Articolo metodologico
Determinare la diversità fungina all'interno di un ambiente è un metodo utilizzato in studi di salute sul lavoro per identificare i pericoli per la salute. Questo protocollo descrive estrazione del DNA dai campioni d'aria professionali per l'amplificazione e sequenziamento delle regioni ITS fungine. Questo approccio rileva molte specie fungine che possono essere trascurati dai metodi tradizionali di valutazione.
Tradizionali metodi di identificazione fungine esposizioni negli ambienti di lavoro, quali la cultura e gli approcci basati su microscopia, presentano alcune limitazioni che hanno provocato l'esclusione di molte specie. Gli avanzamenti nel campo negli ultimi due decenni hanno condotto i ricercatori di salute professionale a cui rivolgermi approcci molecolari per identificare i pericoli fungini. Questi metodi hanno portato nella rilevazione di molte specie all'interno degli ambienti indoor e sul lavoro che non sono stati rilevati utilizzando metodi tradizionali. Dettagli di questo protocollo un approccio per determinare la diversità fungina all'interno aria campioni attraverso estrazione del DNA genomico, amplificazione, sequenziamento e identificazione tassonomica di fungine interno trascritto regioni distanziale (ITS). I risultati di sequenziamento nella rilevazione di molte specie fungine che sono non rilevato o difficile da identificare a livello di specie mediante coltura o microscopia. Mentre questi metodi non forniscono misure quantitative dell'onere fungine, offrono un nuovo approccio all'identificazione del pericolo e può essere utilizzati per determinare la complessiva ricchezza di specie e la diversità all'interno di un ambiente di lavoro.
Fungine esposizioni in ambienti indoor e sul lavoro possono causare morbidità respiratoria, compresa la sensibilizzazione allergica e asma1. Identificazione dei pericoli fungini è importante per la valutazione del rischio e prevenire l'esposizione del lavoratore. Questi pericoli fungini possono essere un risultato di contaminazione interna, intrusione di aria esterna o disturbi ambientali che provocano il trasporto di materiali fungine in aree dove i lavoratori sono presenti2. Metodi per valutare l'esposizione fungina hanno incluso campionamento cultura vitale, come pure l'identificazione microscopica delle spore fungine....
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1. preparare il campionatore di aerosol NIOSH
Nota: Il campionatore di aerosol NIOSH è un campionatore di aerosol bistadio ciclone che raccoglie bioaerosols utilizzando due tubi di campionamento e di un filtro di politetrafluoroetilene (PTFE).
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La distribuzione delle specie all'interno di un ambiente può essere valutata mediante la determinazione del numero di cloni di ogni OTU identificato nei campioni di aria abbondanza relativa. Nella figura 6 è un grafico di corona che rappresenta la specie tassonomicamente posizionata all'interno di un ambiente interno dopo 60 min di campionamento dell'aria. Si può osservare che l'ambiente contiene una varietà di specie all'interno di due principali phyla fungo.......
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Determinare la diversità fungina all'interno di un ambiente di lavoro utilizzando approcci basati su sequenziamento è migliorata individuazione ed esposizione di pericolosità fungine. Utilizzando questo approccio ha permesso per la rilevazione di molte altre specie fungine che spesso non vengono rilevati utilizzando metodi basati su microscopia di valutazione o di cultura. Qui viene presentato un metodo per campionamento bioaerosols da ambienti professionali e coperto e l'estrazione del DNA genomico dai campioni d'aria p.......
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Le risultanze e le conclusioni in questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale dell'Istituto nazionale per salute e sicurezza sul lavoro, centri per controllo e la prevenzione.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un accordo tra agenzie tra NIOSH e NIEHS (AES12007001-1-0-6).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Campionatore a ciclone per bioaerosol NIOSH BC251 | NIOSH | BC251 | Il campionatore NIOSH non è ancora disponibile in commercio. Si prega di contattare William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) per informazioni su come ottenere il campionatore NIOSH |
| Fisherbrand Provette sterili per microcentrifuga con tappi a vite | Fisher Scientific | 02-681-373 | Provette per microcentrifuga in polipropilene da 1,5 mL per il campionamento dell'aria; la filettatura della parte superiore della vite deve corrispondere alla filettatura del campionatore NIOSH |
| Provette per centrifuga coniche Falcon da 15 mL | Provette in polipropilene Corning | 352096 | da 15 mL per il campionamento dell'aria |
| Nastro in vinile per camera bianca, facile da rimuovere, larghezza 1/4" | McMaster-Carr | 76505A1 | sigillante |
| Cassetta filtro, stirene trasparente, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | Cassetta di campionamento in 3 pezzi (senza filtro). Contiene: base a cassetta, cappuccio di prolunga, tappo a cassetta e tappi di ingresso/uscita Filtri |
| membrana fluoropori idrofobici in PTFE, 3.0 e micro; m, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contiene: 37 mm, 3.0 µ m Filtri in PTFE e tamponi di supporto |
| Pinze filtranti Fisherbrand Pinze | filtranti | Fisher Scientific | 09-753-50 |
| Modello 502 Precision PanaPress | a cassetta PanaVise | 502 | è costruita con questa pressa ad albero di precisione |
| Nastro isolante in vinile Scotch Super 33+ | McMaster-Carr | 76455A21 | Nastro da 19 mm |
| Barattolo di calibrazione multiuso, SKC grande | Inc. | 225-112 | Vaso di calibrazione |
| Pompa per campioni universale PCXR4 | SKC Inc. | 224-PCXR4 | pompa di campionamento |
| Misuratore di portata massica 4140 | TSI Inc. | Misuratore di portata | 4140 |
| Kit modello PCR ad alta purezza Roche | diagnostico Roche | l'estrazione | del DNA genomico. Contiene: Tampone di lisi, tampone di legame, proteinasi K, tampone di rimozione degli inibitori, tampone di lavaggio, tampone di eluizione, provette filtranti in fibra di vetro e provette di raccolta da 2 ml |
| Fisherbrand Provette con tappo a vite in polipropilene rinforzato da 2 ml Fisherbrand con tappi Fisher | Scientific | 15340162 | Provette rinforzate da 2 mL per l'omogeneizzazione delle perle |
| Perle di vetro, lavate con acido, 212-300 e micro; m | Perle di vetro Sigma-Aldrich | G1277 | Fisher |
| Scientific Bead Mill 24 Omogeneizzatore | Fisher Scientific | 15-340-163 | Omogeneizzatore di perline |
| CelLytic B Reagente per lisi cellulare, 10X | Reagente di lisi | Sigma-Aldrich | C8740 |
| Platinum Taq polimerasi | Invitrogen | 10966-018 | Contiene: Platino Taq polimerasi, tampone PCR 10X (senza MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit utilizzato per purificare gli ampliconi fungini. Contiene: Buffer PB (tampone legante), Buffer PE (tampone di lavaggio), Buffer EB (tampone di eluizione), colorante indicatore di pH (opzionale) e colorante di caricamento GelPilot |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System Thermo | Fisher | B1 o B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA |
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