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Articolo metodologico

Un metodo efficiente In Vitro trasposizione da un sistema di bellezza dormire trascrizionalmente regolata confezionato in un vettore lentivirale difettoso di integrazione

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DOI:

10.3791/56742

⸱

12 gennaio 2018

 ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per realizzare l'integrazione stabile di un gene di interesse nel genoma umano di sistema Sleeping Beauty trascrizionalmente regolato. Preparazione dell'integrazione dei vettori lentivirali difettosi, la trasduzione in vitro di cellule umane e l'analisi molecolare sulle cellule trasdotte sono segnalati.

Abstract

Il trasposone Sleeping Beauty (SB) è un sistema di integrazione non virali con provata efficacia per il trasferimento genico e genomica funzionale. Per ottimizzare il macchinario del trasposone SB, un transposase iperattivo trascrizionalmente regolata (SB100X) e basati su T2 trasposone sono impiegati. In genere, la transposase ed i trasposoni sono forniti transitoriamente mediante trasfezione di plasmide e SB100X espressione è guidato da un promotore costitutivo. Qui, descriviamo un metodo efficiente per fornire i componenti di SB a cellule umane che sono resistenti a diversi metodi di transfezione fisiche e chimiche, per controllare l'espressione di SB100X e integrare stabilmente un gene di interesse (GOI) attraverso un SB "taglia e incolla" meccanismo. L'espressione della transposase iperattivo è strettamente controllato dal sistema Tet-ON, ampiamente utilizzato per controllare l'espressione genica dal 1992. Il gene di interesse è affiancato da ripetizioni invertiti (IR) del trasposone T2. Entrambi i componenti SB sono confezionati in integrazione difettosi vettori lentivirali transitoriamente prodotta nelle cellule HEK293T. Le cellule umane, sia linee cellulari o cellule primarie da tessuti umani, sono in vitro transitoriamente trasformata con i vettori virali. Con l'aggiunta di doxiciclina (dox, tetraciclina analogica) nel terreno di coltura, una messa a punto di transposase espressione viene misurata e si traduce in un'integrazione di lunga durata del gene di interesse nel genoma delle cellule trattate. Questo metodo è efficace e applicabile alla linea cellulare (per esempio, celle HeLa) e celle primarie (ad es., keratinocytes umani primari) e rappresenta quindi uno strumento prezioso per ingegneria genetica e trasferimento di geni terapeutici.

Introduzione

La transposase SB100X iperattivo accoppiato per il trasposone basati su T2 è già stato utilizzato nel gene preclinici terapia applicazioni1,2,3, genoma modifiche4,5, e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) riprogrammazione6,7. In genere, i componenti di SB transitoriamente sono forniti dalla transfezione del plasmide e un forte promotore costitutivo unità l'espressione della transposase. Tuttavia, nonostante i miglioramento nuovi metodi di transfezione, consegna del sistema bi-componente rimane una sfida per molte applicazioni. Così, lo sviluppo di un nuovo protocollo di recapito ha interesse aumentante. Oltre a metodi di transfezione per plasmide8 e mRNA9, consegna virale basato su adenoviral10,11, adeno-associato virale (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 e vettori lentivirali15 è stato proposto in passato. In particolare, il sistema di scelta deve garantire una consegna transitoria dei componenti SB senza integrazione del vettore virale. Tuttavia, l'espressione costitutiva di transposase solleva preoccupazioni di sicurezza a causa del rischio di rehopping incontrollabile del trasposone.

Pertanto, la regolazione trascrizionale di SB100X da un raffinato sistema di Tet-ON è la prima sfida. Un promotore di Tet-sensible a reagire modificato, ottenuto sostituendo il promotore originale sviluppato minimale del citomegalovirus (CMV) con il promotore minimo (-81) del gene timidina chinasi (TK) dell'Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)16, viene duplicato a Monte della SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Il mutato inverso-tetraciclina-transactivator rtTA2s-M217 è espresso sotto il controllo del promotore costitutivo forte (fosfoglicerato promotore, PGK) clonato in un plasmide differente (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Quando aggiunto al terreno di coltura, dox associa il rtTA2s-modulatore M2 e attacchi il promotore di Tet complesso o, con conseguente induzione strettamente regolato di SB100X espressione18.

La seconda grande sfida deriva dalla inefficiente transfezione di cellule primarie umane da diversi metodi fisici e chimici. Per distribuire in modo efficiente transposase in cellule umane resistenti di transfezione, il SB100X e il rtTA2s-cassette espressione M2 sono confezionati in due integrazione vettori lentivirali difettoso (IDLVs)19: IDLVTKSB e IDLVrtTA2s- M2. Vettori virali transitoriamente sono prodotte come vettori di generazione terzi HEK293T cellule20 e pseudotipizzato con la glicoproteina G del Virus della stomatite vescicolare (VSV-G), che conferisce un ampio spettro di infezione. Particelle di vettore sono concentrate mediante ultracentrifugazione e titolate di Gag di HIV-1 p24 immunocapture. Per trasdurre linee cellulari e cellule primarie, vettore particelle complessate con polybrene e vengono incubate con cellule bersaglio in presenza o assenza di dox. Droga-dipendente l'attivazione dell'espressione di SB100X in cellule trasdotte è misurata dal quantitativo di RT-PCR (qRT-PCR)18.

Una volta è dimostrato Tet-regolata SB100X espressione, recepimento del GOI (ad es., proteina fluorescente verde, GFP) nel genoma della cellula bersaglio segue gli eventi molecolari chiaramente schematizzati di Bak e Mikkelsen21. Un terzo IDLV di vettore che trasportano una cassetta di espressione per il GOI clonato tra l'IRs T2-trasposoni (IDLVT2) deve essere costruito e confezionato come accennato in precedenza. Infine, i tre vettori IDLV possono essere utilizzati in modo efficiente trasdurre cellule umane (ad es., keratinocytes primari) in vitro e integrare il GOI in presenza di doxiciclina18.

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Protocollo

1. plasmidi impiegati

Nota: Plasmide pCCL-PGKrtTA2S-M2 è stato gentilmente fornito dalla Prof. ssa Zappavigna (Università di Modena e Reggio Emilia, Modena, Italia). Il plasmide pCMVSB100X portando la sequenza codificante di transposase iperattivo e pT2/BH trasposone plasmide sono state gentilmente concesse dal Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Institute, Langen, Germania) e Prof. ssa Z. Izvak (centro di Max Delbrück per la medicina molecolare, Berlino, Germania).

  1. Per tutta la clonazione in Escherichia Coli (Escherichia coli), seguire la strategia di clonazione della procedura scelta e degli enzimi di limitazione o amplificazione di PCR del frammento da clonare.
    Nota: La tabella 1 riassume tutti i plasmidi impiegati in questo protocollo. Una descrizione e riferimenti per ogni plasmide sono forniti.

2. produzione di vettore virale

Nota: Tutti i vettori virali sono prodotte in una cappa biohazard a livello di contenimento di biosicurezza BSL2 secondo regole istituzionali e regolamentari.

  1. Le cellule aderenti HEK293T cultura in Medium di Eagle per volta di Dulbecco completati con 10% di siero di HyClone, 100 U/mL penicillina-streptomicina e glutamina 2mm.
  2. Giorno 0: Preparare cinque piastre/virale preparazione 15cm e seme 5.5x106 cellule in 30 mL di terreno.
  3. Giorno 1: transfezione
    1. Prima di iniziare la transfezione, preparare 100 mL di 2 x HEPES tampone salino (HBS):
      NaCl (5 M) 5,6 mL
      HEPES (1 M) 10,0 mL
      Na2HPO4 (0,5 M) 0,3 mL
      Sterile 84,1 mL di acqua
      Regolare il pH 7.1 con 37% HCl.
      Nota: 2 x HBS può essere conservata a 4 ° C. Un pH esatto è estremamente importante per la transfezione efficiente. La gamma di pH ottimale è 7.10 a 7.12.
    2. Rimuovere il mezzo e aggiungere 22,5 mL/piastra di fresco medio 4 h prima di transfezione.
    3. Transfect HEK293T cellule con il plasmide di trasferimento, il plasmide di imballaggio pMD.Lg/pRRE.D64VInt, il plasmide che codifica busta di pMD2.G e l'OSPRO-Rev (tabella 1) secondo la seguente quantità/targhetta:
      trasferimento del plasmide 25,00 µ g
      µ g pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16,25
      µ g pMD2.G 8.75
      OSPRO-Rev 6.25 µ g
      Nota: Il plasmide DNAs sono preparati secondo il protocollo di CsCl descritto da Maniatis22 o utilizzando un kit di purificazione del plasmide privo di endotossina.
      1. Risospendere 56,25 µ g di DNA (mix di 4 plasmidi) in 1,125 mL di acqua sterile e aggiungere 125 µ l di 2,5 M CaCl2 (soluzione A).
      2. Aggiungere mL 1,250 di 2 x HBS in una provetta conica sterile 15 mL (soluzione B).
      3. Aggiungere la soluzione A (1,250 mL) a B (1,250 mL) goccia a goccia mentre bolle con una pipetta di 1 o 2 mL (soluzione di transfezione, volume totale 2.500 mL).
      4. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (TA).
      5. Utilizzando una micropipetta P1000, distribuire tutta la soluzione di transfezione (2.500 mL) per il monostrato cellulare goccia a goccia.
    4. Incubare per una notte in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C, 5% CO2.
  4. Giorno 2: Rimuovere il mezzo e aggiungere 15 mL di terreno nuovo (Vedi punto 2.1).
  5. Giorno 3: Raccogliere e concentrare il supernatante contenente delle particelle lentivirale.
    1. Raccogliere il surnatante (~ 70 mL) da tutti i (n = 5) placche delle celle transfected, filtrare attraverso un 0,45 µm PESS filtrare e riempire i 2 tubi di polyallomer (1-inch x 3,5 pollici) / virale preparazione.
    2. Concentrare le particelle vettoriale mediante ultracentrifugazione a 106.000 x g per 2,5 h, a 15 ° C con freno.
    3. Immediatamente dopo l'arresto l'ultracentrifugazione (per evitare la risospensione del pellet nel tubo), delicatamente versare il surnatante in un contenitore contenente candeggina al 10% e sospendere i 2 pellet appena visibili in 100 µ l di PBS 1X (+ 1% BSA). Questo è normale in quanto il pellet è chiaro e molto piccola. Utilizzare il vettore concentrato preparato al momento, o aliquota e conservare preparati virali a-80 ° C.
      Attenzione: Il surnatante contiene particelle lentivirali che devono essere candeggiate accuratamente prima di gettare i rifiuti a rischio biologico.
  6. Per titolo la preparazione di vettori virali, utilizzare un kit di immunocapture di Gag di HIV-1 p24 secondo il protocollo del produttore.
    Nota: Per standardizzare la produzione di vettori virali, reagenti a base di liposomi potrebbero essere impiegati. Tuttavia, il titolo di vettore virale è altamente dipendente sull'efficienza di trasfezione e purezza del plasmide del DNA.

3. trasduzione di linee cellulari umane (per esempio, celle HeLa)

Nota: Le cellule HeLa sono coltivate in medium dell'Aquila di Dulbecco modificato supplementato con 10% di siero fetale di vitello, 100 U/mL penicillina-streptomicina e 2 mM glutammina. La tabella 1 riassume tutti i vettori impiegati in questo protocollo. Viene fornita una descrizione per ogni vettore. Trasduzione delle cellule HeLa consente la verifica della regolazione trascrizionale della SB transposase alla migliore combinazione di dose dei due vettori IDLV. Variazione di IDLV dosi potrebbe essere correlato a vector titolazione della particella e tipo di cella di destinazione.

  1. Giorno 0: 2 x 105 celle in 3 mL di terreno per ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti del seme. Preparare 4 pozzi.
  2. Giorno 1: Trasduzione delle cellule HeLa.
    1. Per ogni condizione, diluire vettori lentivirali ad un volume finale di 1 mL di terreno (Vedi nota sopra) in presenza di 10 μL di polybrene (concentrazione finale 8 μg/mL):
      Diluizione per bene #1: mock cellule trasdotte (controllo negativo).
      Diluizione per bene #2: vettore IDLVTKSB (2.600 ng di p24).
      Diluizione per pozzi #3, #4: vettore IDLVTKSB (2.600 ng di p24) + IDLVrtTA2s-M2 vettoriale (9.600 ng di p24).
    2. Rimuovere il mezzo da ogni pozzetto dove le cellule HeLa sono state placcate al giorno 0 e aggiungere diluizioni vettore lentivirale corrispondente bene.
    3. Spinoculate la piastra 6 pozzetti a 754 x g per 45 min a 20-25 ° C e quindi trasferimento la piastra a 6 pozzetti in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO2.
    4. Dopo 6 h, sostituire i vettori contenenti medi con medium fresco in tutti i pozzetti e aggiungere doxiciclina a 1 μm a ben #4. Mettere la piastra in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C per 48 h.
  3. Giorno 3: Preparazione dei pellet cellulare per estrazione del RNA.
    1. Prima di staccare le cellule, preparare una soluzione di lavoro di tripsina (1x):
      2,5% tripsina (10x) 5,0 mL
      500 mM EDTA (concentrazione finale = 5 mM) 0,5 mL
      1 x mL di PBS 44.5
    2. Soluzione di lavoro di tripsina calda a 37 ° C prima dell'uso. Conservare la soluzione di lavoro di tripsina a 4 ° C.
    3. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con PBS 1X. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di lavoro di tripsina pre-riscaldato 37 ° C in ogni pozzetto e incubare a 37 ° C per 7 min (in un'incubatrice di coltura cellulare).
    4. Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5 mL di siero contenente medio ad ogni pozzetto per inattivare la tripsina e raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga. Risciacquare bene una volta con 3 mL di PBS 1X e centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 240 x g.
    5. Lavare le cellule con 5 mL di 1X PBS, centrifugare per 5 min 240 x g ed eliminare il surnatante. Utilizzare pellet cellulare appena raccolti o conservare a-80 ° C. Estrarre RNA totale da pellet per eseguire RT-PCR semiquantitativa (Vedi punto 6).

4. trasduzione di cellule primarie umane (ad es., cheratinociti)

Nota: Keratinocytes umani primari sono seminate su irradiati letalmente 3T3-J2 celle (strato dell'alimentatore)23, un regalo gentile da Yan Barrandon (EPFL, Losanna, Svizzera).

  1. Crescere le cellule 3T3-J2 di Swiss mouse in per volta Eagle supplementato di Dulbecco con 10% siero bovino di donatore, 50 U/mL penicillina-streptomicina e 4 mM glutamina (3T3 medio).
  2. Crescere cheratinociti piastrate su cellule 3T3-J2 letalmente irradiato in cFAD medium, Medium di Eagle per volta di un Dulbecco e miscela di media F12 di Ham (3:1) contenente siero bovino fetale (10%), penicillina-streptomicina (1%), glutammina (2%), insulina (5 µ g/mL), adenina ( 0.18 mM), idrocortisone (0,4 µ g/mL), la tossina del colera (0.1 nM) e la triiodotironina (2 nM).
  3. Giorno 0: Seme 3 x 105 irradiati letalmente cellule 3T3-J2, precedentemente diluite in mezzo ad una concentrazione finale di 1 X 105 cellule/mL, in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti di 3T3. Preparare 9 pozzi.
  4. Giorno 1: Trasduzione dei keratinocytes primari
    Nota: Trasduzione dei cheratinociti permette la quantificazione della regolazione trascrizionale della SB transposase nella migliore combinazione di dose dei due vettori IDLV (mediante qRT-PCR) e di verificare l'integrazione del GOI (GFP) nelle cellule bersaglio (mediante citofluorimetria analisi).
    1. Prima di staccare le cellule, preparare la soluzione di lavoro di tripsina:
      0,5% tripsina-EDTA (10x) 5,0 mL
      500mM EDTA (concentrazione finale = 5 mM) 0,5 mL
      1 x mL di PBS 44.5
    2. Soluzione di lavoro di tripsina calda a 37 ° C prima dell'uso. Conservare la soluzione di lavoro di tripsina a 4 ° C.
    3. Per staccare subconfluent cheratinociti in cultura, rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS 1X e aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro pre-riscaldato tripsina in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C per 15 min nell'incubatrice di coltura cellulare.
    4. Dopo l'incubazione, risospendere le cellule di un pozzo accuratamente e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga contenente 2 mL di siero contenente medio (se molte cellule sono ancora collegate, incubare per un ulteriore min a 37 ° C). Sciacquare bene una volta con 3 mL di 1X PBS o mezzo fresco e aggiungere la soluzione di risciacquo la provetta da centrifuga con la sospensione cellulare.
    5. Centrifugare per 5 min a 580 x g e scartare il surnatante.
    6. Lavare le cellule con 5 mL di 1X PBS, centrifugare per 5 min 580 x g e scartare il surnatante.
    7. In una provetta di polipropilene 15 mL, diluire 1.6x105 cheratinociti in 1 mL di terreno cFAD, una diluizione per ogni condizione.
    8. Diluire il vettori lentivirali in 1 mL di terreno cFAD in presenza di 20 μL di polybrene (concentrazione finale di 8 µ g/mL a un volume finale di 2 mL):
      Diluizioni per pozzi #1, #2, #3: mock cellule trasdotte (controllo negativo senza vettori).
      Diluizioni per pozzi #4, #5: vettore IDLVTKSB (13.000 ng di p24) + IDLVrtTA2s-M2 vettoriale (48.000 ng di p24).
      Diluizioni per pozzi #6, #7, #8, #9: vettore IDLVTKSB (13.000 ng di p24) + IDLVrtTA2s-M2 vettoriale (48.000 ng di p24) + IDLVT2 vettore (9.160 ng di p24).
    9. Trasducono cellule in sospensione con l'aggiunta di ogni diluizione di vettore lentivirale (1 mL) per la sospensione del keratinocyte corrispondente (1.6x105 cheratinociti in 1 mL).
    10. Rimuovere il mezzo da cellule 3T3-J2 irradiati letalmente seminate al giorno 0 e piastra trasformata cheratinociti (1.6x105 cheratinociti in 2 mL) su di loro. Dopo trasducendo un pozzo procedere con quella successiva.
    11. Incubare a 25 ° C per 30 minuti e quindi trasferire le cellule a 37 ° C nell'incubatrice di coltura cellulare per 6 h.
      Nota: Non non spinoculate keratinocytes primari, come vitalità e proliferazione ne risentiranno fortemente.
    12. Dopo 6 h, aggiungere 1 mL di medium cFAD in ciascun pozzetto. Aggiungere 1 doxiciclina μM (concentrazione finale) a wells #5, #8 e #9. Restituire le cellule a 37 ° C.
  5. Giorno 2: Sostituire cFAD medio con 3 mL di terreno KC con 10 ng/mL EGF.
  6. Giorno 3: Tripsinizzano e lavare le cellule da pozzi #1, #4 e #5 come descritto prima (Vedi 4.4.1 a 4.4.6). Congelare palline delle cellule a-80 ° C per estrarre RNA totale per analisi qRT-PCR (vedi step 7).
  7. Tripsinizzano cellule da ben #2, #6 e #8 come descritto ai punti 4.4.1-4.4.5 ed eseguire analisi citofluorimetrica per espressione di GFP (vedi passo 5).
  8. Mantenere la cultura da pozzi #3, #7 e #9 per almeno 3-4 accoppiamenti, sufficiente a diluire non-integrato IDLVT2 vettoriale (5 giorni per keratinocytes umani primari, placcato su strato dell'alimentatore).
  9. Giorno 6: Circa 5 giorni post trasduzione, tripsinizzano cellule (Vedi punti 4.4.1-4.4.5) da pozzi #3, #7 e #9 per eseguire analisi citofluorimetrica per espressione di GFP (vedi passo 5).
    Nota: L'efficienza di temporizzazione e trasduzione di esperimento sono fortemente influenzati dal tipo di cellula primaria e dalla variabilità dei campioni raccolti.

5. citofluorimetrica analisi su trasdotte keratinocytes primari

Nota: Un citometro a flusso configurato con un laser blu (488 nm), un laser rosso (633 nm) e filtri per rilevamento della fluorescenza GFP e APC è impiegato (Vedi Materiali tavolo).

  1. Per distinguere i cheratinociti da strato dell'alimentatore 3T3-J2, etichetta trasformata keratinocytes distaccato al giorno 3 e 6 (vedere i passaggi 4.7 e 4,9) con mouse monoclonale APC-anticorpo coniugato anti-alimentatore.
    1. Preparare 4 mL di buffer per ogni campione di colorazione:
      5% FBS 200 ΜL
      500 mM EDTA (concentrazione finale = 2,5 mM) 20 μL
      ΜL di PBS 1 x 3780
    2. Lavare le cellule indipendente con 1 mL di tampone di colorazione. Centrifugare per 5 min a 580 x g e scartare il surnatante.
    3. In un tubo per l'acquisizione di citometria a flusso, risospendere le 5 x 104 cellule in 100 μL di tampone di colorazione e aggiungere 2 µ l di anticorpo anti-alimentatore (01:50). Mescolare bene e incubare per 30 min in ghiaccio al buio.
    4. Dopo 30 min, lavare con 2 mL di tampone di colorazione. Centrifugare per 5 min a 580 x g e scartare il surnatante. Risospendere in 200 μL di tampone di colorazione.
    5. Acquisire segnali APC e GFP di analisi citofluorimetrica18. La frazione di cellule GFP+ della popolazione delle cellule APC– indica keratinocytes trasdotte.
      Nota: Se si desidera correggere l'esempio macchiato prima di citometria a flusso con paraformaldeide al 2% in PBS 1 x e conservare a 4 ° C al buio fino alla esecuzione.
  2. Analizzare i dati di flusso cytometry tracciando il rapporto tra la percentuale di GFP+cellule presso l'endpoint (5 giorni) e la percentuale di GFP+cellule 2 giorni dopo la trasduzione, normalizzati a livello residuo di IDLVT2-trasdotte cellule.

6. semi-quantitativa di RT-PCR

Nota: Utilizzare un termociclatore PCR.

  1. Estratto totale RNA da trasdotte o controllare le cellule utilizzando un kit di purificazione di RNA, secondo il protocollo del produttore.
    Nota: il RNA totale possa essere conservato a-80 ° C.
  2. Sintetizzare cDNA in una reazione di 20 µ l usando 100 ng di RNA totale e un kit di trascrittasi inversa, secondo il protocollo del produttore.
    Nota: cDNA possa essere conservato a-20 ° C.
  3. Disegno di primer specifici per SB100X, rtTA2s-M2 e GAPDH (un gene housekeeping).
    Disegni suggeriti:
    SB forward primer: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
    SB reverse primer: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
    rtTAM2 forward primer: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
    rtTAM2 reverse primer: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
    GAPDH forward primer: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
    GAPDH reverse primer: 5'–CCACCACCCTGTTGCTGTAG–3'
  4. Eseguire PCR in un volume di reazione finale di 50 µ l. In particolare, assemblare in ciascuna provetta PCR la seguente reazione:
    cDNA (diluizione 1:5) (dal punto 6.2) 1.00 µ l
    Forward primer (stock 10 µM) 1.00 µ l
    Reverse primer (stock 10 µM) 1.00 µ l
    dNTP (stock 10 µM) 1.00 µ l
    Buffer (+ MgCl2) (10x stock) 5.00 µ l
    Taq polimerasi (stock 5 U / µ l) 0,25 µ l
    µ L di acqua sterile 40,75
  5. Utilizzare il seguente programma del termociclatore: 1 ciclo a 95 ° C per 5 minuti quindi procedere con 95 ° C per 30 s, 58 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s per 34 cicli per SB100X, 32 cicli per rtTA2s-M2 e 25 cicli per GAPDH.
  6. Preparare il gel di agarosio 1%. Sciogliere 1 g di agarosio in 100 mL di TBE 1 x (10 x stock diluito in acqua sterile), in un becher o boccetta. Si scioglie in un forno a microonde, agitando ogni minuto fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Raffreddare l'agarosio fuso fino a raggiungere circa 50 ° C e quindi aggiungere 5 µ l di bromuro di etidio (10 mg/mL di brodo). Versare agarosio fuso in un cassetto del gel assemblato con un pettine, per la colata di gel.
  7. Caricare i campioni (10 µ l) su gel di agarosio ed eseguire l'elettroforesi.
  8. Se si desidera acquisire gel foto ed eseguire analisi densitometrica sulle bande PCR.

7. quantitative RT-PCR (qRT-PCR)

Nota: È impiegato un sistema di rilevazione sequenza commerciale. 6-carboxyfluorescein (FAM) sonda per la gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) e gli iniettori di PCR sono acquistati commercialmente.

  1. Per la retro-trascrizione, vedere il punto 6.2.
  2. Utilizzare software per disegnare primers e sonde specifiche per SB100X.
    Design suggeriti:
    SB.2 forward primer: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
    SB.2 reverse primer: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
    sonda FAM SB: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
  3. Eseguire Real-Time PCR in piastre da 96 pozzetti con un PCR Master Mix e mix di primer + sonda, in un volume di reazione finale di 25 µ l. In particolare, si consideri la seguente reazione per ciascun pozzetto:
    cDNA (01:10 diluizione in acqua sterile) 1.00 µ l
    2 x µ l di Master Mix 12.50
    Mix di primer + sonda 20 x 1.25 µ l
    µ L di acqua sterile 10.25
    Nota: Eseguire tutte le reazioni in triplice copia. Per evitare errori di pipettaggio, preparare una miscela per almeno n + 3 reazioni (senza cDNA). Aliquota usando una pipetta multicanale.
  4. Eseguire PCR in tempo reale utilizzando il seguente programma: 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, poi 40 cicli di 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 1 min e permanenza a 4 ° C.
  5. Analizzare i dati qRT-PCR normalizzando l'espressione relativa (valore RQ) di SB100X al livello di GAPDH dello stesso campione di cDNA mediante 2–ΔΔCT quantificazione, utilizzando software di analisi dati tipici.

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Risultati

Utilizzando la procedura presentata qui, tre vettori IDLV che trasportano i componenti SB regolamentati (SB100X, rtTA2S-trasposone M2 e T2-GFP) erano confezionati e utilizzato per distribuire in modo efficiente e strettamente regolare il sistema di SB in cellule umane. Figura 1A Mostra un schema per in vitro trasduzione delle cellule HeLa, che è stata eseguita per valutare la regolazione trascrizionale di SB transposase con la migliore com...

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Discussione

Qui, descriviamo una metodologia ampiamente accessibile per integrare stabilmente un GOI nel genoma delle cellule bersaglio di Sleeping Beauty-mediata di recepimento. Anche se il sistema di SB è stato sviluppato per fornire un metodo nonviral per l'editing genomico, consegna efficiente dei macchinari integrazione (permettono e T2 trasposone) è obbligatoria. Quindi, per utilizzare il sistema di SB su quasi transfectable cellule primarie, una consegna virale dei componenti SB è stata perseguita in questi anni

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Si ringrazia la Prof. ssa Zappavigna, Università di Modena e Reggio Emilia, Modena, Italia per averci fornito il pCCL-PGKrtTA2S-plasmide M2. Riconosciamo anche Prof Z. Ivics (Istituto Ehlrich Paolo, Langen, Germania) e Prof. ssa Z. Izvak (Centro Max Delbrück per la medicina molecolare, Berlino, Germania) per pCMVSB100X e pT2/BH plasmidi. Questo lavoro è stato supportato da DEBRA internazionale e Ministero dell'Università e della ricerca.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dulbecco' s Eagle modificato' s terreno con 4,5 g/L di glucosio senza L-glutamminaLonzaBE12-614FTerreno di coltura cellulare.
Siero fetale bovino HyClone (USA), caratterizzatoGE Healthcare Life SciencesSH30071.03Siero utilizzato HEK293T coltura cellulare per la produzione di particelle lentivirali.
Penicillina 10.000 UI/ml Streptomicina 10.000 UI/mlLonzaDE17-602EReagenti per terreno di coltura cellulare.
L-Glutammina 200mMLonzaBE17-605EReagente per terreno di coltura cellulare.
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma-AldrichS7653Reagente per la preparazione di HBS 2X.
Tampone HEPES, 1M Stock in soluzione fisiologica normaleLonzaBE17-737EReagente per preparazione HBS 2X.
Idrogeno fosfato disodico diidrato (Na2HPO4· 2H2O), 99,5%Merck106580per preparazione HBS 2X.
Acido cloridrico - Reagente ACS 37% (HCl)Sigma-Aldrich320331Reagente per la preparazione di HBS 2X.
Acqua sterile per preparazioni iniettabiliFreseniusKabi-Reagenteper la preparazione di HBS 2X.
0,45 & micro; m Filtro PESSWhatman10462100Filtri utilizzati per rimuovere i detriti cellulari dal surnatante virale.
Provette in poliallomero BeckmanCoulter326823Provette per la concentrazione di vettori IDLV mediante ultracentrifugazione.
PBS-1X senza Ca, MgLonzaBE17-516FTampone per lavaggio cellulare e risospensione di particelle lentivirali.
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA2153(opzionale) Tampone per la risospensione di particelle lentivirali.
Kit di immunocattura HIV-1 Gag p24Kit Perkin ElmerNEK50001KTper la titolazione di particelle IDLV.
PolybreneSigma-Aldrich107689Reagente per migliorare l'efficienza di trasduzione.
Tripsina (10X) 2,5% in HBSS senza Ca, MgGIBCOBE17-160EReagente per il distacco delle cellule HeLa (soluzione madre, da diluire).
Sale disodico dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)100938BAnalaR BDHReagente per la preparazione della soluzione di lavoro della tripsina.
0,5% Tripsina-EDTA, senza rosso fenolo (10X)GIBCO15400-054Reagente per il distacco dei cheratinociti (soluzione madre, da diluire).
Donatore di siero bovino, origine neozelandeseGIBCO16030-074Siero per coltura cellulare 3T3-J2 di topo svizzero (strato di alimentazione).
Prosciutto s F12 mediaGIBCO21765Terreno per cheratinociti.
Siero fetale bovinoLonzaDE14-801FSiero per terreno di coltura cellulare HeLa.
Siero fetale bovino, qualificato, Australia OrigineGIBCO10099-141Siero per terreno di coltura di cheratinociti primari umani.
Insulina dal pancreas bovinoSigma-AldrichI5500Reagenti per la crescita dei cheratinociti.
AdeninaVWR1152-25Reagenti per la crescita dei cheratinociti.
IdrocortisoneVWR3867-1Reagenti per la crescita dei cheratinociti.
Tossina del colera da Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052Reagenti per la crescita dei cheratinociti.
TriiodotironinaSigma-AldrichT5516Reagenti per la crescita dei cheratinociti.
australiEGF umani GF-010-9per la crescita dei cheratinociti.
Anticorpo anti-feeder coniugato APC monoclonale di topoMiltenyi Biotech130-096-099Per etichettare lo strato di alimentazione.
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134Kit di purificazione dell'RNA.
SuperScript III Reverse TranscriptaseLife Technologies18080051Kit per la trascrittasi inversa.
Miscela di deossinucleotidi, 10 mM (dNTP)Reagente Sigma-AldrichD7295per PCR semiquantitativa.
UltraPure senza DNasi/RNasi Acqua Distillata(qualsiasi)per PCR semiquantitativa e per qRT-PCR.
GoTaq G2 Inizio a caldo polimerasiPromegaM740BTaq polimerasi.
Agarosio, per biologia molecolareSigma-AldrichA9539Reagente per elettroforesi su gel di agarosio.
UltraPure TBE Buffer, 10XInvitrogen15581028Reagente per elettroforesi su gel di agarosio, da diluire (1X) in ddH2O.
Bromuro di etidioSigma-AldrichE1510Reagente per elettroforesi su gel di agarosio.
DoxiciclinaSigma-AldrichD-9891farmaco per indurre l'espressione della trasposasi nelle cellule HeLa e nei cheratinociti
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystem4304437TaqMan Universal PCR Master Mix inclusi primer e sonda.
centrifuga in polipropilene ad alta trasparenza da 15 ml, fondo conico, con tappo a vite con chiusura a cupola,Falcon Corning352096per la raccolta delle cellule e la preparazione della diluizione vettoriale.
Piatto per colture cellulari trattato TC da 150 mm con griglia da 20 mm,Falcon Corningsterile 353025Piatto per colture cellulari per la produzione virale.
Piastra per colture cellulari multipozzetto a fondo piatto a 6 pozzetti trasparente trattata con TC, con coperchio, confezionata singolarmente, sterileFalcon Corning353046Piastra per colture cellulari per HeLa e trasduzione di cheratinociti primari umani.
Provette per microcentrifuga Safe-Lock, volume 1,5 mLEppendorf0030 120.086Provette per la preparazione della diluizione.
Provette per microcentrifuga Safe-Lock, volume 2 mLEppendorf0030 120.094Provette per la preparazione della diluizione.
Provette per PCR da 0,2 ml con tappi piatti, provette prive di RNasi, DNasi, DNA e inibitori della PCR(qualsiasi)per PCR semiquantitativa.
Piastra di reazione ottica veloce a 96 pozzetti MicroAmp con codice a barre, 0,1 mLbiosistema applicato434690696 pozzetti per qRT-PCR.
polistirene a fondo tondo da 5 ml, senza tappoProvette 352052 BD Falconl'acquisizione dellacitometria a flusso.
Pipette sierologiche monouso, polistirene, confezionate singolarmente, sterili (diversi volumi)(qualsiasi)-Pipette per applicazioni di coltura tissutale sterile.
Puntali filtranti, sterili e privi di RNasi, DNasi, DNA e pirogeni (volumi diversi)(qualsiasi)-Puntali filtranti per colture di tessuti sterili e applicazioni di biologia molecolare.
Misuratore di pH(qualsiasi)-Apparecchiatura per la misurazione del pH HBS 2X.
PCR Termociclatore(qualsiasi)-Attrezzatura per PCR semiquantitativa.
Apparecchiature per elettroforesi su gel di agarosio(qualsiasi)-Apparecchiature per elettroforesi su gel di agarosio di PCR semiquantitativa.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2BD-Citometroflusso.
Sistema di PCR in tempo reale veloce 7900HTBiosystem applicato7900HTper qRT-PCR.
Centrifughe da banco per l'elaborazione efficiente dei campioni in applicazioni di coltura cellulare, refrigerate, con secchi per micropiastre.(qualsiasi)-Centrifuga per il trattamento di colture cellulari e la spinoculazione.
Ultracentrifuga Optima L-90K dotata di rotore SW32TIBeckman Coulter-Ultracentrifugeper la produzione di particelle lentivirali.
Attrezzature per colture cellulari e laboratori di biologia molecolare (ad esempio, cappa a flusso laminare di Classe II progettata per lavori con materiali BSL2, incubatori per colture cellulari, frigoriferi e congelatori (+4 ° C, -20 ° C, -80 ° C), micropipette e pipet-aid).
Camici protettivi da laboratorio, guanti, protezioni per il viso in conformità con le norme e i regolamenti dell'Istituto, in particolare per la produzione e la trasduzione di particelle lentivirali.
Reagente Reagenti biologici Reagente Provetta da provette sterili di Provetta in per a Apparecchiatura

Riferimenti

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