Conseguenze a lungo termine del comportamento e riproduttive di embrionale esposizione alle sostanze tossiche della basso-dose

Sommario

L'esposizione a sostanze tossiche ambientali possa avere un impatto acutamente sviluppo con effetti a lungo termine. Protocolli dettagliati sono forniti per illustrare una strategia utilizzando un modello di laboratorio efficace per studiare l'effetto di embrionale precoce esposizione al bisfenolo A. Forniamo analisi comportamentale per monitorare l'efficacia della nostra esposizione tossico bio-saggi e fecondità.

Abstract

Bisfenoli, come il bisfenolo A (BPA) e bisfenolo S (BPS) sono polimerizzando agenti ampiamente usati nella produzione di materie plastiche e numerosi prodotti di uso quotidiano. Sulla loro struttura chimica e le proprietà biologiche di estradiolo-come base, sono stati classificati come composti (EDC) il sistema endocrino. A lungo termine dell'esposizione a interferenti endocrini, anche a basse dosi, è stato collegato a vari difetti di salute compreso cancro, disturbi comportamentali e sterilità, con una maggiore vulnerabilità indicata durante i periodi dello sviluppo precoce. Studi molecolari e cellulari con il modello geneticamente trattabile del nematode Caenorhabditis elegans hanno dimostrato che l'esposizione al BPA provoca apoptosi, meccanismi di riparazione di letalità embrionale e la rottura del DNA. Precedentemente abbiamo riferito che l'esposizione di embrioni di c. elegans a basse dosi di diversi bisfenoli diminuzioni fecondità. Inoltre, abbiamo dimostrato che gli effetti dell'esposizione durante le primissime fasi di sviluppo persistono nell'età adulta, come analizzato da quantificare il comportamento di assuefazione, una forma di apprendimento non associativo. Qui, forniamo protocolli dettagliati per esposizione embrionale a EDCs della basso-dose così come la fecondità associata e anteriore toccare le analisi di assuefazione, insieme a risultati rappresentativi.

Introduzione

L'esposizione a sostanze tossiche ambientali, in particolare composti quelli che tendono ad interferire con lo sviluppo, è stato sotto attento esame scientifico negli ultimi anni. Più di mille prodotti chimici di uso quotidiano sono classificati come composti (EDC)¹il sistema endocrino. Periodi di rapida crescita e sviluppo, che comprendono embrionale, infantile e fasi di infanzia, sono stati notati per essere particolarmente vulnerabili agli effetti deleteri di EDC anche della basso-dose. Loro effetto sono stati indicati per causare disordini riproduttivi e neurodevelopmental². Secondo la US Environmental Protection Agency e noi National Toxicology Program pannello le linee guida, una dose bassa può definirsi come qualsiasi dose sotto il livello di uno che è stato segnalato per causare un cambiamento biologico osservabile o³. Oltre agli effetti della basso-dose di EDCs individuali, miscele di vari EDCs trovato a basse concentrazioni nell'ambiente hanno il potenziale di causare effetti cumulativi sostanziali⁴.

Bisphenol A (BPA o 4,4'-(propane-2,2-diyl)) è un agente di polimerizzazione trovato in oggetti comunemente usati come bottiglie d'acqua, archiviazione delle ricevute, sigillanti dentali e i rivestimenti delle bevande e lattine di cibo⁵. A causa della sua somiglianza strutturale con 17-β estradiolo (E₂) e la sua affinità per i recettori degli estrogeni ERα ed ERβ, BPA è stato classificato come un prodotto chimico (EDC)^5,6il sistema endocrino. Anche se più debole, affinità di BPA ai recettori degli estrogeni ha dimostrato di influenzare il sistema di riproduzione di entrambi i sessi e interrompere le funzioni neurali a dosi che sono considerate sicuro^7,8. Cambiamenti nella metilazione del DNA tramite meccanismi epigeneticamente regolamentati sono stati osservati per causare i difetti di un neurone a lungo termine in topi esposti a BPA⁹. In particolare, BPA inoltre è stato implicato come un possibile colpevole per tassi aumentati di iperattività, deficit di attenzione e sensibilità aumentata ai farmaci a causa di un aumento visto in ricevitori della dopamina D1 nel proencefalo limbico del mouse dopo esposizione cronica ^{9 , 10}. prova significativa sugli effetti deleteri di EDCs sulla salute umana è basata sugli studi di correlazione concentrandosi principalmente sull'esposizione cronica delle popolazioni a tossici ambientali anche a basse dosi⁵; Tuttavia, limitazioni a inferenze dagli studi umani e nel manipolare i controlli sperimentali sono state accettate senza tralasciare le critiche infondate hype^11,12.

Dovuta alla conservazione dei geni di Caenorhabditis elegans' per quanto riguarda i mammiferi, tra cui suoi geni steroide ormone-recettore, i ricercatori hanno utilizzato questo modello di laboratorio geneticamente trattabili per svelare gli effetti funzionali e meccanicistici di EDCs ¹³. esperimenti con c. elegans hanno dimostrato che questi composti come BPA e BPS possono causare apoptosi, letalità embrionale, rottura nei meccanismi di riparazione pausa di double-stranded del DNA e la funzione neurale^{14,15 ,16}.

Il nostro laboratorio ha precedentemente dimostrato che anche della basso-dose esposizione limitata a embriogenesi precoce porta a abbassata fecondità con i deficit comportamentali nei superstiti adulti¹⁵. Assuefazione ad uno stimolo ripetuto è una forma di apprendimento non associativo in sistemi modello, tra cui c. elegans, e la nostra metodologia utilizza questa forma di apprendimento non associativo come un output comportamentali di saggiare gli effetti a lungo termine dell'esposizione embrionale per le sostanze tossiche¹⁷ in particolare, forniamo protocolli dettagliati per studiare l'esposizione al BPA su c. elegans, compresi gli effetti immediati sulla letalità embrionale e gli effetti a lungo termine il comportamento degli adulti, con un complessivo schema raffigurato in Figura 1. Risultati rappresentativi da dosaggi di apprendimento non associativo e fecondità sono forniti per evidenziare l'efficacia della nostra metodologia.

Protocollo

Protocolli indicati di seguito sono stati standardizzati per testare gli effetti dell'esposizione al BPA durante l'embriogenesi precoce e possono essere modificati per l'utilizzo con BPS, BPF o altri EDCs e sostanze tossiche sugli embrioni di c. elegans .

1. materiale installazione

1. Preparare 500 mL di media¹⁸ Nematode crescita Media (NGM) sciogliendo 1,5 g di NaCl, 1,25 g di peptone e 8,5 g di agar-agar in acqua a 500 mL. Dopo la sterilizzazione in autoclave (121 ° C, 15 PSI, 20 min), aggiungere 0,5 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo), 0,5 mL di 1 M MgSO₄, 0,5 mL di 1 M CaCl₂ e 12,5 mL di 1 M tampone fosfato di potassio, pH 7,4 (108,3 g di KH₂PO₄ 35,6 g di K₂HPO₄, acqua a 1 L).
2. Preparare una soluzione di ipoclorito con 25 mL di 1 N KOH, 4 mL di candeggina e 71 mL di acqua. Rendono questa soluzione fresca.
3. Preparare il tampone di M9 mescolando 3 g di KH₂PO₄, 6 g di Na₂HPO₄, 5 g di NaCl, 5 mL di 1 M di MgSO₄e l'acqua per 1 L.
4. Preparare S Buffer¹⁸ mL 129 di 0,02 M K₂HPO₄, 871 mL di KH₂PO₄e 5,85 g di NaCl.
5. Sterilizzare in autoclave buffer M9 e S.
6. Far crescere una cultura notturna di Escherichia coli (ceppo OP 50) in 20 mL di brodo di Luria (LB).
7. Dissolversi BPA in etanolo di 10% per ottenere una soluzione stock di 1 mM. Effettuare diluizioni successive di 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM e 10 µM nel buffer di S.
   Nota: Diluizione nel buffer S acquoso riduce notevolmente la concentrazione di etanolo; per esempio, a più alta concentrazione di BPA descritto in questo protocollo (10 µM), la concentrazione di etanolo è 0.1% v/v.

2. c. elegans Culturing e sincronizzazione

1. Versare i media NGM in piastre di 100 mm (circa 25 mL/piastra) e lasciare solidificare. Una volta solidificato, seminare le piastre distribuendo 150 µ l di e. coli OP50 dalla coltura liquida cresciuta durante la notte. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
2. Il giorno successivo, trasferimento N2 vermi sulle nuove piastre in chunking una lastra approssimativa di 1 cm quadrati. Consentire il worm a crescere per 3 giorni a 20 ° C fino a quando la piastra viene popolata con gli adulti maturi ben nutriti contenenti embrioni visibili.
3. Per sincronizzare, lavare ogni piastra pipettando fino a 5 mL di tampone di M9 su tutta la piastra. Trasferire il liquido in una provetta conica sterile 15 mL.
   Nota: La sincronizzazione avviene per uccidere i vermi adulti e raccogliere gli embrioni che sono relativamente la stessa fase.
4. Centrifugare a 3.000 x g per 4 min a temperatura ambiente al fine di ottenere un pellet sciolto di vermi adulti.
5. Utilizzando una pipetta 10ml, rimuovere con cautela il supernatante in modo da lasciare intatto il pellet. Aggiungere 5 mL di soluzione di ipoclorito e mescolare delicatamente.
6. Centrifugare a 3.000 x g a temperatura ambiente per 4 minuti.
7. Rimuovere il surnatante con una pipetta da 10 mL e lavare con 7 mL di tampone di M9. Ripetere questo passaggio due volte.

3. esposizione di vermi al BPA

1. Dopo l'ultimo lavaggio dal passaggio 2.7 sopra, sospendere circa 100 µ l di uova con buffer di M9. Trasferire circa 50 µ l di uova provette microfuge 2 mL già contenente la concentrazione appropriata che BPA diluito in un tampone di S. Regolare la quantità di S-tampone per garantire la corretta concentrazione finale del BPA (0.0 µM, 0,1 µM, 0,5 µM, 1,0 µM, 5,0 µM e 10 µM) per tubo. La tabella 1 illustra un modo per rendere queste diluizioni.

Per la concentrazione finale di BPA	Stock BPA (100 μM)	Buffer di S	Vermi sincronizzato
0,1 ΜM	1 ΜL	949 ΜL	50 Μ l
0,5 ΜM	5 ΜL	945 ΜL	50 Μ l
1 ΜM	10 ΜL	940 ΜL	50 Μ l
5 ΜM.	50 Μ l	900 ΜL	50 Μ l
10 ΜM	100 ΜL	850 ΜL	50 Μ l

Tabella 1: Stock BPA, S buffer e sincronizzati vermi usati per raggiungere la desiderata concentrazioni utilizzate per il nostro studio.

2. Inserire le provette in un agitatore e agitare delicatamente per 4 h a 20° C, a 25 giri/min per un agitatore rotante o si inclina 25min per un agitatore a dondolo.
3. Dopo 4 h, inserire le provette in supporti del tubo e consentire vermi a stabilirsi.
4. Eliminare il surnatante e trasferire vermi seminati piastre (NGM con OP50 Escherichia coli). Rendere la coltura liquida OP50 Escherichia coli come indicato in 1.5 e le piastre del seme come indicato al punto 2.1.
5. Lasciate che i vermi crescono per 60 h a 20 ° C. Esaminare piastre ogni giorno per contaminazione. Piastre di NGM contaminati sono solitamente scoloriti e accompagnate da diverse colonie. Verifica vermi sotto il microscopio per sovraffollamento. Una mancanza di prato OP50 Escherichia coli e vermi concentrati in piccole macchie significare sovraffollamento.

4. anteriore Touch assuefazione Assay

1. Trasferire circa 10 giovani sincronizzati vermi adulti a nuove piastre NGM non teste di serie, utilizzando un filo di platino 30g fuoco-sterilizzato pick. Lasciare riposare per 5 min consentire loro vermi tempo per acclimatarsi alla nuova piastra.
2. Per la risposta di assuefazione, utilizzare un capelli sopracciglio fissato all'estremità di uno spiedino di legno o stuzzicadenti e sterilizzare mediante immersione in etanolo al 70%. Pulire con un panno pulito privo di lanugine e attendere 1 min per etanolo ad evaporare. Toccare delicatamente il worm sulla testa (anteriore del bulbo faringeo) utilizzando i capelli del sopracciglio. Ripetere i tocchi, permettendo 10 s tra tocchi al fine di permettere al worm di recuperare.
3. Continuare a toccare (permettendo 10 intervalli di interstimulus s) fino a quando il verme non si muove all'indietro. A questo punto, il worm ha abituati allo stimolo. Registrare il numero di tocchi necessari per il verme a habituate.
4. Analizzare la differenza tra i tassi medi di assuefazione dei controlli trattati e non trattati mediante One-way ANOVA seguito dal test post-hoc di Tukey.

5. worm fecondità Assay

1. Trasferimento individuale L3 worm per un piatto fresco e teste di serie, usando un plettro di platino. Assicurarsi che solo un verme è posto per piastra.
   Nota: dopo la fase larvale L3, vermi si sviluppano in stadi larvali L4 e nell'età adulta. Presto li picking è conveniente in quanto sono abbastanza grandi per il trasferimento di singoli animali, garantendo nel contempo che non abbiano già posto tutte le uova che altrimenti sarebbero saltate nel conteggio.
2. Contare il numero di uova deposte ogni 12-24 h. Dopo il conteggio, è possibile trasferire il worm di padre per una nuova piastra. Ripetere fino a quando il worm smette di deporre le uova, in genere dopo 5 giorni quando incubate a 20 ° C.
   Nota: in media, un worm di tipo selvaggio può deporre fino a 300 uova; di conseguenza, trasferendo il padre per una nuova piastra ogni giorno impedisce di sovraffollamento.
3. Analizzare la differenza tra il numero medio di uova deposte dai controlli trattati e non trattati usando il One-way ANOVA seguito dal test post-hoc di Tukey.

Risultati

Precedenti studi con c. elegans hanno riferito che la continua esposizione ad alte concentrazioni di BPA (≥ 1 mM) durante lo sviluppo dell'embrione e l'età adulta diminuisce fecondità¹⁴. Successivi studi segnalati dal nostro laboratorio hanno mostrato che gli embrioni che sono stati esposti a BPA per un periodo limitato di 4 h nelle fasi iniziali del loro sviluppo hanno mostrato una diminuzione del numero di uova vitali di cui come adulti¹⁵ (Figura 2). Due caratteristiche chiave della metodologia sono stati che (i) le concentrazioni di BPA utilizzate erano significativamente più basso (0,1 µM a gamma 10 µM) e (ii) l'esposizione è stata limitata al periodo embrionale precoce. Oltre alla fecondità in diminuzione anche a basse dosi, la nostra assuefazione le analisi hanno rivelato che vermi esposti a BPA come embrioni necessari ulteriori stimoli per diventare abituati rispetto ai vermi esposti al veicolo da solo¹⁵ (Figura 3). Questi effetti sono degni di nota in quanto si basano su esposizione al BPA della basso-dose, seguendo la logica che più sottili effetti sulla funzione di un neurone che potrebbe non essere morfologicamente evidente rischiano di essere distinguibile attraverso i cambiamenti del comportamento. In breve, i risultati rappresentativi presentati qui sottolineatura il fatto che gli effetti nocivi dell'esposizione al BPA a un embrione influisce il suo sviluppo, compreso la funzione di un neurone che può essere valutata attraverso analisi comportamentale adulte in c. elegans. I protocolli forniti qui possono essere utilizzati per testare gli effetti della basso-dose, nonché a lungo termine di altre potenziali sostanze tossiche tra cui composti disgregativi endocrini.

Figura 1: rappresentazione schematica del disegno sperimentale. Vermi maturi sono stati raccolti ed esposti a una soluzione di ipoclorito al fine di raccogliere embrioni sincronizzati. Gli embrioni sono stati poi esposti a diverse concentrazioni di BPA per 4 h. Gli embrioni esposti sono stati trasferiti sulle piastre NGM seminati, dove avevano il permesso di crescere per 60 h a 20 ° C. Al fine di testare l'efficacia dell'esposizione durante le prime fasi di sviluppo, i vermi L4 sono stati trasferiti a piatti individuali e testati per la fecondità, e giovani adulti sono stati testati con tocco anteriore assuefazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: fecondità è abbassato da BPA. L'esposizione a 1 µM e più alte concentrazioni di BPA ha fatto diminuire significativamente il numero di uova deposte rispetto al controllo (rappresentato dalla linea orizzontale; n = 10, *p < 0,05). Le barre di errore indicano SEM. analisi fatta facendo uso di ANOVA, test post-hoc di Tukey. Questa figura è stata modificata da Panda et al., 2015¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: effetti a lungo termine dell'esposizione al BPA embrionale si riflettono nel comportamento adulto. Embrioni esposti a BPA concentrazioni basse come 0,1 µM colpisce non associative anteriore tocco assuefazione negli adulti (n = 60, *p < 0,05). Le barre di errore indicano SEM; ANOVA, test post-hoc di Tukey. Questa figura è stata modificata da Panda et al., 2015¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Fasi di rapida crescita e sviluppo come l'embriogenesi sono particolarmente vulnerabili agli effetti nocivi di vari composti endocrino, tra cui il BPA. Forniamo protocolli dettagliati per studiare gli effetti dell'esposizione al BPA o altre sostanze tossiche nel modello invertebrati marini c. elegans , che permette il comodo titolazione di un intervallo di concentrazioni da valutare il suo effetto sulla vitalità dell'embrione (Figura 2) . Follow-up esperimenti comportamentali su come sopravvivere gli adulti che si sviluppano da embrioni che sono stati esposti a basse dosi di BPA consente di diluire gli effetti a lungo termine sulla funzione neuronale (Figura 3). L'idea centrale di questa carta è quello di fornire protocolli dettagliati per l'esposizione di embrioni alle varie sostanze tossiche durante il primo periodo di embriogenesi nel modello elegans del c. ; finestra 4 h prima del suo periodo di sviluppo embrionale 11,5 ore (a 20 ° C) corrisponde al periodo di proliferazione, che è seguito da organogenesi. A tal fine, abbiamo fornito convalida dei punti finali attraverso dosaggi di apprendimento non associativo e fecondità. Mentre la base meccanicistica dell'azione del BPA e altri bisfenoli è il Santo Graal verso cui si rivolge la ricerca in questo campo, abbiamo non tentativo di offrire una spiegazione meccanicistica per l'azione del BPA in questo articolo di concentrati di metodologia. Tuttavia, vorremmo sottolineare che il modello di c. elegans offre un sistema ideale per dividere ulteriormente il meccanismo di azione. Ad esempio, in futuro lavoro su decifrare i meccanismi di azione di BPA, mutanti di c. elegans possono essere generati e schermati per una resistenza agli effetti del BPA e quindi spianano la strada per decifrare la via. Inoltre, la nostra carta di compagno si occupa l'effetto del BPA a livello di sincronia rete neurale nei vertebrati, fornendo un altro viale per comprendere le basi per studiare i meccanismi potenziali per effetti tossico¹⁹.

Nella metodologia dettagliata in questa carta, alcuni dei passaggi critici che devono essere eseguiti extra con attenzione sono i seguenti: scegliere un piatto con ben nutrito di c. elegans adulti con uova mature visibili al microscopio di dissezione è cruciale, e non riuscendo a seguire questo passaggio si tradurrà in una dimensione di campione insufficiente degli embrioni per l'esperimento di esposizione EDC. È anche importante assicurarsi che la soluzione di ipoclorito è fatta fresca per evitare di ottenere una popolazione non sincronizzata che interferisca con la capacità di eseguire l'esposizione al BPA durante l'embriogenesi precoce. Lavare il pellet con M9 (dopo l'esposizione di ipoclorito) è anche un passo molto importante. Se non eseguita correttamente, l'alta concentrazione di candeggina potrebbe generare embrioni morti. Inoltre, gli embrioni devono essere trasferiti alle teste di serie NGM piastre dopo 4 h. Se lasciato nella soluzione BPA per un periodo prolungato di tempo, gli embrioni sono possa trasformarsi nelle larve di dauer longevi. Ciò interferirà significativamente sia con analisi di fecondità e analisi comportamentale. Se uno di questi passaggi è mancato, è consigliabile iniziare la procedura dall'inizio. Se per qualsiasi motivo, la piastra NGM con i vermi è contaminata o non hanno cibo a sufficienza, si aggiungerà lo stress sui vermi quindi inclinare i dati raccolti. Tali piastre devono essere eliminati e non essere usati nell'esperimento.

In precedenza, uno studio notevole usato con successo il modello di c. elegans per dimostrare che le anomalie del cromosoma causato dal risultato BPA a causa della rottura del macchinario di riparazione del DNA nel germline¹⁴. Tuttavia, è interessante nota che il disegno dello studio sopra aveva usato la continua esposizione al BPA di c. elegans ad alte dosi di BPA in tutta la sua durata. La nostra metodologia è stata progettata per studiare le dosi basse di esposizione al BPA durante l'embriogenesi precoce, in modo dai suoi effetti sulla vitalità embrionale e più sottili effetti a lungo termine i sopravvissuti di analisi. A nostra conoscenza, nessuna metodologia è stata sviluppata per esporre i primi embrioni di fase a dosi molto basse di BPA limitata a un determinato periodo di tempo; così, rendendo il metodo qui presentato il romanzo.

Inoltre, i protocolli forniti qui può essere facilmente adattato per studiare gli effetti di altri EDCs durante la fase di proliferazione dell'embriogenesi. Tuttavia, al fine di studiare la fine delle fasi embrionali, il protocollo richiederà modifiche chiave alla finestra del momento critico dello sviluppo al centro dell'attenzione. Inoltre, il nostro protocollo non sarà adatto per esperimenti che richiedono tempi più lunghi di esposizione tossico, mentre si apre la possibilità del pathway di sviluppo alternativo, conseguente all'arresto di dauer longevi al secondo ciclo muta, che è resistente a dure condizioni²⁰. Saranno necessarie ulteriori modifiche e perfezionamenti per tempi più lunghi di esposizione attraverso integratore con una fonte di cibo che non hanno il potenziale per metabolizzare il tossico o EDC ad esempio in autoclave e. coli. In conclusione, la nostra metodologia può essere utilizzata per valutare gli effetti di varie sostanze chimiche sulla fecondità e sulla funzione di un neurone sistema endocrino nel sistema modello invertebrati elegans del c.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaCl	Fisher	7647-14-5
Peptone	Fisher	S25761B
Agar	Fisher	BP1423-500
Colesterolo	Alfa Aesar	A11470
MgSO4	Fisher	7487-88-9
CaCl2	Fisher	C79-500
KH2PO4	Fisher	P286-1
K2HPO4	Fisher	7758-11--4
KOH	Fisher	1310-58-3
Candeggina	Clorox	n/a
Na2HPO4	Fisher	BP332-500
LB	Fisher	BP1426-500
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
BPS	Sigma-Aldrich	103039-100g
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
E.coli OP50	CGC		Repository presso U of Minnesota
N2 (Wild-type C. elegans) worms	CGC		Repository presso U del Minnesota
Platino filo pick	Genesee Scientific	59-AWP
piastre di Petri	Fisher	07-202-011
Microscopio di dissezione	AmScope	SM-2TYY