre presenta il vantaggio aggiunto di azionamento senza contatto come l'ingranaggio contiene un segmento che è drogato con nanoparticelle di ossido di ferro, l'ingranaggio di rendering sensibili ad azionamento magnetico e così può essere azionato tramite un esterno magnete. Inoltre, il dispositivo è completamente biocompatibile e quindi può essere tranquillamente impiantato in vivo.

Una caratteristica importante di questa tecnica è il trattamento dei substrati di vetro differenti, che consente all'utente di preferenzialmente aderire o respingere l'idrogelo polimerizzato a substrato di vetro superiore o inferiore. Quando viene utilizzata una combinazione di vetro non trattato con una superficie di vetro PFOTS-trattati (substrato di fondo), idrogeli formati preferenzialmente aderirà a vetro non trattato, come essi sono respinti dalla superficie del vetro PFOTS-trattati fluorurati. Al contrario, quando vetro rivestite con PDMS è usato con il substrato di fondo PFOTS-trattati, idrogeli tenderà a rimanere sulla superficie PFOTS-trattati come PDMS superfici più fortemente respingono gli idrogeli formati. Questa funzionalità permette di costruire verso l'alto, aderiscono idrogeli tale che essi sono immobilizzati su substrati di vetro e possono essere riservati per allineamento ad altre strutture in un secondo momento nel tempo o addirittura costruire verso il basso. Ciò aggiunge alla flessibilità della tecnica e tipi di disegni che possono essere fabbricati, nonché consente l'incorporazione e la sigillatura di componenti di idrogel indipendenti, liberi di muoversi.

Durante la fabbricazione di strato dopo strato, è importante ottimizzare il tempo di polimerizzazione utilizzato. Idrogeli dovrebbero essere reticolati in modo ottimale tale che formano a spessore completo così come a alta fedeltà rispetto le forme definite da strato di fotoresist. Questo dipende la potenza della lampada e il tipo di idrogel usato. Anche se non indicato nel presente protocollo, il tempo di polimerizzazione diminuisce con la crescente potenza della lampada e aumenta con l'aumento di lunghezza della catena di PEG e diminuire le concentrazioni di PEGDA utilizzato. Altri fattori che influenzano la quantità di energia disponibile per fotopolimerizzazione, ad esempio il cambiamento di opacità del prepolimero a causa dell'aggiunta di nanoparticelle di ossido di ferro (Figura 4), influisce anche il tempo di polimerizzazione. Ottimizzazione per cross-linking condizioni per idrogel diverse composizioni così è necessaria prima dell'inizio del processo di fabbricazione dei dispositivi.

L'uso di indicatori di allineamento sulle maschere fotografiche e il corretto allineamento degli strati idrogel, soprattutto lo strato finale di tenuta, sono importanti per garantire la corretta tenuta viene eseguita, che i componenti interni non sono inavvertitamente reticolati per la strutture di sostegno circostanti durante il processo di fabbricazione. Ciò impedirebbe questi componenti di muoversi liberamente durante l'azionamento magnetico. Come illustrato nella Figura 5, un top disallineato tenuta strato e strato di fotoresist provoca la reticolazione e l'ancoraggio di una porzione del gear per materiale alla rinfusa del dispositivo stesso. Di conseguenza, questo ingranaggio non ruota quando azionato con un magnete.

I dispositivi possono essere attivati mediante forti magneti permanenti come i magneti al neodimio. Questi magneti generano forti forze magnetiche quando nelle immediate vicinanze di materiali ferromagnetici e cura deve essere presa per evitare lesioni. Il dispositivo può essere azionato per spostare senza il magnete a contatto con il dispositivo; il magnete può essere tenuto o posto ~ 1cm dal dispositivo. Il movimento dei componenti ferro-drogati dovrebbe rispecchiare il movimento del magnete e può essere azionato per spostare continuamente o orientato ad intermittenza come desiderato. Il dispositivo può essere azionato manualmente o un set-up di azionamento può essere utilizzato. Il magnete può essere collegato a qualsiasi attuatore (ad es., servomotore) al movimento di rotazione. La velocità di rotazione del magnete, e quindi la velocità di rotazione del componente drogato con ferro, può essere controllato utilizzando un microcontrollore. Questo fornisce un metodo più preciso dell'azionamento.

Figura 8 Mostra schemi e immagini di vari disegni rispetto ai lavori precedenti che sono stati fabbricati usando la stessa tecnica e dimostrano la versatilità di questo metodo. Questi disegni vanno da semplici dispositivi che assomigliano a valvole (Figura 8A) ai disegni più complicati e sofisticati che traggono ispirazione dalla progettazione di auto Geneva (Figura 8) che è composto da 2 ingranaggi impegnati che producono intermittente movimento. Le caratteristiche più piccole che possono essere generate utilizzando questa tecnica sono stati in genere circa 100 µm e ogni disegno è composta di strati multipli (da 3 a 6 strati). Diversi tipi di composizioni di idrogel (con diverse resistenze meccaniche e porosità) possono essere polimerizzati e legati a vicenda. Da qui, si possono facilmente combinare i tipi di idrogeli da utilizzare all'interno di un dispositivo a seconda della funzione desiderata dei vari componenti all'interno del dispositivo.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da un premio alla carriera di NSF, NIH R01 grant (HL095477-05) e NSF ECCS-1509748 grant. S.Y.C. è stato sostenuto dalla National Science borsa (PhD), che è stato premiato dall'Agenzia per la scienza, la tecnologia e la ricerca (Singapore). Ringraziamo Keith Yeager per aiuto con la costruzione del set-up di fabbricazione e Cyrus W. Beh per fotografie del set-up e dispositivi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Poli(glicole etilenico) (n) diacrilato [MW 400Da]Polysciences, Inc01871-250Reagente PEGDA per prepolimero
Darocur 1173Ciba Specialty Chemicals,Inc-Fotoiniziatore
Ossido di ferro (II, III)Sigma Aldrich637106-25G Nanoparticelle di ossido di ferro
Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silanoSigma Aldrich448931Composto fluorurato che viene utilizzato per silanizzare a vapore la camera PDMS per prevenire l'adesione dell'idrogel al vetrino coprioggetto che è legato alla membrana PDMS flessibile con l'uso prolungato della camera PDMS
, vetroSigma AldrichBR455743Piastre di Petri in vetro per la colata di strati PDMS per la formazione della camera
PDMSKit di elastomeri siliconici Sylgard 184 (PDMS)Dow Corning240-4019862PDMS per camera di fabbricazione
Vetrini coprioggetti in vetro (n. 2), 50 x 45 mmFisher ScientificFIS#12-543FSubstrati in vetro che coprono la camera di fabbricazione
Pinze a punta piatta diritta Fisherbrand 4,75 polliciFisher ScientificFIS#16-100-112Pinzette per la manipolazione di strati/dispositivi di idrogel polimerizzato
Omnicure S2000Cadence Technologies Pte Ltd010-00148RLampada UV
Adattatore di collimazione regolabile da 5 mmCadence Technologies Pte Ltd810-00042Collimatore per sorgente di luce UV
FotomaschereCAD/Art ServicesInc-Photomasks utilizzate per definire le microstrutture dell'idrogel
Adobe IllustratorAdobe-Progettazionedi fotomaschere

Riferimenti

  1. Elman, N. M., Ho Duc, H. L., Cima, M. J. An implantable MEMS drug delivery device for rapid delivery in ambulatory emergency care. Biomedical Microdevices. 11 (3), 625-631 (2009).
  2. Gensler, H., Sheybani, R., Li, P. Y., Mann, R. L., Meng, E. An implantable MEMS micropump system for drug delivery in small animals. Biomedical Microdevices. 14 (3), 483-496 (2012).
  3. Grayson, A. C. R., et al. BioMEMS review: MEMS technology for physiologically integrated devices. Proceedings of the IEEE. 92 (1), 6-21 (2004).
  4. Frost, M., Meyerhoff, M. E. In vivo chemical sensors: tackling biocompatibility. Analytical Chemistry. 78 (21), 7370-7377 (2006).
  5. Voskerician, G., et al. Biocompatibility and biofouling of MEMS drug delivery devices. Biomaterials. 24 (11), 1959-1967 (2003).
  6. Ainslie, K. M., Desai, T. A. Microfabricated implants for applications in therapeutic delivery, tissue engineering, and biosensing. Lab Chip. 8 (11), 1864-1878 (2008).
  7. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
  8. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  9. Alcantar, N. A., Aydil, E. S., Israelachvili, J. N. Polyethylene glycol-coated biocompatible surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 51 (3), 343-351 (2000).
  10. Cruise, G. M., et al. In vitro and in vivo performance of porcine islets encapsulated in interfacially photopolymerized poly(ethylene glycol) diacrylate membranes. Cell Transplantation. 8 (3), 293-306 (1999).
  11. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  12. Ryu, W., Huang, Z., Prinz, F. B., Goodman, S. B., Fasching, R. Biodegradable micro-osmotic pump for long-term and controlled release of basic fibroblast growth factor. Journal of Controlled Release. 124 (1-2), 98-105 (2007).
  13. Lee, J. W., Park, J. H., Prausnitz, M. R. Dissolving microneedles for transdermal drug delivery. Biomaterials. 29 (13), 2113-2124 (2008).
  14. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758(2015).
  15. Tseng, H., et al. Fabrication and mechanical evaluation of anatomically-inspired quasilaminate hydrogel structures with layer-specific formulations. Annals of Biomedical Engineering. 41 (2), 398-407 (2013).
  16. Grogan, S. P., et al. Digital micromirror device projection printing system for meniscus tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7218-7226 (2013).
  17. Chin, S. Y., et al. Additive manufacturing of hydrogel-based materials for next-generation implantable medical devices. Science Robotics. 2 (2), (2017).
  18. Diogo, G. S., Gaspar, V. M., Serra, I. R., Fradique, R., Correia, I. J. Manufacture of beta-TCP/alginate scaffolds through a Fab@home model for application in bone tissue engineering. Biofabrication. 6 (2), 025001(2014).
  19. Hockaday, L. A., et al. Rapid 3D printing of anatomically accurate and mechanically heterogeneous aortic valve hydrogel scaffolds. Biofabrication. 4 (3), 035005(2012).

Ristampe e permessi

Tag

Micromacchine in idrogelMetodo di fotolitografiaPrepolimero PEGDAOssido di ferro superparamagneticoAttuazione magneticaCamera in PDMSEsposizione UVFabbricazione strato su stratoAssemblaggio di componenti mobiliDispositivi biocompatibili
Un additivo tecnica di fabbricazione per la Facile e rapida realizzazione di Micromachines base di idrogel con componenti magneticamente reattivi
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.