Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.
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Articolo metodologico
Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello
In questo articolo
Sommario
Abstract
La formazione immagine del calcio (Ca2 +) è un potente strumento per studiare la dinamica spazio-temporale di Ca2 + segnali intracellulari nei dendriti neuronali. CA2 + fluttuazioni possono verificarsi attraverso una varietà di meccanismi intracellulari e di membrana e svolgono un ruolo cruciale nell'induzione di plasticità sinaptica e nella regolazione dell'eccitabilità dendritiche. Quindi, la possibilità di registrare diversi tipi di Ca2 + segnali in rami dentritici è preziosa per gruppi studiano come dendriti integrano informazioni. L'avvento della microscopia del due-fotone ha reso tali studi significativamente più facile risolvendo i problemi inerenti all'imaging in tessuto vivo, come ad esempio la dispersione della luce e photodamage. Inoltre, attraverso la combinazione di tecniche elettrofisiologiche convenzionale con due fotoni Ca2 + imaging, è possibile indagare locale Ca2 + le fluttuazioni nei dendriti neuronali in parallelo con le registrazioni di attività sinaptica Soma. Qui, descriviamo come utilizzare questo metodo per studiare la dinamica locale Ca2 + transitori (gatti) nei dendriti di interneuroni inibitori GABAergici. Il metodo può essere applicato anche allo studio dendritiche Ca2 + segnalazione in diversi tipi di un neurone in fettine di cervello acuto.
Introduzione
Il contributo di un neurone per attività di rete è in gran parte determinato dalla natura dinamica degli ingressi sinaptici che riceve. Tradizionalmente, il metodo predominante di caratterizzare l'attività sinaptica nei neuroni è invocata da registrazioni di intero-cellula somatica patch clamp di correnti postsinaptiche evocate da stimolazione elettrica degli assoni di passaggio. Tuttavia, unica attività delle sinapsi prossimalmente trova veritiero è segnalato in questo caso1. Inoltre, per valutare i meccanismi specifici di sinapsi, registrazioni da coppie di neuroni e da dendriti in una posizione specifica sono state utilizzate per indirizzare....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti conformemente agli orientamenti del Comitato di protezione animale Université Laval e del Consiglio canadese su Animal Care sul benessere degli animali.
1. preparazione preliminare (opzionale: preparare 1 giorno in anticipo)
- Preparare tre tipi di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) soluzione (normale, saccarosio e soluzioni di recupero, 1L; si veda tabella 1). Regolare l'osmolalità delle soluzioni a 300 ± 10 mOsm25 e raffreddare il saccarosio ACSF giù un punto vicino allo zero (0-4 ° C).
Nota: L'uso di una soluzione di taglio basso-sodio (A....
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Risultati
Utilizzando il protocollo presentato qui, abbiamo ottenuto gatti evocati mediante iniezione di corrente somatica e da stimolazione elettrica nei dendriti di oriens/alveus interneuroni nella zona CA1 dell'ippocampo. Dopo la patch di un neurone, identificato basata sulla sua forma e la posizione, abbiamo acquisito scansioni attraverso un dendrite prossimale in più punti al dato Distanze dal soma (Figura 1A). Abbiamo osservato una diminuzione dell'ampiezza dei g.......
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Discussione
Il metodo illustrato di seguito viene illustrato l'utilizzo della combinazione del due-fotone Ca2 + imaging ed elettrofisiologia di patch-clamp per lo studio dendritiche Ca2 + segnalazione nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto. Questo metodo consente per il monitoraggio di entrambi i locali Ca2 + prospetti evocati da AP elettrici di stimolazione o backpropagating in segmenti dendritiche e risposta somatica della cella. Questo lo rende un ottimo strumento per studiare come .......
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Dichiarazioni
Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio canadese istituti di ricerca sulla salute, scienze naturali e ingegneria ricerca (NSERC Discovery Grant) e la Fondazione di Savoia. OC è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato di ricerca da NSERC.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ceppo animale: Topo CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurano | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 cloridrato | Abcam | ab120337 | |
| Cloruro di calcio | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldeide in polvere, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Gluconato di potassio | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodio azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Base Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma cloridrato | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodio fosfato bibasico diidrato | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodio fosfato monobasico monoidrato | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocitina | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Idrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazina) | Abcam | ab120042 | |
Adenosina trifosfato (ATP)-Tris | Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosina (GTP)-Na+ | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 | ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Fosfocreatina di(tris) sale | Sigma-Aldrich | P1937 | |
Coniugato con streptavidina Alexa-546 | ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Capillari in vetro borosilicato patch | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Capillari in vetro borosilicato Theta | Strumento | Sutter BT-150-10 | |
P-97 Estrattore per micropipette fiammato/marrone | Strumento Sutter | ||
TCS SP5 Microscopio confocale multifotone | Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Laser multifotone zaffiro | di | ||
| acquisizione immagini LAS AF coerente Regolatore | Leica Microsystems | ||
TC-324B | Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplificatore | Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | ||
Confocal Traduttore | Siskiyou | ||
Micromanipolatore | Siskiyou | ||
pClamp Software di acquisizione dati | Molecular Devices | ||
A365 Isolatore di stimolo a corrente costante | World Precision Instruments | ||
Vibraplane Sistemi | cinetici |
Riferimenti
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997). ....
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Ristampe e permessi
