Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e la quantificazione del Plasmodium falciparum in acquosi globuli rossi infetti utilizzando un spettrometro a infrarossi riflessione totale attenuata e analisi multivariata dei dati.
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Articolo metodologico
Rilevazione e quantificazione del Plasmodium falciparum in acquoso globuli rossi da attenuato spettroscopia infrarossa totale riflessione e l'analisi multivariata dei dati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dimostriamo un metodo di quantificazione e individuazione di parassiti in acquosa di globuli rossi (RBCs) utilizzando un semplice benchtop attenuato totale riflessione Fourier Transform spettrometro a infrarossi (ATR-FTIR) in combinazione con l'analisi multivariata dei dati ( MVDA). 3 7 p. falciparum sono stati coltivati a parassiti fase 10% parassitemia anello e utilizzato a picco i globuli rossi del donatore fresco isolato per creare una diluizione serie tra 0 – 1%. 10 µ l di ciascun campione sono stati collocati al centro della finestra di diamante ATR per acquisire lo spettro. I dati di esempio è stati trattati per migliorare il rapporto segnale-rumore e rimuovere il contributo di acqua, e quindi la derivata seconda è stata applicata per risolvere caratteristiche spettrali. I dati sono stati quindi analizzati utilizzando due tipi di MVDA: primo Principal Component Analysis (PCA) per determinare eventuali valori anomali e quindi regressione di minimi quadrati parziali (PLS-R) per compilare il modello di quantificazione.
Introduzione
La malaria è tra le più devastanti malattie del nostro tempo; oltre la metà della popolazione vive a rischio nelle regioni endemiche ed esso sproporzionatamente opprime il povero1,2,3,4. Gran parte del problema è i portatori asintomatici e primi pazienti di stadio che fungono da serbatoi per zanzare vettori5, causando picchi di infezione durante stagioni umide e permettendogli di persistere nelle comunità. La malaria è causata da parassiti Plasmodium cinque, il più mortale di cui è p. falciparum che ....
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Protocollo
Consultare appropriato Material Safety Data Sheets (MSDS) e cercare la formazione adeguata di livello 2 di biosicurezza (BSL-2). Tutti i passaggi di coltura devono essere fatto in un cabinet di BSL-2 usando una tecnica asettica, il che significa che c'è un rischio di esposizione a radiazioni UV nocive da operazioni di decontaminazione, punture accidentali ed esposizione potenziale biologico e infezione se la cultura di parassita entra tutte le lesioni. Inoltre, è un potenziale rischio sangue stock da banche del sangue è solo proiettato per alcune malattie e il potenziale per la diffusione di malattie a carico del sangue. Cercare aiuto medico immediato nell'avvenimento....
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Risultati
Trama di minimi quadrati parziali (PLS-R) e un vettore di regressione associato, Figura 1a e 1b rispettivamente, mostrano che il segnale da parassiti sono abbastanza distinta da globuli rossi che servono per formare una regressione lineare modello da utilizzare per la previsione dei parassiti in insiemi di dati futuri.
Un robusto modello lineare PLS-R è stato generato con un valore .......
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Discussione
Modello: PLS-R è un metodo multivariato supervisione che trova una relazione lineare, Y = bX + E, tra le variabili predittive X (qui, l'assorbanza a ciascun numero d'onda) e un continuo variabile Y (qui, il livello di parassitemia). In breve, il modello combina le variabili in X per creare un nuovo insieme di variabili latenti (LVs) che catturano la varianza su X correlato con Y e calcola un vettore di regressione (b) che moltiplicato per un nuovo risultati di spettro nella stima del valore y. La forza del modello può es.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Finanziamenti agli autori è stato fornito dall'Australian Research Council (futuro Fellowship FT120100926 a BRW), National Health and Medical Research Council of Australia (programma grant e Senior Research Fellowship di JGB; Inizio carriera Fellowships JSR; Infrastruttura per la ricerca istituti Grant Scheme supporto all'Istituto Burnet), e supporta l'infrastruttura operativa del governo di Victorian State Grant all'Istituto di Burnet. Riconosciamo il signor Finlay Shanks per sostegno strumentale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sangue del donatore | - | - | Deve essere raccolto da un medico qualificato |
| Sangue di riserva | Croce Rossa Australiana' | - | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet | Institute-Laboratory | ceppo selvaggio equivalente |
| RPMI-1640 media con L-hepes senza bicarbonato di sodio | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquotare in provette da 50 mL e conservare in congelatore |
| Bicarbonato di sodio | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitolo | Sigma Aldrich | S1876 | Deve essere filtrato prima dell'uso in coltura |
| Provette per la raccolta del sangue (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Olio da immersione | Thermofisher | M3004 | |
| Piastre per coltura da 50 mL | Puntali per pipette Falcon | 353025 | |
| 25mL | Falcon | 357515 | |
| Puntali per pipette da 10mL | Falcon | 357530 | |
| Vetrini per microscopio | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Provette da centrifuga 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Pipettatore automatizzato | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuga | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Incubatori a CO2 a calore diretto | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Microscopio binoculare | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | Al momento dell'acquisto assicurarsi che la lente 100x sia un olio lente a immersione |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Assicurati di richiedere l'attacco "Eco-ATR" al momento dell'acquisto |
| software di analisi dati multivariato | Matlab | Mathworks Inc | |
| The Unscrambler X | CAMO | Software di analisi dati multivariato | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI per Matlab |
Riferimenti
- Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).
- World Health Organization. World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W. Chapter 105. Manual....
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Ristampe e permessi
