La microscopia basato su metodi per la valutazione della migrazione delle cellule epiteliali durante In Vitro la guarigione arrotolata

Summary

Questo manoscritto descrive come incisione-come le lesioni fatta su monostrati di cellule epiteliali in coltura convenientemente modello ferita curativa in vitro, che consente per l'imaging di confocal o microscopia di esame del laser, e che in grado di fornire alta qualità dati quantitativi e qualitativi per studiare il comportamento delle cellule sia i meccanismi coinvolti nella migrazione.

Abstract

Migrazione delle cellule è un aspetto obbligatorio per la guarigione della ferita. Creazione artificiale ferite su modelli animali di ricerca spesso risultati in costose e complicate procedure sperimentali, mentre potenzialmente manca di precisione. Coltura in vitro di linee cellulari epiteliali fornisce una piattaforma adatta per la ricerca il comportamento migratorio delle cellule nella guarigione delle ferite e l'impatto dei trattamenti su queste cellule. La fisiologia delle cellule epiteliali è spesso studiata in condizioni di non-confluenti; Tuttavia, questo approccio non analoghe condizioni di guarigione naturale. Compromettere l'integrità dell'epitelio con mezzi meccanici genera un modello realistico, ma può ostacolare l'applicazione delle tecniche molecolari. Di conseguenza, tecniche di microscopia di base sono ottimali per lo studio della migrazione delle cellule epiteliali in vitro. Qui dettagliamo due metodi specifici, il dosaggio di gratta e Vinci di ferita artificiale e analisi anteriore della migrazione artificiale, che può ottenere dati quantitativi e qualitativi, rispettivamente, sulle prestazioni migratoria delle cellule epiteliali.

Introduction

Migrazione delle cellule è necessaria per la guarigione delle ferite, come è responsabile per la chiusura definitiva del divario epiteliale e restauro del perturbato superficie¹. L'esecuzione di ferite artificiali nei modelli animali consente per la replica di questo complesso processo in vicino a condizioni fisiologiche². Tuttavia, questo approccio comporta spesso costose e complicate procedure sperimentali, che potenzialmente mancano di precisione per lo studio di processi distinti, a causa della natura complessa del processo di guarigione.

Coltura in vitro di linee cellulari epitel....

Protocol

1. artificiale ferita Scratch test per studi quantitativi

1. Preparazione dello strato monomolecolare delle cellule
   1. Lavorando in condizioni sterili, di semi e far crescere cellule epiteliali Mv1Lu o HaCaT in matracci di cultura utilizzando medium siero-completato. Aggiornamento media una volta ogni 24-48 h. Dopo le cellule raggiungono 80% confluenza, staccare le cellule utilizzando un metodo appropriato, cioè, trypsinization⁹.
      Nota: Mv1Lu e HaCaT linee cellulari epiteliali sono coltivate utilizzando il terreno di coltura EMEM e DEMEM, rispettivamente, completati con 2 mM L-Glutammina e incubate ....

Results

Il dosaggio zero ferita artificiale per studi quantitativi: valutazione del fattore di crescita epidermico (EGF) Promozione della migrazione:

L'EGF è un ben noto induttore della proliferazione di cellule epiteliali e migrazione e così un controllo positivo per quantificare la promozione di migrazione. Monostrati di cellule umane Mv1Lu e HaCaT sono stati utilizzati nelle analisi gratta e Vinci della ferita e immagini di pre-trattame.......

Discussion

Alla pelle o rottura della membrana mucosa, la funzione della barriera viene ripristinata dalle azioni di numerosi tipi di cellule, tra cui fibroblasti o cellule epiteliali ed immuni. Congiuntamente, queste cellule subiscono un complesso processo che coinvolge l'apoptosi, proliferazione, differenziazione e soprattutto, dei fibroblasti ed epiteliale delle cellule migrazione, che è il meccanismo ultimo responsabile per il restauro del tessuto perturbato e la chiusura del divario epiteliale superficiale¹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, France	L0102-500	Supplemento opzionale del 10 % FBS
Eagles' s Terreno essenziale minimo (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	Integratore opzionale di FBS al 10
L-Glutammina	Lonza	BE17-605E	Utilizzare a 2 mM
Siero fetale bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA	DE17603A
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T4049	Diluire a seconda dei casi
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9155
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) (10x)	Gibco by Life Technologies	14200-067	Diluire a 1x piastre di
coltura a 24 pozzetti	BD FALCON//SARSTED	734-0020
Piastre di coltura a 6 pozzetti	SARSTEDT	83-3920
Fattore di crescita epidermico (EGF)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	E9644	Usato 10 ng/mL
Vetro di copertura rotondo	MENZEL-GLÄ SER	MENZCB00120RA020	BREVE PROFONDITÀ DI CAMPO Lama di
rasoio rinforzata n. 743	Martor (tramite VWR)	MARO743.50
200 µ l puntali per pipette sterili per aerosol	VWR	732-0541
20 &; micro; l puntali sterili per pipette per aerosol	VWR	732-0528
Microscopio a contrasto di fase accoppiato a fotocamera digitale	Motic Spagna	Fotocamera Moticam 2300 3,0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Microscopio confocale	ZEISS Microimaging, Germania	LSM 510 META
10 cm Piatto di coltura	BD FALCON	353003
Coniglio policlonale anti c-Jun Anticorpo	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	Usato 1:100
Anti-coniglio IgG (capra policlonale) AF 488	Invitrogen	A11008	Usato 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	Usato 1:1000
Alexa Fluor 594 falloidina (in metanolo) (rosso)	Invitrogen	A12381	Usato 1:100
Siero bovino Albumina Santa	Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
Latte scremato	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, USA	Versione 1.50i
Zen LSM 510 Software di elaborazione delle immagini	ZEISS Microimaging, Germania	Versione 5.0 SP 1.1