Osservazione e analisi del lampeggiante superficie-enhanced Raman Scattering

Yasutaka Kitahama

doi:10.3791/56729

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Articolo metodologico

Osservazione e analisi del lampeggiante superficie-enhanced Raman Scattering

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DOI:

10.3791/56729

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11 gennaio 2018

Yasutaka Kitahama¹

¹Department of Chemistry, Kwansei Gakuin University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'analisi del lampeggiante superficie-enhanced Raman scattering dovuto il cammino casuale di una singola molecola su una superficie d'argento utilizzando leggi di potenza.

Abstract

Da una singola molecola in un incrocio di nanoaggregati argento, lampeggiante superficie-enhanced Raman scattering (SERS) è osservato. Qui, un protocollo è presentato su come preparare il SERS-attivo argento nanoaggregati, registrare un video di alcuni punti lampeggianti dell'immagine microscopica e analizzare le statistiche di lampeggiante. In questa analisi, una legge di potenza riproduce le distribuzioni di probabilità per eventi luminosi rispetto alla loro durata. Le distribuzioni di probabilità per eventi oscuri sono dotate di una legge di potenza con una funzione esponenziale. I parametri della legge di potere rappresentano il comportamento molecolare negli Stati sia chiaro e scuri. Il modello di random walk e la velocità della molecola su tutta la superficie d'argento può essere stimati. È difficile stimare anche quando si utilizzano medie, funzioni di autocorrelazione e super-risoluzione SERS imaging. In futuro, analisi di legge di potenza dovrebbero combinarsi con imaging spettrale, perché le origini del lampeggiante non possono essere confermate da questo metodo di analisi da solo.

Introduzione

Superficie-enhanced Raman scattering (SERS) è altamente sensibile spettroscopia Raman da una superficie di metallo nobile. Poiché lo spettro Raman fornisce informazioni dettagliate sulla struttura molecolare sulla base delle posizioni di picco acuto, attraverso i modi vibrazionali di gruppi funzionali nelle molecole, è possibile analizzare le informazioni di una singola molecola su una superficie metallica usando SERS¹^,²^,³. Da un argento nanoaggregati con un adsorbato a livello di singola molecola, un segnale lampeggio è osservato¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶e lo spettro fluttua¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^, ⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. Lampeggiante può essere indotta da una singola molecola che casualmente si muove dentro e fuori un maggiore campo elettromagnetico (EM) in un incrocio di nanoaggregati d'argento di dimensioni nanometriche. Di conseguenza, lampeggiante è considerato prova semplice per il rilevamento di singola molecola, confrontato con una tecnica che utilizza una distribuzione di Poisson di intensità di SERS e un bi-analita²^,³^,¹⁷. Tuttavia, i meccanismi dettagliati dello spettro lampeggio e fluttuante, che può dipendere fortemente il comportamento molecolare sulla superficie Ag, sono ancora controversi.

Negli studi precedenti, lampeggiante SERS è stato analizzato utilizzando la funzione di autocorrelazione, che può calcolare il coefficiente di diffusione e la concentrazione delle molecole in movimento dentro e fuori un'avanzata EM campo¹²^,¹³^,¹⁴. Inoltre, un punteggio di deviazione standard normalizzata, che rappresenta instabilità dell'intensità totale, è stato derivato dal profilo tempo del segnale¹⁵. Tuttavia, questi approcci analitici possono basarsi sul comportamento di alcune molecole. Al contrario, in un imaging di Super-risoluzione del lampeggiante SERS, comportamento di singola molecola in un maggiore campo di EM può essere identificato¹⁶. Tuttavia, queste tecniche possono ottenere tali parametri solo in un maggiore campo di EM. Il comportamento casuale di una singola molecola all'interno di una vasta gamma (per esempio, nel lampeggiante SERS) può essere rappresentato come una legge di potenza piuttosto che una media⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸ ^,⁹^,¹⁰^,¹¹, simili a fluorescenza lampeggia da un singolo semiconductor quantum dot (QD)¹⁸^,¹⁹. Utilizzando un potere legge analisi⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹, comportamento molecolare può essere stimato in stato brillante (nel campo EM avanzato) sia stato scuro¹⁰; ovvero, il comportamento della molecola su tutta la superficie d'argento può essere stimato.

Per questa tecnica, argento colloidale nanoaggregati sono usato⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Questi nanoaggregati mostrano varie bande di risonanza (LSPR) plasmonica di superficie localizzata che influiscono fortemente rafforzate campi elettromagnetici quando sono eccitati a determinate lunghezze d'onda. Così, argento SERS-attivo nanoparticelle presenti in sospensione colloidale e alcuni dati immediatamente possa essere ottenuto. Nel caso di semplice nanostrutture, che hanno accordi, forme e dimensioni specifiche, la dipendenza di LSPR della SERS lampeggiante può celare altre dependences⁷; vale a dire, se la nanostruttura buona o cattiva a LSPR viene utilizzata, i parametri sarà costanti, e le altre dipendenze pertanto saranno nascosto. Analisi della legge di potenza sono stato utilizzato per scoprire varie dipendenze della SERS lampeggiante da argento colloidale nanoaggregati⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹.

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Protocollo

1. preparazione del campione

Preparazione di nanoparticelle di argento colloidale ²⁰
1. Per fabbricare le nanoparticelle d'argento colloidale, sciogliere 0,030 g di nitrato d'argento e 0,030 g di citrato trisodico biidrato in 150 mL di acqua in un pallone a fondo tondo 200 mL.
2. Combinare la beuta con un refrigerante a ricadere (Dimroth).
3. Agitare la soluzione in un matraccio con una barra magnetica di agitatore e mescolare. Quindi, riscaldare la soluzione mescolando nel matraccio in bagno d'olio a 150 ° C per 60 min.
  Nota: La soluzione diventerà grigio giallo, poi latteo.
4. Raffreddare la sospensione a temperatura ambiente e a mantenere la sospensione nel pallone coperto con foglio di alluminio in frigorifero.
  Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto. Utilizzare le nanoparticelle colloidali, dopo la conservazione in frigorifero, entro un mese.
Preparazione del campione per multi-colorato lampeggiante emissione ¹¹
1. Per preparare un vetrino da microscopio, lavare a mano, una lastra di vetro con sapone e risciacquare con acqua.
2. Aggiungere 0,1% soluzione acquosa di poli-L-lisina per la lastra di vetro e rimuovere la soluzione con un ventilatore.
3. Aggiungere la sospensione colloidale d'argento per la lastra di vetro e rimuovere la sospensione con un ventilatore.
4. Racchiudere un'area di rilascio sulla lastra di vetro con una penna di liquido bloccante.
5. Acqua distillata goccia sulla lastra di vetro e coprire con un'altra lastra di vetro per creare un vetrino da microscopio e impedire l'evaporazione di acqua.
Preparazione del campione per monotono SERS lampeggiante colorato ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰
1. Per preparare un vetrino da microscopio, lavare a mano, una lastra di vetro con sapone e risciacquare con acqua.
2. Mescolare la sospensione colloidale d'argento con la tintura di thiacyanine o thiacarbocyanine (25 o 4 µM, rispettivamente) e una soluzione acquosa di NaCl (10 mM) a un rapporto volumetrico di 2:1:1.
3. Eliminare la sospensione del campione sulla piastra di vetro e rimuovere la sospensione con un ventilatore.
4. Racchiudere un'area di rilascio sulla lastra di vetro con una penna di liquido bloccante.
5. Goccia di una soluzione acquosa di NaCl (1 M) sul piatto di vetro per immobilizzare le nanoparticelle d'argento e coprire con un'altra lastra di vetro per creare una piastra di scorrimento microscopio e impedire che la soluzione di evaporazione.

2. osservazione del lampeggiante nanoparticelle d'argento

Illuminazione del campione
1. Posizionare la piastra di vetro di campione preparata con protocollo 1.2 o 1.3 sulla scena di un microscopio invertito.
2. Illuminare la lastra di vetro del campione usando la luce bianca attraversa un condensatore per campo oscuro e la messa a fuoco su vari punti colorati (blu, verde, gialli e rossi) sulla lastra di vetro utilizzando una lente obiettiva (60 X).
3. Illuminare la lastra di vetro di campione utilizzando un fascio di luce attenuata, consegnato ad un angolo di 30° rispetto alla superficie del campione, da un laser a diodi a stato solido pompato (DPSS) continuo-fluttui (cw) attraverso un filtro antidisturbo.
4. Per utilizzare laser illuminazione per osservare l'argento nanoaggregati come macchie di colore monotoni in zona dello stesso colore, spostare l'area di illuminazione laser al centro della vista e concentrarsi sui punti sulla lastra di vetro regolando la fase nella direzione z.
Osservazione del lampeggiante
1. Inserire un filtro passa-lungo dopo la lente dell'obiettivo e illuminare la lastra di vetro di campione utilizzando un fascio di cw-laser DPSS consegnato ad un angolo di 30° rispetto la superficie del campione attraverso un filtro antidisturbo.
2. Trovare il lampeggio macchie come mostrato in Figura 1 (Vedi anche Figura S1 nel materiale supplementare) spostando il palco nelle direzioni x e y.
3. Registrare video dei luoghi lampeggianti con il microscopio invertito, accoppiato ad una fotocamera raffreddato digitale charge coupled device (CCD), che ha una risoluzione temporale di 61-120 ms, per 20 min.

3. analisi del lampeggiante SERS

Derivazione del profilo di tempo dal video
1. Nel software che controlla la telecamera CCD, aprire il file video.
2. Per selezionare i punti lampeggianti e zona scura, trascinare aree che coprono separatamente aree con e senza macchie nell'immagine video.
3. Per derivare i profili orario di intensità di segnale dal lampeggiante macchie e aree scure nel video, selezionare Analisi temporale nell'analisie fare clic su Calcola nella finestra Analisi temporale .
4. Salvare i dati come file di testo.
Analisi del profilo tempo
1. Appiattire una previsione del profilo orario sottraendo il profilo orario dall'area scura e/o raccordo con una funzione polinomiale, come mostrato nelle figure 2A e 2B.
2. Valutare un'intensità media della linea di base che consiste di circa 2000 punti, io_basee una deviazione standard di intensità della linea di base, σ, come mostrato nelle figure 2 e 2D.
3. Distinguere eventi luminosi da eventi oscuri con maggiore intensità di una soglia di ho_base + 3 σ e registrare la durata di ogni evento. Nella Figura 3, ad esempio, registrare l'evento da 0 a 3.5476 s come l'evento scuro (con una durata di t = 3.5476 s) e registrare l'evento da 3.5476 a 4.0981 s come l'evento luminoso (con una durata di t = 0.5505 s). Ripetere la procedura come indicato nella tabella 1.
4. Contare il numero di eventi di chiari e scuri per ogni durata, come espresso nelle linee prime e seconda della tabella 2.
5. Sommare il numero di eventi per ogni durata, fatta eccezione per eventi più brevi di durata t. Come espresso nella seconda e terza riga della tabella 2, ad esempio, sommare il numero di eventi per ogni durata (fatta eccezione per gli eventi per t = 0.0612 s) come 41 + 18 + 9 +...; il risultato è uguale la somma per t = 0.1223 s, cioè 103.
6. Dividere le sommatorie per ogni durata e normalizzarli. Come espresso nella tabella 2, per esempio, dividere la somma per durata t = 0.0612 s dalla durata 0.0612 s. Il risultato è 3,351.5791. Poi, dividere il risultato per il totale dei risultati nella quarta riga nella tabella 2. La distribuzione di probabilità è derivata per essere 0.64494.
7. Tracciare le distribuzioni di probabilità per il brillante eventi P_su(t) contro la loro durata t in un grafico del logaritmo logaritmo e montare Log₁₀P_su(t) di Log₁₀() per dedurre il power legge esponente α_su per uno specifico lampeggio spot. Se P_su(t) viene montata dal , la linea componibile devia dai terreni a piccoli valori di P_su(t), come indicato dalla linea tratteggiata in Figura 4A.
8. Tracciare le distribuzioni di probabilità per eventi oscuri P_off(t) contro la loro durata t in un grafico del logaritmo logaritmo e Log₁₀P_off(t) in forma di Log₁₀( dedurre power legge esponente α_fuori e il troncamento tempo τ dal lampeggio stesso spot. Se P_off(t) viene montata dal , la curva si discosta dai terreni a piccoli valori di P_off(t).
9. Ripetere 3.2.1 a 3.2.8 per gli altri punti lampeggianti nel video.

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Risultati

Dall'argento nanoaggregati con poli-L-lisina preparato dal protocollo 1.2, si osservano macchie multicolore lampeggiante da SERS e superficie-enhanced fluorescenza, come illustrato nella Figura 1¹¹. Al contrario, monotoni punti colorati lampeggiante da SERS sono stati osservati per i nanoaggregati d'argento con le molecole di colorante preparate dal protocollo 1.3⁷^,⁸^,

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Discussione

Dallo svincolo di nanoaggregati argento, SERS è emessa. Quindi, abbiamo bisogno di preparare nanoaggregati piuttosto che nanoparticelle colloidali, che sono coperti con gli anioni citrato. Aggregati d'argento sono formati dall'effetto creato tramite l'aggiunta di poli-L-lisina, che ha -NH₃⁺ ed è l'origine della SERS, la salatura o cationi Na⁺ da NaCl, come mostrato in Figura S2 del materiale supplementare. Inoltre, per illuminare i molti punti nella vasta area, il raggio ...

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Dichiarazioni

L'autore non ha nulla di divulgare.

Ringraziamenti

L'autore ringrazia il Prof Y. Ozaki (Kwansei Gakuin University) e Dr. T. Itoh (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) per la loro proficua discussione su quest'opera. Questo lavoro è stato supportato da KAKENHI (sovvenzione per Scientific Research C) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (n. 16K 05671).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nitrato d'argento, 99,8%	Wako	194-00832
Citrato trisodico diidrato, 99. %	Wako	191-01785
Soluzione acquosa di poli-L-lisina, 0,1%	Sigma-Aldrich	P8920
3,3'-disolfopropiltiacianina trietilammina	Hayashibara Biochemical Laboratories	NK-2703	un tipo di coloranti
tiacianina3,3'-dietil-5,5'-dicloro-9-metiltiacarbocianina sale di iodio	Hayashibara Biochemical Laboratories	SMP-9	un tipo di coloranti tiacarobocianina
Cloruro di sodio, 99,5%	Wako	191-01665
Condensatore Dimroth	Iwaki	61-9722-22	perchased from AS ONE
Agitatore magnetico	Corning	DC-420D
Bagno	d'olioAdvantech	OS-220
Lastra di vetro	Matsunami	S-1112	Soffiatore per vetrini per microscopio
	Hozan	Z-288	Spolverino d'aria
Penna bloccante per liquidi	Daido Sangyo		LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Penna barriera idrofobica pronta all'uso progettata per applicazioni di immunoistochimica
Microscopio invertito	Olympus	IX-70
Obiettivo	Olympus	LCPlanFl 60×	NA 0,7
Condensatore a campo scuro	Olympus	U-DCD	NA 0.8– 0.92
Telecamera CCD digitale raffreddata	Hamamatsu	ORCA-AG	controllata dal software Aqua Cosmos
Software per la telecamera CCD digitale raffreddata	Hamamatsu	AquaCosmos	utilizzata anche per la derivazione dei profili temporali dai punti lampeggianti nel video
Telecamera CCD a colori	ELMO	TNC-C920	non utilizzata per l'analisi
DPSS laser	RGB sistema laser	NovaPro532-75	λ = 532 nm; 60 mW (corrisponde a una densità di potenza di 600 W/cm2)
Filtro interferenze	Semrock	LL01-532-12.5
Filtro passa-lungo	Semrock	BLP01-532R-25
Software per la distinzione e il conteggio degli eventi luminosi/scuri	cameriera		programmata da C++
Software per il montaggio tramite una legge di potenza	: LightStone	Origin6.1

: : ,

Riferimenti

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