Rilevamento altamente sensibile e quantitativo delle proteine e loro isoforme dal metodo di messa a fuoco isoelettrica capillare

Summary

Messa a fuoco isoelettrica capillare è una tecnica di basati su anticorpi, ultrasensibile, alta velocità di trasmissione, consentendo la dettagliata caratterizzazione delle proteine e loro isoforme da campioni biologici estremamente piccoli. Di seguito viene descritto un protocollo per il rilevamento e la quantificazione delle proteine specifiche e loro isoforme in modo automatizzato e robotizzato.

Abstract

Immunoblotting è diventata una tecnica di routine in molti laboratori per la caratterizzazione di proteine da campioni biologici. Il seguente protocollo fornisce una strategia alternativa, capillare isoelettrico (cIEF), di messa a fuoco con molti vantaggi rispetto ai convenzionali immunoblotting. Si tratta di un metodo basati su anticorpi, automatico, rapido e quantitativo, in cui una procedura completa di macchiante occidentale si svolge all'interno di un capillare ultrasottile. Questa tecnica non richiede un gel per trasferire ad una membrana, rimozione delle macchie, o pellicole, che sono in genere necessari per immunoblotting convenzionali a raggi x. Qui, le proteine sono separate secondo la loro carica (punto isoelettrico; pI), utilizzando meno di un microlitro (400 nL) di lisato proteico totale. Dopo l'elettroforesi, proteine sono immobilizzate sulle pareti dei capillari di trattamento della luce ultravioletta, seguita da primario e secondario (perossidasi di rafano (HRP) coniugato) incubazione dell'anticorpo, cui l'associazione viene rilevato attraverso funzionalità migliorata chemiluminescenza (ECL), generando un segnale luminoso che può essere catturato e registrato da una telecamera di charge coupled device (CCD). L'immagine digitale può essere analizzato e quantificati (area del picco) utilizzando il software. Questa procedura di throughput elevato può gestire 96 campioni contemporaneamente; è altamente sensibile, con rilevazione di proteine nella gamma picogrammo; e produce risultati altamente riproducibili a causa di automazione. Tutti questi aspetti sono estremamente utili quando la quantità di campioni (ad esempio, campioni di tessuto e biopsie) è un fattore limitante. La tecnica ha anche applicazioni più ampie, tra cui lo screening di farmaci o anticorpi, scoperta del biomarcatore e scopi diagnostici.

Introduction

Messa a fuoco isoelettrica capillare (cIEF) è un test immunologico automatizzato, basato su capillare che risolve le proteine in base al loro costo^1,2,3. È altamente riproducibile e in grado di risolvere le proteine e loro isoforme traduzionalmente modificate rapidamente e quantitativamente. Presenta un'alternativa ai metodi convenzionali come macchiare occidentale. Mentre macchiare occidentale è molto buono per confermare la presenza di abbondanti proteine in campioni facilmente accessibili; variabilità, il consumo di tempo e tutti i presenti la quantificazione accurata sfid....

Protocol

1. cultura, stimolazione e lisi delle cellule

Nota: Questo metodo può essere utilizzato con molti tipi di cellule. Per illustrare il metodo, è descritto un esempio di utilizzo di cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs).

1. Cultura di HUVECs il rivestite di gelatina, di 10cm Petri in medio basale delle cellule endoteliali con il completamento appropriato (Vedi Tabella materiali) e contenente anche 5% FCS, fattore di crescita epidermico (5 ng/mL), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF: 0,5 ng/mL), base FGF (10 ng/mL), fattore di crescita insulino-simile (20 ng/mL), idrocortisone (0,2 µ g/mL) ed ....

Results

Design di un nuovo dosaggio: Un layout di piastra di dosaggio è mostrato in Figura 1A. Al massimo, 96 pozzetti possono essere utilizzati dalla piastra 384 pozzetti in blocchi di 12 pozzi per ogni condizione (anticorpo). Ogni blocco di 12 pozzi può iniziare da A1-A12 o A13-A24. Righe di colore codificate permettono di distinguere i campioni o i reagenti uno da altro. Nel modello di analisi (Figura 1B), le informaz.......

Discussion

Sensibilità e risoluzione delle proteine sono fondamentali per la ricerca di proteomica su campioni biologici. C'è grande valore nell'essere in grado di rilevare le proteine che sono presenti in piccole quantità nelle cellule. cIEF in grado di offrire una migliore sensibilità e risoluzione per la rilevazione di proteine e loro isoforme⁴.

Questa tecnologia è stata utilizzata con successo in molti proteomica research report^5,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premiscela G2, pH 5– 8 gradienti di separazione (nidificati), pH 2– 4 tappi	ProteinSimple	040-972	Premiscela di anfoliti
Miscela di inibitori del DMSO	ProteinSimple	040-510	Inibitori della fosfatasi; per diluizione cIEF 1:50 utilizzata
Miscela di inibitori acquosi	ProteinSimple	040-482	Inibitore della proteasi; per diluizione cIEF 1:25 utilizzata
scala standard pI 3	ProteinSimple	040-646	Per diluizione cIEF 1:60 utilizzata
Campione diluente	ProteinSimple	040-649
Diluente per anticorpi	ProteinSimple	040-309
Concentrato di lavaggio	ProteinSimple	041-108
Ricarica anolito	ProteinSimple	040-337
Ricarica catolita	ProteinSimple	040-338
Perossido XDR	ProteinSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Tampone di lisi Bicine/CHAPS	ProteinSimple	040-764
Capillari-Separazione di carica (1 confezione) per	ProteinSimple	CBS700
Kit piastra/coperchio per saggi	ProteinSimple	040-663
Perossidasi-AffiniIgG anti-coniglio puro asino (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	Per cIEF usato (1: 300)
Perossidasi-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	Per cIEF utilizzato (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Anticorpo	primario Segnalazione cellulare	9101	Per cIEF utilizzato (1: 50)
Pan Erk Anticorpo	primario Segnalazione cellulare	9102	Per cIEF utilizzato (1: 100)
Software	bussola ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	& nbsp; C-22221	Terreno basale delle cellule
endoteliali Terreno di crescita delle cellule endoteliali MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Integrazione a MV2 sopra
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Fattore di crescita insulino-simile
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein Kit di analisi	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gel Thermo	Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF membrana	Millipore	IPVH00010
Vortexer per provette per microfughe
pipettatori per centrifuga
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