Articolo metodologico

Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine

DOI:

10.3791/56766

⸱

12 giugno 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

In questo articolo

Sommario

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Questo manoscritto dettagli un saggio di macchia semplice puntino per quantificazione dei titoli del virus adeno-associato (AAV) e la sua applicazione per studiare il ruolo dell'Assemblea-attivazione proteine (AAP), una nuova classe di proteine virali non strutturali, trovate tutte le AAV sierotipi, nel promuovere l'assemblaggio di capsidi derivato da sierotipi AAV cognati ed eterologi.

Abstract

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Mentre virus adeno-associato (AAV) è ampiamente accettata come un vettore di attraente per la terapia genica, serve anche come un virus di modello per la comprensione della biologia del virus. Sotto questo aspetto, la recente scoperta di una proteina AAV non strutturali, chiamata proteina d'attivazione assembly (AAP), ha gettato nuova luce sui processi coinvolti nell'assemblaggio delle proteine del capside virale VP in un capside. Anche se molti sierotipi AAV richiedono AAP per assemblaggio, recentemente abbiamo riferito che AAV4, 5, e 11 sono eccezioni a questa regola. Inoltre, abbiamo dimostrato che AAPs e assemblati capsidi di diversi sierotipi di localizzano a diversi compartimenti subcellulari. Questa eterogeneità imprevista nella proprietà biologiche e ruoli funzionali di AAPs tra diversi AAV sierotipi sottolinea che l'importanza degli studi su AAPs derivata da diversi sierotipi. Un saggio di macchia semplice puntino per quantificazione AAV e la sua applicazione per valutare la specificità di dipendenza e sierotipo AAP nell'assembly del capsid i dettagli di questo manoscritto. Per dimostrare l'utilità di questo test di dot blot, abbiamo precisato per caratterizzare capside assembly e AAP dipendenza di serpente AAV, un rettile precedentemente atipico AAV, così come AAV5 e AAV9, che precedentemente sono stati indicati per essere indipendente dalla AAP e AAP-dipendente sierotipi, rispettivamente. L'analisi ha rivelato che il serpente AAV capside assembly richiede serpente AAP e non può essere promosso da AAPs da AAV5 e AAV9. L'analisi inoltre ha mostrato che, a differenza di molti il comune sierotipo AAPs che promuovere l'Assemblea del capside eterologo da cross-complementazione, serpente AAP non promuovere l'Assemblea di capsidi AAV9. Inoltre, ci mostra che la scelta di nucleasi influisce in modo significativo la lettura del test dot blot, e così, scegliendo un enzima ottimo è fondamentale per una valutazione positiva dei titoli di AAV.

Introduzione

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Virus adeno-associato (AAV) è un virus a DNA piccolo, senza involucro, a singolo filamento con un genoma di circa 4,7 kilobasi (kb). Il genoma AAV contiene Apri-reading frame (ORF) per i geni rep e cap . Nel 2010, una precedentemente non identificata nonstructural proteina codificata da un ORF + 1 telaio-spostato all'interno del gene di tappo AAV2 fu scoperto da Sonntag et al e trovata a giocare un ruolo critico nell'assemblaggio di proteine monomeriche AAV2 del capside VP in un virale capside1. Questa nuova proteina è stata nominata proteina d'attivazione assembly (AAP) dopo il suo ruolo nella promozione del capsid assemblaggio1.

ORFs per AAP sono stati identificati bioinformatically nel genoma dei tutti i parvovirus del genere Dependoparvovirus, ma non all'interno del genoma dei virus dei diversi generi del parvovirus famiglia1,2. Studi funzionali di questa proteina romanzo erano inizialmente concentrati sull'AAP dal prototipo AAV2 (AAP2), che ha istituito il ruolo essenziale della AAP2 nel targeting completamente smontate proteine VP per il nucleolo per il loro accumulo e la formazione in assemblati capsidi1,3,4. L'incapacità dei capsidi AAV2 di assemblare in assenza di espressione di AAP è stato indipendentemente confermato da più gruppi, compreso il nostro1,2,3,4,5 . Studi successivi su sierotipi AAV 1, 8 e 9 ha confermato il ruolo critico di AAPs nell'assembly del capsid, come proteine monomeriche VP3 di AAV1, 8, e 9 erano in grado di formare un capside completamente assemblato in assenza di co-espressione di AAP2.

Recentemente, attraverso approcci che includono l'uso di quantitativi dot blot analisi, abbiamo studiato la capacità di AAV1 di 12 VP3 monomeri per assemblare in capsidi in assenza di espressione di AAP e la capacità di AAP1 al 12 di promuovere l'Assemblea del VP3 monomeri da sierotipi eterologi. Questo studio ha rivelato che AAV4, 5 e 11 VP3 monomeri possono montare senza AAP. Inoltre, è stato trovato che otto dei dodici sierotipi AAP abbiamo esaminato (cioè, tutti, ma AAP4, 5, 11 e 12) visualizzata una vasta capacità di supportare Assembleia capside eterologhe capsidi di sierotipo AAV, mentre AAP4, 5, 11 e 12 visualizzato un sostanzialmente capacità limitata a questo proposito6. Questi quattro sierotipi sono filogeneticamente distanti dagli altri AAP sierotipi2,3. Inoltre, lo studio ha scoperto significativa eterogeneità nelle localizzazioni subcellulari di diversi AAPs6. Inoltre, lo studio ha suggerito che la stretta associazione di AAP con capsidi assemblati e il nucleolo, il segno distintivo dell'Assemblea di capside AAV2, necessariamente non può essere estesa ad altri sierotipi inclusi AAV5, 8 e 9, che visualizzano nucleolar esclusione di capsidi assemblato6. Così, le informazioni ottenute dallo studio di qualsiasi particolare sierotipo AAP non sono ampiamente applicabile a tutti i biologia AAP. Tale natura sconcertante della biologia AAP sottolinea la necessità di indagare il ruolo e la funzione di ogni AAP da sierotipi AAV sia canonici e non canoniche.

Il ruolo biologico di AAP nell'assembly capside può essere valutato determinando che i titoli di particella virale AAV completamente confezionato prodotta in cellule embrionali umane del rene (HEK) 293 cellule, la linea cellulare più comunemente utilizzati per la produzione di vettore AAV, con o senza proteine AAP espressione. I metodi standard per la quantificazione di AAV sono PCR quantitativa (qPCR)-base saggi7,8 e quantitativa dot blot-based assays9. Altri metodi per la quantificazione della particella virale AAV come analisi enzima-collegata dell'immunosorbente10,11 o densità ottica misura12 non sono ideali per campioni o campioni provenienti da molti diversi sierotipi di AAV contaminata da impurità (lisati grezza o terreni di coltura), che sono spesso i campioni utilizzati per la ricerca AAV. Attualmente, qPCR è più ampiamente usato per la quantificazione dell'AAV; Tuttavia, è necessario riconoscere potenziali avvertimenti del dosaggio qPCR-basato, come l'analisi possono provocare errori sistemici e significativo titolo variazioni13,14. Analisi PCR-based sono interessate da una serie di fattori, quali la presenza di forcine covalentemente chiusi terminale nei modelli di PCR che inibiscono amplificazione13potenzialmente di confusione. Anche un individuo esperto può introdurre potenziali fattori di confondimento in una base di qPCR inconsapevolmente dosaggio13. Al contrario, analisi di quantitativi dot blot sono una tecnica di biologia molecolare classica che non riguarda l'amplificazione del genoma e utilizza un principio molto semplice con un rischio minimo di errori rispetto alle analisi qPCR-based. Il metodo è meno tecnicamente impegnativi; di conseguenza, i risultati del saggio sono ragionevolmente riproducibili anche da individui inesperti.

In questo rapporto, descriviamo i dettagli metodologici di analisi quantitativa dot macchia usiamo ordinariamente per quantificazione di vettore AAV e fornire un esempio di come applicare il dosaggio per studiare il ruolo di promozione di assemblaggio di AAPs in comune con sierotipi (AAV5 e AAV9) e un' in precedenza atipici AAP dal serpente AAV14. In natura, AAV VP e proteine AAP sono espressi in cis da un singolo gene (cioè, VP-AAP cis-complementazione), mentre nel test qui descritto, proteine VP e AAP sono fornite in trans da due plasmidi separati (cioè, VP-AAP Trans-complementazione). Poiché ogni proteina VP o AAP da sierotipi diversi può essere espressa da ogni plasmide indipendente, diventa possibile testare eterologa VP-AAP combinazioni di assemblaggio del capside (cioè, VP-AAP cross-complementazione). Brevemente, AAV VP3 da vari sierotipi è espresso in cellule HEK 293 di transfezione del DNA del plasmide per assemblare un genoma di vettore AAV in presenza o assenza del sierotipo cognato AAP, o in presenza di un sierotipo eterologo AAP. A seguito di produzione, terreni di coltura e lisati cellulari sono sottoposti ad un'analisi della macchia di dot per quantificare il genoma virale all'interno della shell di capside. Il primo passo del dot blot test è quello di trattare i campioni con una nucleasi per rimuovere contaminanti plasmide DNAs e non imballati AAV genomi in campioni. In caso contrario aumenterebbe i segnali di sfondo in particolare quando non purificata i campioni sono analizzati. Ciò allora è seguita da un trattamento con proteasi per rompere capsidi virali e rilasciare nucleasi-resistente genomi virali in soluzioni campione. Genomi virali, prossimi sono denaturati, cancellati su una membrana e ibridati con una sonda di DNA specifico del genoma virale per quantificazione. Con il test di esempio segnalato qui, dimostriamo che serpente AAV VP3 richiede serpente AAP per l'assemblaggio del capside e che serpente AAP non promuovere l'Assemblea del AAV9 capsidi a differenza di molti di AAPs derivato da sierotipi di AAP-dipendente che possono anche promuovere l'Assemblea del capsidi sierotipo eterologa. Infine, segnaliamo un avvertimento importante per qPCR o quantificazione di dot blot-based AAV saggi che la scelta di nucleasi influenza in modo significativo i risultati del saggio.

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Protocollo

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Nota: Le ricette per le soluzioni e il buffer necessario per questo protocollo sono fornite nella tabella 1. Il protocollo descritto di seguito è per il saggio di macchia VP-AAP cross-complementazione puntino a studiare i ruoli delle proteine AAP nell'assemblaggio del capside. Il metodo per il dosaggio di macchia quantitativa puntino più generico per la titolazione di vettore AAV purificata è spiegato nella sezione Risultati rappresentante .

1. costruzione di VP3, AAP e Rep AAV2 esprimendo plasmidi

  1. Costruzione di pCMV-AAVx-VP3 (x = sierotipi)
    1. PCR-amplificare l'intero ORF VP3 (1,6 kb) utilizzando una polimerasi del DNA di alta fedeltà e la seguente coppia di primer: VP3 in avanti, CTAA-RE1-CACC-N25 (i primi 25 nucleotidi del ORF VP3); VP3 inversa, TCTT-RE2-N25 (le ultime 25 nucleotidi del ORF VP3).
      Nota: RE1 e RE2 sono siti per enzimi di restrizione (REs) per la clonazione. CTAA e TCTT sono il terminale 5' e 3' tetranucleotidi aggiunti per facilitare la digestione degli enzimi di restrizione verso la fine di DNA double-stranded. CACC è una sequenza di consenso di Kozak.
    2. Clonare i prodotti di PCR di RE-digested tra il corrispondente RE siti di un vettore di espressione che utilizza il citomegalovirus umano immediatamente-precoce (CMV-IE) enhancer-promotore per l'espressione ad alto livello.
      Nota: Per la clonazione molecolare, digerire 5 µ g di DNA del plasmide la spina dorsale con un restriction enzyme(s) ad una concentrazione di 4 U / µ g di DNA per 1 h ad una temperatura ottimale. Frammenti PCR, di aumentare le unità di enzimi utilizzati (ad esempio, 10 U / µ g del prodotto di PCR di ORF VP3 1,6 kb) e un tempo di incubazione più lungo (ad es., 4h) a causa di un aumento del numero di siti di riconoscimento degli enzimi di limitazione per unità di lunghezza. Informazioni utili in biologia molecolare degli enzimi e delle procedure di clonazione tra cui trasformazione batterica possono essere trovati altrove15,16,17.
  2. Costruzione di pCMV-bandiera-AAPx (x = sierotipi)
    1. PCR-amplificare l'intero AAP ORF (0,6 kb) fatta eccezione per il primo amminoacido utilizzando una polimerasi del DNA di alta fedeltà e la seguente coppia di primer: AAP in avanti, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (i 25 nucleotidi dal nucleotide 4th nella AAP ORF); AAP inversa, TCTT-RE2-N25 (le ultime 25 nucleotidi del ORF AAP).
      Nota: GACTACAAGGACGACGATGACAAA codici una bandierina, che ha dimostrata di avere alcun effetti nocivi4,5 , ma può essere omesso se non è necessario.
    2. Clonare i prodotti di PCR di RE-digested tra i siti corrispondenti di un vettore di espressione dei mammiferi con il CMV-IE enhancer-promotore15,16,17.
  3. Costruzione di pHLP-Rep
    1. Digest 5 µ g del plasmide pAAV-RC2 (7,3 kb) con 20 unità ogni di Xho io e Xcm e purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione di DNA commerciale o mediante estrazione con fenolo-cloroformio.
      Nota: Rimozione dei 1,8 kb Xho io-Xcm che io frammento dal 7,3 kb pAAV-RC2 plasmide provoca una perdita di espressione della proteina del capside VP preservando l'espressione della proteina Rep.
    2. Smussato il DNA termina con 6 unità di T4 DNA polimerasi, agarosio gel-purificare il frammento di DNA di 5,5 kb e auto-legare il frammento purificato utilizzando 50-100 ng di DNA e di 400 unità di ligasi del DNA T4 secondo la raccomandazione15 del produttore.
    3. Seguire la procedura standard di trasformazione batterica viene fatto riferimento nel passaggio 1.1.2 Nota.
  4. Verificare che il plasmide si costruisce tramite digestione degli enzimi di restrizione e sequenziamento15,18.
  5. Eseguire plasmide minipreps o maxipreps con kit disponibili in commercio per ottenere una quantità sufficiente di DNA del plasmide per gli esperimenti di produzione di AAV a valle.

2. produzione di AAV in HEK 293 cellule dalla transfezione del DNA del plasmide (Cross-complementazione Assay)

  1. Coltura di cellule HEK 293 in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM)-alto glucosio (4,5 g/L) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 1%, penicillina e streptomicina Mix e 1 mM L-Glutammina, in un incubatore a 37 ° C con 5% di anidride carbonica (CO2).
    Nota: I titoli AAV variano significativamente a seconda dell'origine delle cellule HEK 293.
    Attenzione: Anche se AAV possono essere gestiti a livello di biosicurezza 1 (BSL1) contenimento, contenimento BSL2 è raccomandato per il lavoro delle cellule HEK 293.
  2. Il giorno -1 (24 h prima di transfezione), piastra 6 – 7 x 105 HEK 293 cellule/pozzetto in 2 mL di terreno completo descritto al punto 2.1, in un 6-pozzetti di piastre. Questo generalmente raggiunge confluency di ~ 90% il giorno successivo.
  3. Giorno 0: transfezione
    1. Preparazione per la transfezione del DNA
      1. Assicurarsi che le cellule hanno raggiunto confluency di ~ 90%.
      2. Scaldare DMEM completate con 1% penicillina e streptomicina Mix e 1 mM L-Glutammina, ma senza 10% FBS (cioè, privo di siero medio) in bagnomaria a 37 ° C.
      3. Lasciare la soluzione di polyethylenimine (PEI) a temperatura ambiente.
    2. Preparazione della miscela di DNA del plasmide
      1. Mescolare i plasmidi in 96 µ l di tampone fosfato salino (PBS) senza CaCl2 o MgCl2 in provette per microcentrifuga da 1,5 mL sterili, come indicato nella tabella 2. La quantità totale di DNA è di 2 µ g/pozzo.
        Nota: I volumi per la soluzione di DNA del plasmide possono essere ignorati se sono nominali. Regolazione del volume è consigliata se il volume totale delle soluzioni di DNA del plasmide è ≥ 10 µ l.
    3. Transfezione di PEI
      1. Aggiungere 4 µ l di soluzione di PEI (1 mg/mL) per il mix di PBS-plasmide DNA (preparato come sopra). Il volume finale è di circa 100 µ l (5% del volume di terreno di coltura). Vortex le provette brevemente e incubare la miscela di DNA: PEI per 15 min a temperatura ambiente.
      2. Durante l'attesa per l'incubazione di 15 minuti completare, è possibile sostituire il terreno di coltura con preriscaldati medium senza siero, descritto al punto 2.3.1.2.
      3. Una volta l'incubazione di 15 min del DNA: PEI miscela è completa, brevemente girare i tubi con una microcentrifuga per raccogliere il liquido sul fondo delle provette e aggiungere la miscela di DNA: PEI goccia a goccia al terreno di coltura in ciascun pozzetto della piastra di coltura di HEK 293. Delicatamente agitare le piastre e restituirli a incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
      4. Mantenere le cellule in questo mezzo di transfezione fino al raccolto al giorno 5 (nessun cambiamento medio è richiesto).
  4. Giorno 1 e giorno 2, osservare le cellule transfected con il plasmide pCMV-GFP sotto un microscopio a fluorescenza invertito per valutare l'efficienza di trasfezione.
    Nota: per microscopia di fluorescenza, qui un 10x / 0,25 apertura numerica obiettivo in combinazione con un oculare 10 × è stata usata, e filtro passa-banda di eccitazione di 450-490 nm e 515 – 565 nm passa-banda filtro di emissione sono stati impiegati. La suddetta condizione normalmente produce più di efficienza di trasfezione di 70%. Le cellule possono esibire alcuni cambiamenti morfologici (ad es. le cellule sono diventato sottile) dovuto lo stato privo di siero.
  5. Nei giorni 3-5, continuare a coltura le cellule transfettate in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
  6. Il giorno 5, raccogliere sia le cellule e contenenti virus medio in provette coniche da 15 mL in polipropilene pipettando su e giù o raschiando con un raschietto di cella.
  7. Conservare i campioni a-80 ° C fino all'utilizzo.

3. dot Blot Assay per quantificazione AAV

  1. Recupero di particelle virali
    1. Scongelare rapidamente i tubi congelati in bagnomaria a 37 ° C. Vortice i tubi energicamente per 1 min massimizzare il recupero di AAV dalle cellule.
    2. Pellet i detriti cellulari mediante centrifugazione a 3.700 x g a 4 ° C per 10 min. Prendere 200 µ l del surnatante da ciascuna provetta e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga etichettati con tappo a vite per il dosaggio di macchia del puntino.
      Nota: Aliquota il surnatante rimanente in microcentrifuga tubi e conservarli congelati a-80 ° C per un uso futuro. Qui, in polipropilene per microcentrifuga associati con tappi a vite e un o-ring sono stati usati. A tenuta ermetica è necessaria per prevenire sversamenti di AAV e fenolo-cloroformio.
  2. Trattamento con i marcescens del Serratia endonucleasi
    1. Preparare i reagenti Mix A e Mix B (tabella 3). Aggiungere 10 µ l della miscela A e 10 µ l di Mix B in ciascuna provetta. Vortex le provette per 5 s, brevemente girare i tubi per raccogliere il liquido sul fondo delle provette e incubare le provette a 37 ° C almeno per 1 h.
      Nota: Miscela A contiene NaOH e ottimizza pH per trattamento con endonucleasi marcescens dello s . Mix B integratori di magnesio. Concentrazione di endonucleasi marcescens dello S. in scorte di enzima commercialmente disponibili può variare. Il volume dei marcescens dello S. endonucleasi deve essere regolata per fare 200 U/mL dopo l'aggiunta di Mix A e Mix B nelle provette al punto 3.2.1.
      Nota: Un tempo di incubazione più lungo, fino a 4 h, possa diminuire segnali di fondo.
    2. Al termine dell'incubazione, girare brevemente i tubi con una centrifuga da banco per raccogliere la condensa e soluzione dalla parte superiore e i lati dei tubi.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni possono essere conservati congelati a-20 ° C o -80 ° C.
  3. Trattamento di proteinasi K
    1. Preparare il reagente di Mix C (tabella 3). Aggiungere 180 µ l di Mix C in ogni provetta. Vortex le provette per 5 s, brevemente girare i tubi e incubare le provette a 55 ° C per 1 h.
      Nota: L'EDTA nel reagente C Mix chelata ioni magnesio libero ed inattiva dell'endonucleasi marcescens dello s .
    2. Al termine dell'incubazione, permetta che i campioni raggiungano la temperatura ambiente, quindi brevemente ruota i tubi con una centrifuga da banco per raccogliere la condensa e soluzione dalla parte superiore e i lati dei tubi.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni possono essere conservati congelati a-20 ° C o -80 ° C. Per riprendere il protocollo, incubare le provette a 55 ° C per 5/10 minuti sciogliere i cristalli di SDS completamente contenute nel buffer.
  4. Precipitazione di estrazione ed etanolo fenolo-cloroformio
    1. Aggiungere 200 µ l di fenolo-cloroformio per i campioni e il vortice li per un minimo di 1 rotazione i campioni in un microcentrifuge a ≥ 16, 100 x g per ≥ 5 min a temperatura ambiente.
      Attenzione: Fenolo-cloroformio deve essere gestita in una cappa chimica con appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE; cioè, guanti in nitrile, occhiali o visiera e camice con maniche lunghe).
    2. Trasferire 320 µ l dello strato acquoso (160 µ l due volte con una pipetta P200) ad un nuovo tubo del microcentrifuge standard (80% del volume di fluido acquoso).
      Nota: È estremamente importante prendere lo stesso volume di soluzione acquosa tra campioni, altrimenti il test perde accuratezza quantitativa.
    3. Preparare il reagente di Mix D (tabella 3). Aggiungere 833 µ l di Mix D in ogni provetta. Vortex le provette per 5 s, incubare le provette a-80 ° C per ≥ 20 min.
      Nota: Mix D è una miscela di etanolo, acetato di sodio e glicogeno per precipitazione dell'etanolo conveniente del DNA. I campioni possono essere conservati a-80 ° C a questo passaggio e il protocollo può essere ripresa successivamente.
    4. Centrifugare i campioni con un microcentrifuge a ≥ 16, 100 x g a 4 ° C per un minimo di ≥ 15 Pour sovranatante e asciugare una volta su un tovagliolo di carta pulito. Mettere circa 500 µ l di etanolo al 70% in ogni tubo, vortex le provette per 5 s e centrifugare le provette con una microcentrifuga da banco presso ≥ 16, 100 x g a 4 ° C per ≥ 5 min.
    5. Versare il sovranatante e macchia una volta su un tovagliolo di carta pulito. Asciugare il pellet a 65 ° C; pellet può essere asciugata completamente.
      Nota: Non utilizzare una pipetta per eliminare l'etanolo in eccesso che rimane dopo macchiare i tubi. Pellet anche possono essere essiccati a temperatura ambiente durante la notte. Il protocollo può essere messo in pausa qui e secchi pellet di DNA può essere conservato a temperatura ambiente per diversi giorni con il coperchio del tubo chiuso.
  5. Risospensione di DNA virale nel buffer di TE
    1. Sciogliere i pellet di DNA in 120 µ l di tampone di TE agitando ogni tubo per 30 min a 1 h a temperatura ambiente.
  6. Macchia del puntino
    1. Preparazione di campioni di DNA del plasmide
      1. Diluire il DNA del plasmide genoma vettore AAV a 10 ng / µ l in acqua o in tampone Tris-HCl (10 mM, pH 8.0). Prendere 25 µ l di questa diluizione e digest con un enzima di restrizione appropriato per 1 h a linearizzare il plasmide DNA, in un volume di reazione di 50 µ l.
        Nota: Facciamo un set duplicato della digestione (vedi passo 3.6.4.1). L'enzima appropriato dovrebbe essere uno che taglia il DNA del plasmide di fuori della regione di sonda-associazione dot blot. Per comodità, il DNA del plasmide diluito può essere aliquotati (25 µ l/tubo) e conservati congelati a-20 ° C per un uso futuro. Digerire il DNA del plasmide mentre i tubi tremano al punto 3.5.1. Non sovra-digerire il plasmide DNA standard.
      2. Aggiungere 450 µ l di acqua o TE nella provetta contenente il plasmide digerito DNA standard e mescolare accuratamente. Trasferimento 70 µ l di questa miscela ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL con 1.330 µ l di acqua o TE per rendere un plasmide diluito standard (25 pg / µ l).
      3. Seguire la tabella 4 per creare una serie di diluizioni seriali (600 µ l/tubo). Mescolare accuratamente le diluizioni nel Vortex per 5 s.
    2. Denaturazione di standard e campioni di DNA virali
      1. Aggiungere 600 µ l di soluzione alcalina: 2x per ogni diluizione normale. Mescolare bene su vortex per 5-10 s. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
      2. Aggiungere 120 µ l di soluzione alcalina: 2x per ciascun campione di DNA virale. Mescolare bene su vortex per 5-10 s. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
    3. Impostazione dell'apparato di macchia del puntino
      1. Utilizzando le forbici, tagliare una membrana macchiare (ad es., zeta-sonda) su una dimensione appropriata per il numero di campioni e standard. Mettere a bagno la membrana con acqua per 10 min prima di posizionarlo su un apparato di macchia del puntino. Coprire i pozzetti non utilizzati sull'apparato di membrana.
        Nota: Maneggiare la membrana con pinzette pulite. Per coprire i pozzetti vuoti, il foglio di protezione dalla luce blu che viene fornito con la membrana può essere utilizzato. Non consentono la membrana ad asciugare prima all'associazione di campioni e standard. Per maggiori dettagli sul montaggio e l'uso dell'apparato, fare riferimento al manuale utente19.
      2. Aggiungere acqua per i pozzi a cui verranno caricati i campioni. Applicare il vuoto e tirare acqua attraverso pozzi per controllare gli errori e ripetere il test quando fissa. Serrare nuovamente le viti durante l'applicazione di vuoto per garantire la tenuta ermetica.
        Nota: Chiusura incompleta può causare perdite di campione tra i pozzetti.
      3. Una volta che l'acqua è completamente tirato attraverso, rilasciare completamente il vuoto (cioè, il collettore del vuoto dovrebbe essere aperto alla pressione atmosferica).
    4. Caricamento standard e campioni all'apparato di dot blot
      1. Applicare 400 µ l di ogni standard di DNA del plasmide diluito in ciascun pozzetto ed eseguire quattro corsie di diluizioni standard. Utilizzare due aliquote separate del digest standard e caricare ciascuna in duplice copia. Applicare 200 µ l/pozzetto di ciascun campione di DNA virale.
        Nota: Utilizzando il restante ~ 40 µ l di campioni denaturati, campioni diluiti possono essere preparati (ad esempio, 10 volte campione diluito usando 20 µ l di campione più 180 µ l di soluzione alcalina: 1x) e cancellati se necessario.
      2. Applicare il vuoto delicato per tirare le soluzioni di DNA attraverso il pozzo.
        Nota: Ha bisogno di pressione di vuoto di essere regolata aprendo parzialmente una valvola a tre vie in modo che la pressione di vuoto viene applicata al puntino della macchia apparato così come l'atmosfera (cioè, con le braccia di rubinetto posizionato a un angolo di circa 45 ° dove si fa un rumore di aspirazione più forte).
      3. Una volta che tutti i pozzetti siano vuoti, è possibile rilasciare il vuoto regolando la valvola a tre vie. Aggiungere 400 µ l di soluzione alcalina: 1x in ciascun pozzetto contenente campioni e standards. Attendere 5 minuti prima di ri-applicazione di vuoto per svuotare i pozzetti.
      4. Ri-applicare il vuoto nello stesso modo (vedi passo 3.6.4.2).
      5. Smontare l'apparato di macchia del puntino sotto vuoto, rimuovere la membrana e sciacquarlo con 2 x SSC. Posizionare la membrana su un panno di carta con il lato di DNA associato rivolto verso l'alto per rimuovere l'eccesso 2 x SSC.
      6. UV-crosslink blotted DNA alla membrana con un appropriato crosslinker UV; la membrana è ora pronta per l'ibridazione.
        Nota: Membrane bagnate possono essere utilizzate per reticolazione UV. I secchi, UV-reticolati membrane possono essere conservate a temperatura ambiente. Ulteriori informazioni possono essere trovate nella Tabella materiali.
  7. Ibridazione e lavaggio
    1. Scaldare il tampone di ibridazione in un bagno di acqua di 65 ° C.
    2. Enzimaticamente etichettare una sonda di DNA con radioattivo α -32P dCTP e purificarla utilizzando kit commercialmente disponibili secondo la raccomandazione del costruttore.
      Nota: Utilizziamo una sonda di 0,5 – 2,0 kb in lunghezza da una regione enhancer-promotore o una sequenza di proteina-codificazione del genoma virale. Anche se questo protocollo utilizza 32P-identificato sonde radioattive per rilevazione del segnale, possono essere utilizzate anche non radioattivo sonde fluorescenti o chemiluminescente (fare riferimento alla sezione di discussione ).
    3. Posizionare la membrana in una bottiglia di ibridazione con il lato di DNA associato a, risciacquare la membrana con 5ml preriscaldata tampone di ibridazione e scartare il buffer. Aggiungere 10 mL di tampone di ibridazione preriscaldati, quindi posizionare la bottiglia in un forno rotante di ibridazione a 65 ° C. Ruotare per ≥ 5 min.
    4. Calore-denaturare 20 µ l di 10 mg/mL Tosato aringhe o soluzione di DNA di sperma di salmone e la sonda marcata con P 32(≥ 107 cpm) per 5 min inserendo i tubi su un insieme di blocchi di calore a 100 ° C. Poi snap-chill sul ghiaccio per ≥ 2 min, spin brevemente e tenere il ghiaccio fino all'utilizzo.
      Attenzione: Per le sonde di DNA radioattive, provette da 1,5 mL con tappo a vite e o-ring devono essere utilizzate.
    5. Aggiungere rapidamente il DNA denaturato sperma e la sonda radioattiva per il tampone di ibridazione l'ibridazione in bottiglia e agitare il flacone per 10 s a mescolare. Riportare la bottiglia per il forno di 65 ° C ed incubare la bottiglia con rotazione a 65 ° C per ≥ 4 h.
    6. Una volta completata l'ibridazione, fermare la rotazione, rimuovere la bottiglia di ibridazione e poi versare la soluzione di sonda radioattiva in una provetta conica 50 mL con tappo a sigillo tappo di tenuta. Conservare la sonda in un apposito contenitore disposto in un frigorifero indicato per materiali radioattivi.
      Nota: Usate tampone di ibridazione con una sonda che è conservata a 4 ° C possono essere riutilizzati almeno 5 volte ponendo la provetta conica da 50 mL con un tappo a tenuta tenuta spina contenente tampone di ibridazione in bagnomaria a 100 ° C per 5 min.
    7. Lavare la membrana con Buffer lavare riscaldato a 65 ° C. Aggiungere 20-30 mL di tampone di lavaggio per la bottiglia di ibridazione e ruotare per 5 min, Ripeti questo lavare 2 volte.
      Nota: Misurare la radioattività di soluzioni di lavaggio e registrarlo se richiesto dall'istituto locale.
    8. Mentre ci si lava la membrana, posizionare un fosforo imaging schermo su una gomma di immagine per 5 min.
    9. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere la membrana dalla bottiglia ibridazione, rimuovere il tampone in eccesso sulla membrana con asciugamani di carta e posizionare la membrana in un supporto di carta in plastica trasparente. Controllare i segnali radioattivi sulla membrana utilizzando un contatore di Geiger. Esporre lo schermo imaging di fosforo cancellati alla membrana per 10 min a tutta la notte a seconda dell'intensità di segnale.
    10. Scansione sullo schermo utilizzando una sistema di scansione delle immagini fosforo e ottenere i dati sull'intensità di segnale di ogni punto.
  8. Analisi dei dati
    1. Disegnare una curva standard utilizzando software di analisi dati e foglio di calcolo (ad esempio, Excel).
      Nota: Log-log regressione lineare è stata usata per disegnare una curva standard.
    2. Determinare nanogrammo-equivalente (ng-eq) per ciascuno dei campioni del DNA virali mediante interpolazione. La ng-eq è la quantità del plasmide DNA usato per disegnare una curva standard che equivale al numero di molecole di DNA virale. Quando la lunghezza del DNA del plasmide è 8.000 bp, 1 ng-eq del DNA virale di single-stranded AAV corrisponde a 2.275 x 108 particelle.
      Nota: Ng-eq può essere convertito in numero di particelle virali con le seguenti equazioni:
      Equazione per il calcolo delle particelle AAV a filamento singolo; Quantificazione del DNA; Formula di genetica molecolare.
      Equazione per il calcolo delle particelle AAV a doppio filamento utilizzando la lunghezza del plasmide; formula scientifica.
      Il numero di particelle AAV è convenzionalmente espressi come "vg" (vector genomi) o "DRP" (particelle dnasi I-resistente).
    3. Calcolare le concentrazioni di AAV di materie. Perché il DNA virale blotted rappresenta 66,7% Formula di calcolo percentuale: (320/400 × 200/240 × 100%) per l'analisi dei dati. del DNA virale nei materiali di partenza, 1 ng-eq corrisponde a 1,7 x 109 particelle/mL formula di calcolo dell'equazione matematica, divisione del rapporto, moltiplicazione, notazione scientifica .
      Nota: Questa correzione non è necessaria se è cancellato tutto il DNA virale contenuto nel materiale di partenza su una membrana senza perdita (Vedi Figura 1).

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Risultati

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Un risultato rappresentativo dei quantitativi dot blot per quantificazione delle scorte di vettore AAV purificate prodotta su larga scala è illustrato nella Figura 1. Con questa analisi di macchia del puntino, il titolo di uno stock di vettore di double-stranded AAV2G9-CMV-GFP è stato determinato. Il vettore è stato purificato mediante due turni di cloruro di cesio (CsCl) ultracentrifugazione di pendenza di densità seguita da dialisi come descritto in precede...

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Discussione

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In questo rapporto, l'utilità di analisi blot quantitativo dot per studiare AAV AAPs e il loro ruolo nell'assembly del capsid è descritto. Conoscenze acquisite da questi studi possono fornire approfondimenti dettagliati nelle differenze innate nel processo di assemblaggio del capside AAV ed il ruolo funzionale di AAPs tra diversi sierotipi. A questo proposito, il punto croce-complementazione AAV VP3-AAP blot analisi ha rivelato che serpente AAV VP3 visualizzato una rigorosa dipendenza il co-espressione di sue cognate AAP...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Vi ringraziamo di averci fornito il plasmide pEMBL-CMV-GFP Xiao Xiao presso la University of North Carolina a Chapel Hill. Ringraziamo Christopher Cheng e Samuel J. Huang per una lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal servizio di sanità pubblica concede (NIH R01 NS088399 e T32 EY232113).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BenzonaseMilliporeSigma1016970001indicato come Serratia marcescen endonucleasi nel testo principale.
La DNasi IRoche4716728001indicata come DNasi I enzima A nel testo principale.
La DNasi IInvitrogeno18047019indicata come DNasi I enzima B nel testo principale.
DNasi INew England BiolabsM0303LIndicato come DNasi I Enzima C nel testo principale.
microcentrifuga con O-ring da 1,5 mL Corning430909
Provette per microcentrifuga da 1,5 mLThermo Fisher Scientific05-408-129
Provetta conica in polipropilene da 15 mLCorning352097
3 M Acetato di sodioTeknovaS0298
Provetta conica in polipropilene da 50 mLCorning430291
Cellule AAV-293Agilent240073linea cellulare HEK-293 ottimizzata per il confezionamento di virioni AAV.
AccuGENE 0,5 M EDTA SoluzioneLonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0Lonza51238
AccuGENE 10% SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE TamponeLonza51235
Apparecchio Bio-RAD1706545
Albumina sierica bovinaMilliporeSigmaA3294
Cell LifterCorning3008
CloroformioMilliporeSigma372978
Kit estrattore di DNAWako Pure Chemical Industries295-50201Questo viene utilizzato per macchie quantitative su virus purificato. In ogni fase utilizziamo solo metà volume di tutti i reagenti consigliati per lo schema di protocollo 2 nel manuale fornito dal produttore.
Dulbecco' s Eagle modificato Medio (DMEM)-alto glucosio (4,5 g/L)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10B CellsThermo Fisher Scientific18290015
Ethanol 200 ProofDecon Labs2716
Siero fetale bovinoVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095Indicato come polisaccarosio 400.
Microscopio a fluorescenzaZeissAxiovert 40 CFL
GlicogenoRoche10901393001
Spermatozoi di aringhe DNAInvitrogen15634-017
Provette di ibridazioneThermo Fisher Scientific13-247-150
ImageQuant TLGE Healthcare Life SciencesImageQuant TL
L-glutammina 200 mMLonza17-605E
Cloruro di magnesio esaidratoMilliporeSigmaM0250
MicroPulser ElectroporatorBio-Rad1652100
Mini colonne di DNA a rotazione rapidaMilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 VectorCell Biolabs IncVPK-422
Penicillina/Streptomicina 10K/10KLonza17-602E
salina tamponata con fosfatoLonza17-516F
Cassetta di esposizione al fosforoGE Healthcare Life SciencesVari
schermi di imaging al fosforoGE Healthcare Life SciencesVari
plasmidi Maxi KitQIAGEN12162
Platino Pfx DNA polimerasiInvitrogen
PolietilenimminaPolysciences Inc23966-2
PolivinilpirrolidoneMilliporeSigmaP5288
Prime-It II Kit di etichettatura del primer casualeAgilent Technologies300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotidi dal 4° nucleotide nell'AAP ORF, RE1 è un sito enzimatico di restrizione per il clonaggio): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		MilliporeSigmaCustom Primer
Primer AAP Reverse (N25 è l'ultimo 25 nucleotidi dell'AAP ORF, RE2 è un sito enzimatico di restrizione per il clonaggio): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Primer VP3 Forward (N25 i primi 25 nucleotidi dell'ORF VP3, RE1 è un sito enzimatico di restrizione per il clonaggio): CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 sono gli ultimi 25 nucleotidi dell'AAP ORF, RE2 è un sito enzimatico di restrizione per la clonazione): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Proteinasi K SoluzioneInvitrogen25530-049
Enzimi di restrizioneNew England BiolabsVari
spermatozoi di salmone DNAInvitrogen15632011
Pipette sierologicheThermo Fisher Scientific13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Cloruro di sodioThermo Fisher ScientificS271-10
Citrato di sodio Diidrato tribasicoMilliporoSigmaC8532
T4 DNA polimerasiNew England BiolabsM0203L
TermociclatoreEppendorf6321000515
Piastra trattata con coltura tissutale Corning a 6 pozzetti
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-5
Tifone FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28955809
Phenol Invitrogen15513-047
UV CrosslinkerSpectrolineXLE-1000Optimal, che fornisce un dosaggio di energia UV di 120 mJ/cm2.
membrana con sonda ZetaBio-RAD162-0165
Provette per Soluzione 11708013353046 Viene utilizzata la modalità UV Crosslinker

Riferimenti

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