L'ovaio di Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare lo sviluppo di nicchia delle cellule staminali. Anche se i metodi per la dissezione ovaie larvale e adulte sono stati pubblicati, le dissezioni pupal ovaia richiedono tecniche differenti che non sono stati pubblicati in dettaglio. Qui descriviamo un protocollo per la dissezione, colorazione e montaggio pupale ovaie.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
A differenza di adulto Drosophila ovaie, pupale ovaie sono relativamente difficili da accedere ed esaminare a causa della loro piccola dimensione, traslucenza e che incassa all'interno di un caso pupal. La sfida di dissezione pupale ovaie si trova anche nella loro posizione fisica all'interno della pupa: le ovaie sono circondate dalle cellule di grasso corporeo all'interno dell'addome pupal, e queste cellule di grasso deve essere rimosso per consentire la macchiatura dell'anticorpo appropriato. Per superare queste sfide, questo protocollo utilizza personalizzate pipette Pasteur per estrarre le cellule del corpo di grasso dall'addome pupal. Inoltre, un coprioggetto chambered viene utilizzato al posto di un tubo del microcentrifuge durante il processo di colorazione per migliorare la visibilità delle pupe. Tuttavia, nonostante questi ed altri vantaggi degli strumenti utilizzati nel presente protocollo, corretta esecuzione di queste tecniche può coinvolgere ancora diversi giorni di pratica a causa delle piccole dimensioni delle ovaie pupale. Le tecniche descritte in questo protocollo potrebbero essere applicate agli esperimenti di corso di tempo in cui le ovaie sono analizzate nelle varie fasi di sviluppo pupa.
Introduzione
Ricerca sulle cellule staminali utilizzando Drosophila ovaie è ampiamente sviluppato dalla prima documentazione di una cellula staminale nicchia1,2,3,4. Seguendo lo sviluppo di strumenti genetici di lignaggio traccia, ovaio di Drosophila dissezioni sono stati comunemente utilizzate per lo studio di cellule staminali lignaggi e vie che regolano il mantenimento delle cellule staminali, proliferazione e destino nella nicchia delle cellule staminali di segnalazione. Conoscenza di queste vie di segnalazione può produrre intuizioni potenziali cause di tumori che hanno origine da cellule staminali aberrante attività5,6,7. Inoltre recentemente è stato dimostrato che le cellule staminali somatiche nell'ovaio di Drosophila , conosciuto come le cellule staminali del follicolo (FSCs), fortemente assomigliano cellule staminali intestinale dei mammiferi in molti aspetti della loro organizzazione8. Per questo motivo, Drosophila ovaie sono un sistema di modello altamente utile per studiare il comportamento delle cellule staminali.
Mentre le ovaie larvale e adulte offrono indizi per lo sviluppo iniziale della cellula formativa e l'organizzazione finale della cellula formativa nella nicchia, rispettivamente, l'ovaio pupal è una struttura intermedia in cui la linea germinale e cellule somatiche riorganizzare e stabilire la loro identità 9 , 10. anche se parecchi studi hanno esaminato gli aspetti dello sviluppo del tessuto nell'ovaia pupal10,11,12,13, domande rimangono per quanto riguarda la differenziazione e l'organizzazione spaziale di tipi di cellule ovariche durante lo sviluppo pupa. In particolare, la specifica del FSCs si verifica durante questo periodo. Questo protocollo descrive un metodo per la dissezione e la macchiatura pupale ovaie a intervalli di tempo desiderato — una tecnica che può essere utilizzata in esperimenti di corso di tempo che analizzano lo sviluppo pupale ovaia in dettaglio dalla larvale alla fase adulta.
Per tenere conto le piccole dimensioni, traslucenza e inaccessibilità dell'ovaia pupal all'interno dell'addome pupal, questo protocollo utilizza strumenti come una pipetta di Pasteur su misura con la punta sottile per rimuovere il tessuto addominale grasso corporeo che ostruisce l'accesso dell'anticorpo per il ovaie. Un coprioggetto chiaro, chambered utilizzato durante l'anticorpo che macchia offre una maggiore visibilità delle pupe e una piattaforma più delicata per oscillare le ovaie su un "Nutator". Basato su un protocollo per le dissezioni dell'ovaia larvale di Maimon e Gilboa14, una concentrazione relativamente alta di Triton X-100 è stata impiegata nelle fasi iniziali della procedura di colorazione per massimizzare l'accesso di permeabilizzazione e anticorpo di membrana cellulare per il cellule ovariche.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. EggLaying
- Combinare circa uomo dieci e quindici femmina adulto drosofila mosche del genotipo desiderato in un flaconcino di normali alimenti ricchi di volare, completati con lievito. Per evitare sovraffollamento il flaconcino, consentire le femmine accoppiate a deporre le uova per non più di 2 – 4 h14.
- Trasferire gli adulti dal flaconcino in un flacone nuovo toccando il flaconcino di apertura contro una fiala diversa con alimento. Lasciare le uova a sviluppare in larve a temperatura ambiente per 3 – 4 giorni.
2. selezione di femminile larve
- Utilizzando un pennello sottile umido con setole morbide, fanno un movimento di rotolamento con il pennello lungo la parete del flaconcino per trasferire un bicchiere ben riempito fino all'orlo con tampone fosfato salino (PBS): 1x errante terza-instar larve dal flaconcino. Lavare i residui di cibo fuori le larve di trasferirli ad un altro bene riempito con PBS 1X.
- Separare le larve di sesso maschile e femminile usando il forcipe. Identificare le larve maschile da un paio di testicoli grandi, rotondi e traslucidi incorporato nel corpo di grasso sulla parte laterale del corpo circa due-terzi giù dalla sua estremità anteriore15. Le larve femminile sono mediamente più grandi, meno traslucido rispetto ai maschi e hanno gonadi molto più piccole che sono più difficili da rilevare.
- Selezionare contro larve maschile per raccogliere le larve femminile. Raccogliere almeno dieci femmine dal pozzo. Inserire le larve femminile in un separato ben riempito con PBS 1X.
- Forcipe di uso per trasferire le larve femminile delicatamente in un nuovo flacone di cibo fresco volo completati con lievito.
- Collocare il flaconcino con le larve femminili in un luogo buio per facilitare pupariation16. Durante tutta la giornata, monitorare le larve per pupariation. Come ogni larva immobilizza e si sviluppa in un prepupa, la prepupa contro il flaconcino del cerchio e registrare il tempo approssimativo quando si forma prima in un prepupa. La protrusione di spiracoli anteriori e la temporizzazione del pupario formazione17individuare membranose. Consentire la membranose a sviluppare fino al punto di tempo desiderato (misurato in ore dopo la formazione del pupario, APF).
Nota: Tutti gli animali che subiscono pupario formazione entro un intervallo di circa 10 h possono essere considerato un prepupa. Stadio pupale inizia circa 12 h dopo la formazione del pupario dopo un molt interna ha avuto luogo.
3. preparazione pupe per la macchiatura dell'anticorpo
-
Formare una pipetta di vetro sottile per essere utilizzato nei passaggi successivi per sgombrare il corpo grasso pupal.
- Fondere il vetro in punta di una pipetta Pasteur sopra un bruciatore di Bunsen. Come il vetro si scioglie, è possibile utilizzare pinze per tirare la punta orizzontalmente lontano dal resto della pipetta per formare una punta più sottile.
- Dopo il raffreddamento, rompere una piccola porzione della punta della pipetta per formare un'apertura circolare ordinata. Collegare una lampadina a altra estremità della pipetta.
- Caricare la pipetta con PBS 1X.
- Per raccogliere le pupe, che sono incollate alla parete del flaconcino, applicare una piccola goccia d'acqua lungo la zona di contatto tra pupa e flaconcino. Attendere 1-2 min per lasciare che la proteina colla sciogliere prima di sollevare delicatamente la pupa fuori il muro con un pennello umido. Trasferire la pupa per un bicchiere ben riempita con 1x PBS. Dedicare un singolo pozzo a pupa per evitare il sovraffollamento del pozzo.
- Mentre afferra l'estremità posteriore della pupa con una coppia di pinze, strappare accuratamente la porzione anteriore del caso pupal con un'altra coppia fino a quando la testa della pupa è visibile.
- Afferrare la punta anteriore-la maggior parte della testa pupal con pinze e tirare delicatamente la pupa fuori del suo caso pupal.
Nota: Una parte del corpo grasso può fuoriuscire durante questo processo. - Separare e scartare la metà anteriore della pupa della metà posteriore fino a quando rimane solo il sacco addominale.
-
Estrarre le cellule di grasso corpo dalla sacca addominale.
- Afferrare il sacco addominale contro il fondo del pozzo con la pinzetta in una mano mentre si tiene la pipetta di vetro sottile riempita con PBS 1X in un'altra mano.
- Mirare il puntale sottile verso l'apertura del sacco e lentamente dispensare 1X PBS nell'addome per lavare via le cellule di grasso corporeo che circondano le ovaie pupale.
Nota: Le ovaie sono un paio di strutture piccole, traslucidi, striati e oblunghe che deve rimanere all'interno del sacco addominale. - Lavare via che il grasso corporeo cellule fino a quando almeno i due terzi del corpo grasso è andato o fino a quando le ovaie sono visibili vicino all'apertura del sacco addominale. È molto importante eseguire questo passaggio lentamente per non lavare le ovaie fuori l'addome per caso.
- Esaminare il pozzo per verificare se le ovaie hanno rovesciato fuori durante il lavaggio delle cellule di grasso corporeo. Se le ovaie non sono visibili all'interno del pozzo, essi dovrebbero rimasto nell'addome. Se le ovaie sono usciti, posizionare una nuova pupa nel pozzo e ripetere questo passaggio.
- Trasferire l'addome in una camera di coprioggetto chiaro piena di buffer di fissazione (1x PBS, paraformaldeide al 4%) e mettere il coperchio sulla parte superiore. Per garantire un numero sufficiente di ovaie sopportare la colorazione e il processo di montaggio, sezionare le ovaie più del necessario.
Attenzione: Il buffer di fissazione contiene paraformaldeide che è tossico. Si prega di indossare adeguate protezioni quali guanti, occhiali di sicurezza, ecc.
4. Immunohistochemistry
- Durante tutto il processo di colorazione, è necessario utilizzare pinze per spingere delicatamente giù qualsiasi ovaie galleggiante sul fondo del pozzo vetro di copertura per garantire che le ovaie sono completamente immersi nella soluzione di anticorpo.
- Posto di strisce di nastro biadesivo sulla superficie piana di un Nutator e quindi posizionare il coprioggetto chambered sulla superficie adesiva.
- Incubare le ovaie nel buffer di fissazione dal passaggio 3,7 per 15 min a temperatura ambiente.
- Sciacquare le ovaie tre volte in PBS 1x con 1% Triton X-100 per 5, 10 e 45 min (1h in totale), rispettivamente, per consentire la permeabilizzazione approfondita.
- Bloccare le ovaie in siero di capra normale 10% in PBS 1x con 0,5% Triton X-100 per 30 min.
- Incubare le ovaie durante la notte a 600 µ l di anticorpo primario di scelta diluito alla concentrazione appropriata in PBS 1x con 0,5% Triton X-100 a 4 ° C.
- Sciacquare le ovaie tre volte per 5 min in 1X PBS con 0,5% Triton X-100.
- Incubare le ovaie per 2 h a 600 µ l di anticorpo secondario di scelta diluito alla concentrazione appropriata in PBS 1x con 0,5% Triton X-100 a temperatura ambiente.
- Sciacquare le ovaie due volte per 5 min in 1X PBS con 0,5% Triton X-100 e una volta per 5 min in 1X PBS.
5. di dissezione e montaggio Pupal ovaie
- Mettere una piccola goccia di PBS 1X su un vetrino da microscopio. Forcipe di uso per trasferire il sacco addominale dal coprioggetto chambered a un bicchiere ben riempito con PBS 1X. Dedicare un singolo pozzo a pupa per evitare il sovraffollamento del pozzo.
- Lacerare il sacco addominale e qualsiasi corpo grasso restante con il forcipe.
Nota: Le ovaie, che sono un paio di strutture piccole, traslucide, striati e oblunghe, dovrebbero essere visibile all'interno del pozzo. Le ovaie sono spesso strettamente circondate dal corpo grasso, quindi è importante assicurarsi che tutti i grassi corpo è lacerato accuratamente apart. - Trasferire le ovaie dal pozzo nella goccia di 1X PBS sul microscopio slide afferrando il centro delle ovaie tra le punte della pinza. È molto importante utilizzare una presa salda senza strizzare le ovaie così da non perdere o distruggerli durante il trasferimento. Aggiungere poche gocce di PBS 1x alla diapositiva quando la soluzione si asciuga nel tempo.
- Una volta che tutte le ovaie sono state sezionate e trasferite al microscopio, dispensare 40 µ l di liquido di montaggio su di un vetrino coprioggetti 22 x 22 mm e posto il vetrino coprioggetto delicatamente sopra le ovaie. Lasciate che il pernottamento asciutto diapositiva prima di formazione immagine.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Corretta esecuzione di questa procedura dovrebbe provocare macchiatura dell'anticorpo chiaro che rivela la struttura e l'organizzazione cellulare di ovaio pupal di Drosophila . Immunohistochemistry descritte in questo protocollo può essere utilizzato per identificare tipi cellulari comunemente macchiati nelle ovaie larvale e adulte. Cellule del gambo pupal derivato da sciamano cellule18 (delineato da Fasciclin III in bianco) sono mostrati nella
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il passo più critico e difficile di questo protocollo prevede la preparazione delle ovaie pupale prima della fissazione. Per garantire che le ovaie, piccole e sepolte dalle cellule di grasso corporeo all'interno dell'addome pupal, sono macchiate sufficientemente con gli anticorpi, è importante non solo strappare una grande apertura nel sacco addominale con il forcipe, ma anche estrarre le cellule di grasso corporeo che ostacolano la ovaie dagli anticorpi. Corretta esecuzione di questo passaggio richiede l'applicazione di...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (RO1 GM079351 di D.K.). Ringraziamo Dorothea Godt per i suoi consigli utili su dissezioni dell'ovaia pupal basato sul suo protocollo originale. Ringraziamo anche Amy Reilein per la sua assistenza e commenti sul manoscritto.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Pincipe, biologia | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Coverglass a camera | Thermo Fisher Scientific 155383 | ||
| Microscopio per dissezione | Nikon | SMZ-10A | |
| Microscopio confocale | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Software | di analisi Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Piastre spot in vetro a depressione | Pyrex | 7220-85 | |
| Pipetta Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Lampadina pipetta Pasteur | Fornitori vari Bruciatore | ||
| Bunsen | Fornitori vari Vetrini | ||
| microscopio smerigliato premium Fisherfinest Thermo | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Vetrini coprioggetti in vetro 22 x 22 mm No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Nastro biadesivo | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Pennello fine #0, #3-#5 | Vari fornitori | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contiene p20, p200, p1000 pipettatori |
| 16% Paraformaldeide Microscopia | Elettronica Scienze | 15710 | Diluire al 4% di paraformaldeide in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Diluire a 1x PBS |
| Siero di capra normale | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Diluire al 10% di siero di capra normale in PBST con concentrazione |
| di Triton dello 0,5%Anticorpi primari (nel protocollo: 7G10 anti-Fasciclin III diluito 1:250, anti-fosfoistone H3 di coniglio diluito 1:1000) | Fornitori vari (nel protocollo: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Diluito in PBST con una concentrazione di Tritoni dello 0,5% | |
| Anticorpi secondari (nel protocollo: Alexa-546, siero anti-coniglio coniugato FITC) | Fornitori vari (nel protocollo: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Diluire in PBST con concentrazione di Triton allo 0,5% | |
| Fiale per mosche | Denville Scientific | V9406 | |
| Batuffoli di cotone, per fiale larghe | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Lievito, panettieri Essiccato | Active MP Biomedicals | 101400 | |
| Cibo per mosche | Prodotto in laboratorio | Miscela di acqua, lievito di birra, farina di mais, melassa, agar, EtOH, penicillina, metil4-idrobenzoato e acido propionico | |
| Mosche maschi e femmine Drosophila (genotipo utilizzato nel protocollo: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Centro di stoccaggio |
Riferimenti
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537(2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52(2006).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
