Fungine esposizioni in ambienti indoor e sul lavoro possono causare morbidità respiratoria, compresa la sensibilizzazione allergica e asma1. Identificazione dei pericoli fungini è importante per la valutazione del rischio e prevenire l'esposizione del lavoratore. Questi pericoli fungini possono essere un risultato di contaminazione interna, intrusione di aria esterna o disturbi ambientali che provocano il trasporto di materiali fungine in aree dove i lavoratori sono presenti2. Metodi per valutare l'esposizione fungina hanno incluso campionamento cultura vitale, come pure l'identificazione microscopica delle spore fungine. Questi approcci hanno diverse limitazioni e spesso si affacciano molte specie fungine che potrebbero contribuire al generale fungine onere3. Approcci basati sulla cultura è in grado di distinguere solo quegli organismi fungine vitali che possono essere coltivate su terreni di coltura. Identificazione di spore fungine a livello di specie tramite microscopia può essere confuso dalle spore simili morfologie di condivisione. Entrambi i metodi sono altamente dipendenti micologi per analizzare ed identificare le specie fungine, con molti restanti non identificato.
Per migliorare le metodologie esistenti utilizzate nell'identificazione di rischio professionale e valutazioni dell'esposizione, molti ricercatori si sono rivolti a tecnologie molecolari. Approcci basati sul sequenziamento per la valutazione della diversità microbica all'interno degli ambienti indoor e sul lavoro hanno rivelato un ampio spettro di specie fungine incontrato rispetto ai metodi quali microscopia e vitale cultura3,4 ,5. Il metodo presentato qui descrive il campionamento dell'aria di ambienti di lavoro e l'estrazione del DNA genomico per l'identificazione di potenziali pericoli fungini. Identificazione del pericolo avviene mediante sequenziamento il distanziatore trascritto interno ribosomal nucleare o ITS, regioni che sono altamente variabili tra funghi e sono stati comunemente utilizzate per differenziare le specie fungine6,7, 8,9. Molte specie si trovano in ambienti di lavoro, come alcune specie appartenenti al phylum Basidiomycota, non sono identificabili nella cultura vitale e sono difficili da differenziare microscopicamente. Questi funghi sono stati osservati in alta abbondanza relativa all'interno degli ambienti indoor e sul lavoro, valutata dal sequenziamento fungine ITS regioni3,4,10. IL sequenziamento ha fornito una maggiore conoscenza della varietà di funghi all'interno di ambienti interni ed occupazionali rilevata.
Il protocollo descritto qui dettagli i metodi utilizzati per raccogliere, estrarre e amplificare fungine ITS regioni da bioaerosols per l'analisi di sequenza. Questo approccio utilizza il National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) campionatore di aerosol di ciclone bistadio raccogliere le particelle nell'aria. Questo sampler è stato sviluppato per raccogliere bioaerosols e separato respirabile (≤ 4 µm di diametro aerodinamico) e non respirabile (> 4 µm di diametro aerodinamico) particelle, che consente per l'identificazione di organismi fungosi all'interno di ambienti che sono i più probabilità di essere inalato da un lavoratore11. Altri campionatori di aria, tra cui i campionatori di ciclone, sono disponibili sul mercato che hanno la capacità di raccogliere le particelle all'interno della gamma respirabile (< 4 µm) usando filtri12,13. Al contrario, il campionatore di aerosol NIOSH bistadio ciclone separa specie fungine basato sul loro diametro aerodinamico nelle provette monouso, in polipropilene che possono essere elaborati immediatamente per applicazioni a valle14.
I processi di estrazione del DNA genomico e amplificando le regioni ITS fungine sono dettagliati nel presente protocollo. Le metodologie di estrazione presentate sono state sviluppate specificamente per l'estrazione del DNA genomico da funghi e batteri, come molti kit commerciali di destinazione in particolare lieviti15, batteri o cellule di mammifero. I primers utilizzati in questo studio sono selezionati basati sulla loro copertura complessiva del 1 ITS fungine e ITS 2 regioni4,5. Sequenziamento di queste regioni consente il confronto di molte sequenze ITS sopraelevate, compresi quelli quella sequenza della regione 1 ITS, ITS 2 regione o regioni ITS 2 sia il suo 1. La diversità fungosa di campioni di aria raccolti in un'impostazione interna utilizzando che questi metodi sono illustrati, rivelando un sostanza numero di sequenze inseriti nei phyla Ascomycota e Basidiomycota, nonché altre sequenze appartenendo a phyla fungoso meno dominante, come Zygomycota. La grande diversità delle sequenze fungine identificati utilizzando questo approccio sarebbe non essere catturata utilizzando metodologie di identificazione di rischio tradizionali come coltivazione o microscopia. Sequenziamento delle regioni ITS fungine fornisce un metodo avanzato per identificare i pericoli fungini e consentire una migliore comprensione delle esposizioni fungine indoor e sul lavoro.