Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine

John M. Powers; Xiao Lan Chang; Zhen Song; Hiroyuki Nakai

doi:10.3791/56766

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Articolo metodologico

Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine

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DOI:

10.3791/56766

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12 giugno 2018

John M. Powers¹ , Xiao Lan Chang¹ , Zhen Song¹ , Hiroyuki Nakai¹^,²

¹Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, ²Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto dettagli un saggio di macchia semplice puntino per quantificazione dei titoli del virus adeno-associato (AAV) e la sua applicazione per studiare il ruolo dell'Assemblea-attivazione proteine (AAP), una nuova classe di proteine virali non strutturali, trovate tutte le AAV sierotipi, nel promuovere l'assemblaggio di capsidi derivato da sierotipi AAV cognati ed eterologi.

Abstract

Mentre virus adeno-associato (AAV) è ampiamente accettata come un vettore di attraente per la terapia genica, serve anche come un virus di modello per la comprensione della biologia del virus. Sotto questo aspetto, la recente scoperta di una proteina AAV non strutturali, chiamata proteina d'attivazione assembly (AAP), ha gettato nuova luce sui processi coinvolti nell'assemblaggio delle proteine del capside virale VP in un capside. Anche se molti sierotipi AAV richiedono AAP per assemblaggio, recentemente abbiamo riferito che AAV4, 5, e 11 sono eccezioni a questa regola. Inoltre, abbiamo dimostrato che AAPs e assemblati capsidi di diversi sierotipi di localizzano a diversi compartimenti subcellulari. Questa eterogeneità imprevista nella proprietà biologiche e ruoli funzionali di AAPs tra diversi AAV sierotipi sottolinea che l'importanza degli studi su AAPs derivata da diversi sierotipi. Un saggio di macchia semplice puntino per quantificazione AAV e la sua applicazione per valutare la specificità di dipendenza e sierotipo AAP nell'assembly del capsid i dettagli di questo manoscritto. Per dimostrare l'utilità di questo test di dot blot, abbiamo precisato per caratterizzare capside assembly e AAP dipendenza di serpente AAV, un rettile precedentemente atipico AAV, così come AAV5 e AAV9, che precedentemente sono stati indicati per essere indipendente dalla AAP e AAP-dipendente sierotipi, rispettivamente. L'analisi ha rivelato che il serpente AAV capside assembly richiede serpente AAP e non può essere promosso da AAPs da AAV5 e AAV9. L'analisi inoltre ha mostrato che, a differenza di molti il comune sierotipo AAPs che promuovere l'Assemblea del capside eterologo da cross-complementazione, serpente AAP non promuovere l'Assemblea di capsidi AAV9. Inoltre, ci mostra che la scelta di nucleasi influisce in modo significativo la lettura del test dot blot, e così, scegliendo un enzima ottimo è fondamentale per una valutazione positiva dei titoli di AAV.

Introduzione

Virus adeno-associato (AAV) è un virus a DNA piccolo, senza involucro, a singolo filamento con un genoma di circa 4,7 kilobasi (kb). Il genoma AAV contiene Apri-reading frame (ORF) per i geni rep e cap . Nel 2010, una precedentemente non identificata nonstructural proteina codificata da un ORF + 1 telaio-spostato all'interno del gene di tappo AAV2 fu scoperto da Sonntag et al e trovata a giocare un ruolo critico nell'assemblaggio di proteine monomeriche AAV2 del capside VP in un virale capside¹. Questa nuova proteina è stata nominata proteina d'attivazione assembly (AAP) dopo il suo ruolo nella promozione del....