Articolo metodologico

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

DOI:

10.3791/56750

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6 gennaio 2018

 ,  ,  , 
1Maine Medical Center Research Institute

In questo articolo

Sommario

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In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

Abstract

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Cellule stromali del midollo osseo (BMSC) costituiscono una popolazione di cellule ordinariamente utilizzata come rappresentazione delle cellule staminali mesenchimali in vitro. Essi risiedono all'interno della cavità del midollo osseo al fianco di cellule staminali ematopoietiche (HSCs), che possono dare origine a globuli rossi, dei progenitori immuni e gli osteoclasti. Così, le estrazioni delle popolazioni delle cellule dai risultati del midollo osseo in un mix eterogeneo di varie popolazioni di cellule, che possono presentare sfide nel disegno sperimentale e confondere l'interpretazione dei dati. Diversi di isolamento e tecniche di coltura sono state sviluppate nei laboratori al fine di ottenere popolazioni più o meno omogenee di BMSC e HSCs invitro. Qui, presentiamo due metodi per l'isolamento di BMSC e HSCs da ossa lunghe del mouse: un metodo che produce una popolazione mista di BMSC e HSCs e un metodo che tenta di separare le due popolazioni di cellule basato su aderenza. Entrambi i metodi forniscono adatto per le cellule osteogeniche e adipogenico differenziazione esperimenti saggi anche come funzionali.

Introduzione

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BMSCs murino primario sono comunemente usati come modello in vitro di cellule staminali mesenchimali fin dalla loro scoperta nel primi anni 19801. Infatti, colture di cellule di plastica-aderente svuotate dalla cavità del midollo osseo delle ossa lunghe mantengono la capacità di differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti, condrociti o adipociti in molti studi2,3, 4 , 5. Tuttavia, il midollo osseo è un tessuto unico composto di molte popolazioni differenti delle cellule, tra cui, ma non limitato a, BMSC, HSCs,....

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Protocollo

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Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di utilizzo presso il Maine Medical Center Research Institute e istituzionali Animal Care.

1. la raccolta di tubi preparazione

  1. Rendere i terreni di coltura BMSC completando α Medium essenziale minimo (MEM α) con 10% siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina.
  2. Posto 100 µ l di terreno di coltura BMSC in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. 3 ossa solitamente si adattano in una singola provetta così prepararsi di conseguenza.
  3. Tagliare le estremità di 200 µ l puntali per abbastanza così che si inseriscono le provette da centrifuga. I....

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Risultati

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Panoramica delle colture cellulari
Le tecniche di due cultura permettono la valutazione di differenziazione su una popolazione mista di BMCs composto da BMSC e HSC (BMCs totale, Figura 1A) o di una popolazione di BMSCs diviso da HSC (BMSCs aderente, Figura 1B). 48 ore dopo che le cellule dal midollo sono isolate e placcato (Figura 1), essi rapidamente fissare alla parte inferiore .......

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Discussione

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In questo articolo, sono disponibili due metodi di coltura di BMSC con i loro vantaggi e limitazioni. Isolamento di cellule provenienti dal midollo osseo è un processo relativamente semplice. Tuttavia, ottenere una popolazione di cellule rappresentativa della cellule staminali mesenchimali o progenitori osteoclastic può essere difficile a causa di vario ambiente cellulare della cavità del midollo.

La totalità del contenuto del midollo osseo la coltura fornisce una rappresentazione stretta del .......

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Dichiarazioni

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Gli autori divulgare che non hanno nessuna finanziaria conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
200μ L puntali per pipetta Rainin17014401
Provette da centrifuga da 1,5 mLUSA Scientific1615-5500
Provetta conica da 15 mLVWR89039-668
Provetta conica da 50 mLVWR89039-660
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) Sigma-Aldrich21-040-CM
EtanoloFisher Science04-355-451
di dissezione
70 μ m filtriBD Falcon352350
0,25% tripsinaGibco25200
KimwipeVWR82003-820
Paraformaldeide (PFA)Microscopia elettronica Scienza15710
Kit fosfatasi alcalinaSigma-Aldrich86R
Nitrato d'argentoSigma-AldrichS6506
Olio di tiosolfato di sodioSigma-AldrichS7026
Rosso OSigma-AldrichO0625
IsopropanoloSigma-Aldrich190764
10% Formalina tamponata neutraSigma-AldrichF5554-4L
Filtro Whatman Grado 1Sigma-AldrichZ274852
Kit fosfatasi acida resistente ai tartratiSigma-Aldrich387A
Elettrone di glutaraldeide16220
MEM&alfa;Gibco12571
Siero fetale bovino VWR97068-085
Penicillina/StreptomicinaInvitrogen15140-122
β-glicerolo fosfatoSigma-AldrichG9891
Acido ascorbicoSigma-AldrichA4544
DMEM Alto glucosio Sigma-AldrichD5796
RosiglitazoneCayman Chemical717410
InsulinaSigma-AldrichI6634
IBMXSigma-AldrichI5879
DesametasoneSigma-AldrichD4902
RANKLPeprotech310-01
mCSFPeprotech315-02
Axio Observer microscopio inverterZeiss
Strumenti

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
  2. Chen, T. L.

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Tag

Isolamento cellulareColtura cellulareDifferenziamento ostegenicoDifferenziamento adipogenicoCellule staminali ematopoieticheFrazione vascolare stromaleDifferenziamento cellulareDifferenziamento degli osteoclasti

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