Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly

Stéphane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

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Articolo metodologico

Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly

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DOI:

10.3791/56812

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3 gennaio 2018

Stéphane Isabettini¹ , Mirjam E. Baumgartner¹ , Peter Fischer¹ , Erich J. Windhab¹ , Marianne Liebi² , Simon Kuster¹

¹Laboratory of Food Process Engineering, ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory, Lund University

In questo articolo

Sommario

Procedure di fabbricazione per lo ione altamente magneticamente reattivo dei lantanidi chelanti polimolecolari assembly sono presentate. La risposta magnetica è dettata dalle dimensioni di montaggio, che sono su misura per estrusione attraverso membrane nanopore. Alignability magnetica indotta da temperatura cambiamenti strutturali e le assemblee sono monitorati da misurazioni di birifrangenza, una tecnica gratuita per risonanza magnetica nucleare e lo scattering di neutroni piccolo angolo.

Abstract

Bicelles sono assembly sintonizzabile discoidale polimolecolari formato da una grande varietà di miscele del lipido. Le applicazioni spaziano da studi strutturali di proteine di membrana di risonanza magnetica nucleare (NMR) agli sviluppi nanotecnologici, compresa la formazione di gel otticamente attivi e magneticamente commutabile. Tali tecnologie richiedono elevato controllo delle dimensioni di montaggio, risposta magnetica e resistenza termica. Miscele di 1,2-dimiristoil -sn- glicero-3-fosfocolina (DMPC) e suoi ioni lantanidi (Ln^{3 +}) chelanti coniugato del fosfolipide, 1,2-dimiristoil -sn- glicero-3-fosfo-etanolamina-dietilenico triaminepentaacetate ( DMPE-DTPA), assemblare in assembly altamente magneticamente reattivo ad esempio DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) bicelles. Introduzione di colesterolo (Chol-OH) e steroidi derivati in doppio strato si traduce in un altro insieme di assembly che offre proprietà fisico-chimiche uniche. Per una composizione lipidica dato, il alignability magnetico è proporzionale alla dimensione di bicelle. La complessazione di Ln^{3 +} si traduce in risposte magnetiche senza precedenti in termini di direzione sia di grandezza e di allineamento. Il crollo di termo-reversibile del disco-come le strutture in vescicole su riscaldamento permette di sartoria di dimensioni degli assiemi per estrusione attraverso filtri a membrana con pori definiti. Il bicelles magneticamente allineabile vengono rigenerate mediante raffreddamento a 5 ° C, con conseguente montaggio dimensioni definite da precursori della vescicola. Qui, questa procedura di montaggio è spiegata e la alignability magnetica delle assemblee è quantificata mediante misure di birifrangenza sotto un 5,5 campo magnetico T. Il segnale di birifrangenza, proveniente dal bilayer del fosfolipide, ulteriormente consente il monitoraggio di polimolecolari cambiamenti che si verificano in doppio strato. Questa semplice tecnica è complementare agli esperimenti NMR che sono comunemente impiegati per caratterizzare bicelles.

Introduzione

Bicelles sono assembly polimolecolari discoidale ottenuti dalle numerose miscele di lipidi. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ essi sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione strutturale di biomolecole di membrana tramite spettroscopia NMR. ⁶ ^, ⁷ tuttavia, i recenti sforzi mirano a espandere il campo delle possibili applicazioni. ⁵ ^, ⁸ ^, ⁹ il sistema di bicelle più studiato è composto da una miscela di 1,2-dimiristoil -sn- glicero-3-fosfocolina (DMPC), che costituiscono la parte piana dell'Assemblea e 1,2-dihexanoyl -sn- glicero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolipide che copre il bordo. ¹ ^, ² ^, ³ la geometria molecolare dei fosfolipidi che compongono il bilayer dettare l'architettura della struttura polimolecolari auto-assemblati. ⁴ ^, ⁵ sostituzione DHPC con DMPE-DTPA genera sistemi altamente magneticamente reattivo e sintonizzabile bicelle. ¹⁰ ^, ¹¹ DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) bicelles associare con molti più ioni paramagnetici lantanidi (Ln^{3 +}) sulla superficie di doppio strato, conseguente a una risposta magnetica migliorata. ¹⁰ inoltre, sostituendo le molecole solubili in acqua di DHPC con^{3 +} consente di DMPE-DTPA/Ln la formazione di diluizione-resistente bicelles. ¹¹

La alignability magnetica di planare polimolecolari assembly è dettata dalla loro energia nel complesso magnetico,

figure-introduction-1 (1)

dove B è l'intensità del campo magnetico, figure-introduction-2 il magnetico costante, n il numero di aggregazione e figure-introduction-3 l'anisotropia diamagnetica molecolare suscettibilità dei lipidi che compongono il bilayer. Di conseguenza, la risposta di DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles ai campi magnetici è su misura dal loro formato (aggregazione numero n) e il Δχ di anisotropia diamagnetica molecolare di suscettibilità. Quest'ultima è realizzata prontamente modificando la natura del chelato Ln^{3 +}. ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ Introduzione colesterolo (Chol-OH) o altri derivati steroidi in doppio strato offre la possibilità di tuning sia il numero n di aggregato e la Δχ di suscettività magnetica degli assembly. ¹¹ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ per una composizione lipidica determinato, grandi assemblee contengono più lipidi capaci di contribuire alla E_mag (più grande aggregazione numero n), con conseguente più regolabile in specie. La dimensione del DMPC/DHPC bicelles, ad esempio, convenzionalmente è controllata tramite l'ottimizzazione la composizione lipidica rapporto totale della concentrazione di o. ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² anche se questo è possibile in DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, loro trasformazione termo-reversibile da bicelle a vescicole su riscaldamento offerte aggiunto opzioni di sartoriale. Meccanica significa come estrusione attraverso filtri a membrana permette di modellare delle vescicole. Il bicelles magneticamente allineabile vengono rigenerate sul raffreddamento a 5 ° C e le loro dimensioni sono dettate da precursori della vescicola. ¹¹ qui, ci concentriamo sul potenziale delle procedure di fabbricazione meccanica con DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) come sistemi di riferimento. Il processo funziona Analogamente quando si lavora con altri Ln^{3 +} Tm^{3 +}. L'ampia gamma di possibilità offerte da queste tecniche sono evidenziati in Figura 1 e ampiamente discussa altrove. ²³

figure-introduction-4
Figura 1: Panoramica schematica delle procedure di fabbricazione possibile. Studiato magneticamente allineabile Ln^{3 +} chelante polimolecolari assembly sono composti da entrambi DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5). Il film lipidico asciutto è idratato con un tampone fosfato 50 mM ad un valore di pH di 7,4 e la concentrazione dei lipidi totale è di 15 mM. Un'efficace idratazione del film lipidico richiede sia congelare scongelamento cicli (FT) o riscaldamento e raffreddamento cicli (H & C). H & C cicli sono necessari per rigenerare i campioni dopo il gelo ultimo passaggio di scioglimento o per rigenerare i campioni tenuti congelati per un periodo prolungato di tempo, se devono essere usati senza ulteriore estrusione. Questi passaggi sono ampiamente discussa da Isabettini et al. ²³ al massimo allineabile polimolecolari assembly vengono raggiunti, offrendo architetture di assembly diverso sulla base della composizione lipidica. La dimensione di bicelle e la alignability magnetica è sintonizzabile per estrusione (Ext) attraverso filtri a membrana nanopore. L'allineamento presentato fattori A_f sono stati computati da modelli di dispersione (SANS) 2D angolo piccolo neutrone di un DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) campione estruso attraverso 800, 400, 200 o 100 nm pori. SANS misurazioni sono un mezzo complementare di quantificare l'allineamento di bicelle che non verrà trattato in dettaglio nel presente documento. ¹¹ ^, ¹⁶ l'A_f varia tra -1 (scattering di neutroni parallela o perpendicolare allineamento di bicelles rispetto alla direzione del campo magnetico) e 0 per scattering isotropo.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La struttura del bicelles è stata studiata estesamente da una vasta gamma di tecniche di caratterizzazione. ¹³ l'allineamento del bicelles esposti ad un campo magnetico è stato quantificato mediante spettroscopia NMR o esperimenti di scattering (SANS) angolo piccolo neutrone. ⁵ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁴ ^, ²⁵ tuttavia, lo spostamento e l'ampliamento dei picchi NMR che si verificano in presenza di Ln^{3 +} sono gravi limitazioni al metodo. ¹⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ sebbene SANS esperimenti non soffrono di questa limitazione, alternativa e tecniche più accessibili sono desiderabili per quantificazione sistematica di allineamento magneticamente indotta degli assembly nella soluzione. Birifrangenza misurazioni sono un'alternativa praticabile e relativamente semplice. Analogamente agli esperimenti NMR, birifrangenza misure rivelano preziose informazioni su riorganizzazioni del lipido e fasi del lipido che si verificano in doppio strato. Inoltre, vengono monitorate trasformazioni geometriche che si verificano nell'assembly polimolecolari con mutevoli condizioni ambientali come la temperatura. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ Δn′ birifrangenza magneticamente indotta è stato utilizzato per studiare vari tipi di sistemi del fosfolipide. ¹³ ^, ²⁹ ^, ³⁰ misure di birifrangenza basate sulla tecnica della modulazione di fase in un campo magnetico è un metodo praticabile per rilevare l'orientamento del bicelles. ¹² ^, ¹⁶ ^, ¹⁸ ^, ²⁹ ^, ³¹ ^, ³² la possibilità di studiare bicelles con Birifrangenza in alti campi magnetici fino a 35 T inoltre è stata dimostrata da Liebi M. et al. ¹³

Quando la luce polarizzata entra un materiale anisotropo, esso sarà rifratti in un'ondata di ordinaria e straordinaria. ¹¹ le due onde hanno velocità differenti e sono spostate in fase di un δ di ritardo. Il grado di ritardo δ è misurato e convertito in un segnale di birifrangenza figure-introduction-5 per quantificare il grado di anisotropia nel utilizzando materiale

figure-introduction-6 (2)

dove λ è la lunghezza d'onda del laser e d è lo spessore del campione. I fosfolipidi sono otticamente anisotropici e loro asse ottico coincide con le loro ascie lungo molecolare, parallele alle code dell'idrocarburo. ¹¹ ^, ¹² nessun ritardo è misurato se i fosfolipidi sono orientati in modo casuale in soluzione. Il ritardo è misurato quando i fosfolipidi sono allineati parallelamente a vicenda. La birifrangenza magneticamente indotta figure-introduction-7 può avere un segno positivo o negativo a seconda dell'orientamento delle molecole nel campo magnetico; vedere la Figura 2. Fosfolipidi allineati parallelamente all'asse x si tradurrà in un negativo figure-introduction-8 , mentre quelli allineati lungo l'asse z, che provocare un positivo figure-introduction-9 . Nessun birifrangenza è osservata quando l'asse ottico coincide con la direzione di propagazione della luce come il fosfolipide allinea parallelo all'asse y.

figure-introduction-10
Figura 2: Allineamento dei fosfolipidi e corrispondente segno della birifrangenza magneticamente indotta figure-introduction-11 . Il segno di quella misurata figure-introduction-12 dipende dall'orientamento del fosfolipide nel campo magnetico. Le linee tratteggiate indicano l'asse ottico della molecola. La luce è polarizzata a 45° e si propaga in direzione y. Il campo magnetico B è nella direzione z. Questa figura è stata modificata da M. Liebi. ¹¹ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nel caso di una sospensione colloidale isotropica di bicelles, l'orientamento indotta tramite la disposizione dei fosfolipidi in doppio strato andranno perso, azzerando il δ di ritardo. Il bicelles inoltre deve allineare al fine di orientare i fosfolipidi otticamente attivi in loro strati lipidici, causando un ritardo δ della luce polarizzata. Di conseguenza, la birifrangenza è uno strumento sensibile per quantificare la alignability magnetica di polimolecolari assembly. Bicelles allineato perpendicolarmente al campo magnetico produrrà un positivo figure-introduction-13 , mentre quelli allineati parallelamente produrrà un negativo figure-introduction-14 . Il segno dipende l'allineamento dell'installazione e può essere controllato con un campione di riferimento.

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Protocollo

1. procedura di fabbricazione DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) e DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) polimolecolari assembly

Preparazioni preliminari
1. Lavare tutta la vetreria di vampate di calore una volta con etanolo stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio) e asciugare con aria compressa.
2. Produrre 2 soluzioni di riserva distinti 10 mg/mL di DMPC e DMPE-DTPA in etanolo-stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio), una soluzione stock di 10 mM di Chol-OH in etanolo-stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio) e una soluzione stock di 10 mM di TmCl₃ in metanolo.
3. Preparare un tampone fosfato 50 mM ad un valore di pH di 7,4 mescolando 0,121 g di sodio diidrogeno fosfato diidrato e 0,599 g di anidro di-sodio idrogeno fosfato in 100 mL di ultrapura H₂O.
Preparazione del film secco del lipido
1. Pesare la quantità necessaria di amphiphiles (DMPC, DMPE-DTPA e facoltativamente Chol-OH) e soluzioni di Ln^{3 +} riserva in snap-Coppe di vetro separate da 3 mL con una siringa di vetro 2,5 mL.
  1. Per un volume di campione di 3 mL di DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (rapporto molare 4:1:1, concentrazione lipidica totale di 15 mM), pesare in 3,6435 g di soluzione di riserva DMPC, 1,4731 g di soluzione di riserva DMPE-DTPA e 0,7126 g della soluzione madre₃ TmCl.
  2. Per un volume di campione di 3 mL di DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5, concentrazione lipidica totale di 15 mM), pesare in 2,9148 g di soluzione di riserva DMPC, 1,4731 g di soluzione di riserva DMPE-DTPA, 1,0749 g di soluzione di riserva Chol-OH e 0,7126 g di la soluzione di riserva₃ TmCl.
    Attenzione: Cloroformio e metanolo sono tossici e volatili a temperatura ambiente. Lavorare sotto una cappa aspirante e prontamente procedere con le misurazioni di massa.
2. Trasferire il contenuto del snap-tazze su un pallone da 25 mL. Lavare ogni snap-tazza nel pallone fondo tondo con circa 2,5 mL del solvente corrispondente.
3. Rimuovere il solvente sotto vuoto in un evaporatore rotante a 40 ° C. Impostare la pressione iniziale a 30 000 Pa finché non viene rimossa la maggior parte del solvente. Ridurre la pressione a 100 Pa e a secco il campione in rotazione per un minimo di 2 h. ottenere un film uniforme del lipido secco sulle pareti del pallone di vetro.
4. Posizionare la pellicola lipidica asciutto per 1 minuto sotto un costante flusso di argon per evitare l'ossidazione del lipido in aria e conservare il campione in freezer prima di reidratazione.
Idratazione del film secco del lipido
1. Aggiungere 3 mL di tampone fosfato al pallone fondo tondo per raggiungere una concentrazione di lipidi totali di 15 mM.
2. Effettuare un ciclo di congelamento-scongelamento (FT) immergendo il pallone in rotazione in azoto liquido fino a quando esso è completamente congelato (le fermate di azoto liquido bollente), quindi scaldare indietro fino a 60 ° C posizionando il campione per 5 min in un bagno di acqua, agitando continuamente il pallone favorire il processo di fusione. Applicare 30 s di Vortex prima di ogni ciclo di congelamento quando il campione è liquido per favorire l'idratazione del film lipidico.
  Nota: Nessun film lipidico deve essere visibile sulle pareti muffola dopo il secondo ciclo di scongelamento del congelamento.
3. 1.3.2 ripetere per un totale di cinque volte. Tappare il recipiente con un tappo per evitare l'evaporazione inutile del buffer fosfato quando il campione è caldo. Il protocollo può essere messo in pausa quando il campione è congelato.
4. Procedere a due di riscaldamento e raffreddamento (H & C) cicli di stabilizzare il campione che esce l'ultimo passo di congelamento, o di tenere congelati fino a due mesi. Riscaldare il campione a 40 o 60 ° C per DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5), rispettivamente, prima di raffreddamento-5 ° C a 1 ° C/min mantenere il campione 5 min al massimo e minimo temperature del ciclo.
5. Ora, o determinare il segnale di birifrangenza del campione in un campo magnetico esterno (passaggio 2) o estrudere ulteriormente l'esempio per adattare le dimensioni di bicelle e alignability magnetico (punto 1.4).
  Nota: DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) i campioni sono costituiti principalmente da bicelles con un diametro medio di idrodinamico D_H di 70 nm come rivelato da una distribuzione numerica ottenuta da misure di dispersione della luce dinamica (DLS) a 5 ° C. In questi esempi contengono anche grandi polimolecolari assemblee con una media di D_H di 500 nm, come rivelato da una distribuzione di intensità. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) campioni sono altamente polidispersi dimensioni con distribuzioni di intensità tipica rivelando una media D_H di 700 nm, mentre le distribuzioni numero rivelano una popolazione dominata dal più piccolo bicelles nell'intervallo di dimensioni di 200 nm. Distribuzioni di dimensione più dettagliate e immagini di microscopia elettronica di trasmissione cryo di questi campioni sono stati segnalati da Isabettini et al. ²³
Estrusione delle assemblee polimolecolari.
1. Montare l'estrusore come mostrato nella Figura 3. Utilizzare guanti e pinzette con proteggere tubi di silice per la movimentazione. Bagnare la carta da filtro (5) con poche gocce di tampone per consentire un posizionamento ottimale del filtro membrana (6). Assicurarsi che la carta non deve presentare piegature dopo aver posizionato l'o-ring (7) sulla parte superiore.
  Nota: Il processo di estrusione è stato testato su filtri a membrana (6) con un diametro dei pori di 800, 400, 200 e 100 nm; vedere la Figura 7.
2. Impostare il bagno di acqua a 40 ° C per DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) campioni o 60 ° C per DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) campioni garantire la formazione delle vescicole estrudibili.
3. Collegare l'estrusore ad una bombola di azoto pressurizzato utilizzando un tubo in PVC ad alta pressione (> 4 MPa) dotato di adattatori serto ed estrudere il materiale liquido attraverso la membrana. 1 MPa di pressione è richiesto solitamente per estrusione attraverso filtri a membrana (6) con un diametro dei pori di 200 nm e sopra. 1.5-2.5 MPa sono necessari per i più piccoli filtri a membrana (6) con un diametro dei pori di 100 nm.
  Nota: Cambiare il filtro a membrana se anormalmente alte pressioni (> 2,5 MPa) sono necessari per estrudere il campione (questo è il primo segno di intasamento).
4. Aprire il coperchio (10) e inserire l'esempio utilizzando una pipetta di vetro da 2 mL. Chiudere il coperchio (10), quindi aprire la valvola (12) tenendo il tubo di uscita del campione (2). Chiudere la valvola di pressione (12) dopo aver completato il ciclo di estrusione, sfogare e continuare con il successivo ciclo.
  Nota: Non lasciare il campione a contatto troppo a lungo con il vaso rivestito caldo (8) per evitare la perdita eccessiva di campione per evaporazione.

30-60 s è abbastanza tempo per un campione di 3 mL equilibrare nell'estrusore prima di aprire la valvola di pressione (12).

Procedere per 10 cicli di estrusione per una dimensione del poro della membrana dato come mostrato nella Figura 3. La maggior parte dei sistemi bicelle sono estrusi 10 volte attraverso le membrane con un diametro dei pori di 200 e un altro 10 volte attraverso membrane con pori del diametro di 100 nm, garantendo la comparabilità del campione.

Ora, determinare il segnale di birifrangenza del campione in un campo magnetico esterno (passaggio 2).

figure-protocol-1
Figura 3: laboratorio estrusore usato per preparazioni bicelle e vescicola. L'estrusore è assemblato dal basso fino: Monte (1), (2) campione raccolta spazio con un tubo di plastica uscita 2,4 mm (diametro interno) e o-ring, (3) e (4) grandi e piccole mesh stabilizzante, (5) carta da filtro, filtri a membrana (6), (7) o-ring, la nave (8) rivestita, (9. ) copertura con coperchio (10), viti a farfalla (11), connessione di aspirazione e pressione, valvola di pressione (12) superiore. Uno schizzo dell'estrusore assemblato è mostrato di destra-mano-lato. L'azoto (N₂) è fornita da un recipiente a pressione e il recipiente rivestito (9) è collegato ad un bagno di acqua per controllo della temperatura. Il campione subisce 10 cicli di estrusione per qualsiasi diametro dei pori di membrana determinato filtro (percorso di esempio visualizzato in blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. misure birifrangenza di DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) e DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) polimolecolari assembly.

Costruire e collegare il programma di installazione di birifrangenza come mostrato nella Figura 4 e fornire alimentazione ai rispettivi elementi elettronici. Non collocare il PEM, il campione e il secondo polarizzatore nel percorso del laser in questa fase. Evitare la luce laser retro-sparsi di rilevazione mediante la copertura di superfici riflettenti, ad esempio supporti specchio di alluminio, con la carta nera.
Regolare gli specchi per massimizzare l'intensità del laser al rivelatore, che è rappresentato dall'intensità della corrente continua ottenuti dal filtro passa-basso in Figura 4B.
Attenzione: Indossare appropriati occhiali di protezione quando si regolano gli specchi e consultarsi con un istruttore di sicurezza laser se manipolando i laser per la prima volta.
Girare il primo polarizzatore lineare incrociato (tenuto perpendicolarmente al fascio laser incidente) per massimizzare la .

figure-protocol-4
Figura 4: rappresentazione schematica del programma di installazione di birifrangenza e connessioni per i segnali ottici. A) un elettromagnete superconduttore fornisce un 5,5 campo magnetico T. La luce da un diodo laser a 635 nm è polarizzata da due polarizzatori incrociati. Un modulatore fotoelastica PEM-90 funziona a 50 KHz con un'ampiezza₀ di 2,405 rad e collocato tra i due polarizzatori. L'esempio si trova nel magnete tra il PEM e il secondo polarizzatore. Specchi non-polarizzazione guida la luce attraverso i diversi elementi e infine viene rilevato da un rivelatore di foto. La prima e la seconda armonica figure-protocol-5 e figure-protocol-6 del segnale AC sono monitorati, permettendo il calcolo del segnale birifrangenza dando informazioni sulla alignability magnetica del Ln^{3 +} chelanti polimolecolari assembly. La provetta del campione è collegata ad un bagno di acqua esterno per controllo di temperatura (blu). La temperatura del campione è monitorata con una sonda di temperatura (rossa). B) il segnale del rivelatore di foto in un secondo filtro di passa-basso ordine Sallen-Key (24 alimentazione V AC) con una frequenza di cut-off di 360 Hz attraverso un ± 12 V DC braded cavo di alimentazione (3). Il filtro passa-basso estrae la componente DC figure-protocol-7 e lo consegna all'interfaccia PC (4) attraverso un cavo di BNC 50 Ω. Il segnale del rivelatore di foto viene consegnato ai due amplificatori lock-in (che estrarre la prima e la seconda armonica figure-protocol-8 e figure-protocol-9 ) attraverso un cavo Ω BNC 50 (1) & (2). Le intensità armoniche vengono rilevate da un rilevamento di fase sensibile. Di conseguenza, il segnale PEM è utilizzato come segnale di riferimento per gli amplificatori lock-in (1f-uscita del PEM nel primo lock-in amplifier e 2f-uscita nel secondo, collegata con BNC 50 cavi Ω). I segnali in uscita vengono consegnati all'unità di interfaccia PC tramite cavi di BNC 50 Ω. Unità di acquisizione analogica cFP-AI-110 e cFP-CB-1 digitalizzare il segnale che viene trasferito al computer tramite un cavo RS 232 per il monitoraggio. La sonda di temperatura tipo K è anche collegata all'unità di interfaccia PC dove acquisizione analogica unità cFP-CB-3 e cFP-TC-120 digitalizzare il segnale prima di trasferirla al computer tramite un cavo RS 232 per il monitoraggio. C) foto del setup schematico presentato in elementi di B. chiave vengono identificati con i numeri corrispondenti da 1 a 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Posizionare il secondo polarizzatore lineare incrociato perpendicolari al fascio laser incidente, come mostrato in Figura 4A. Ridurre al minimo la impostando il polarizzatore secondo un'angolazione di 90° rispetto al primo.
Posto il modulatore fotoelastica (PEM) a 0° tra i due ha attraversato polarizzatori lineari e perpendicolare al fascio laser incidente come mostrato in Figura 4A. Regolare il PEM ad una frequenza di 50 kHz e ampiezza A0 a 2,405 rad come mostrato in Figura 5A. In questo modo il componente DC indipendente di birifrangenza e aumenta la .
Nota: L'asse ottico del PEM può essere sintonizzata da pochi gradi di mantenere una costante in aria prima di qualsiasi campione di misura.
Attendere 1 ora dopo aver acceso il laser e apparecchiature elettroniche per stabilizzare il segnale.

Dopo l'auto-eliminazione graduale degli amplificatori lock-in rimane costante, il segnale è stabile.

Il campione viene posto in una cuvetta di quarzo a temperatura controllata con una lunghezza di percorso di 10 mm e collegarlo ad un bagno di acqua esterno inizialmente impostato a 5 ° C.

Posizionare una 0,5 mm spessore termocoppia K (sonda di temperatura) direttamente nel campione per monitorare la temperatura del campione. Verificare che la sonda non interferisca con la luce laser posizionando un libro bianco nel percorso del laser (dopo la cuvetta) e cercando le ombre causate dalla sonda.
Nota: C'è una differenza di 2-3 ° C tra la registrazione di temperatura del bagno d'acqua e la temperatura del campione.

Disponga la provetta nel foro del magnete, come mostrato in Figura 4A. La luce laser si propaga orizzontalmente attraverso il campione, è deviata da specchi di non-polarizzazione e rilevata da un fotorilevatore.
Nota: Il laser è diretto verso il basso, attraverso l'esempio ed eseguire il backup lo stesso percorso per tenere conto degli effetti di Faraday (cioè la rotazione del piano di polarizzazione della luce causata dal campo magnetico quando scendendo viene annullata quando uscendo in direzione opposta).

Applicare un flusso costante di aria di aria compressa a temperatura ambiente e 10000 Pa sulla cuvetta per evitare la condensazione dell'acqua sulle pareti della cella, che potrebbe ridurre l'intensità del segnale e aumentare il rumore. Ciò è particolarmente importante quando si misura a 5 ° C.

Rilevare la prima e la seconda armonica figure-protocol-13

del segnale AC con due amplificatori lock-in. Auto l'amplificatori lock-in di fase premendo il pulsante (2) mostrato in figura 5B e regolare la sensibilità, come mostrato in figura 5B (1). Assicurarsi che non ci sono più di quattro barre rosse sugli amplificatori come mostrato in figura 5B (3) per evitare il sovraccarico del segnale. Annotare la sensibilità autonomo per entrambi amplificatori lock-nel programma Tesla_Magnet_Const_V092 come mostrato in Figura 5 (8). Il programma è fornito come informazioni supplementari.

Rampa del campo magnetico fino a 5.5 T fornendo corrente al magnete attraverso il programma Tesla_Magnet_Const_V092 come mostrato in Figura 5 (5).

Ottenere la birifrangenza figure-protocol-15

utilizzando l'equazione 2, dove il ritardo è calcolato con
figure-protocol-16

(3)
dove

sono funzioni di Bessel del primo tipo, con figure-protocol-19

. ¹¹ ^, ¹³ ^, ¹⁸ ^, ³³ ^, ³⁴ trama il ritardo nel programma Tesla_Magnet_Const_V092, come mostrato in Figura 5 (4).
Nota: Il ritardo previsto dal programma non dovrebbe essere utilizzato per calcolare il segnale di birifrangenza se i due amplificatori lock-in non sono operativi presso la stessa sensibilità (Vedi punto 2.12). Le intensità armoniche connesso figure-protocol-21

devono essere moltiplicate per la sensibilità degli amplificatori lock-in per ottenere le dimensioni corrette. Inoltre, il segnale di birifrangenza misurato sotto un campo magnetico dovrà essere normalizzato sottraendo il segnale di birifrangenza medio ottenuto a t 0.

Monitorare il segnale birifrangenza del campione costante o la variazione di temperatura (1 ° C/min) regolando la temperatura del bagno d'acqua collegato alla cuvetta illustrata nella Figura 4.

Registrare i dati sperimentali di riempimento nella descrizione sperimentale in Figura 5 (8), fornendo un nome di file (9) e premendo il pulsante "START log" (10).

figure-protocol-23
Figura 5: illustrazioni delle impostazioni autonomo e programma screenshot. A) impostazioni PEM: ritardo 2,405 rad, lunghezza d'onda 635 nm, frequenza 50 Hz. White cerchi indicano quali impostazioni deve essere attivato (USR = ritardo definito dall'utente, LOC = funzionamento in modalità locale). B) impostazioni amplificatore Lock-in. La sensibilità (1) deve essere selezionato prima di ogni misurazione come richiesto al punto 2.11. Non dovrebbero esserci più di quattro barre rosse sul display (3) per evitare un sovraccarico del segnale. Quando si accende il led (1) rosso, rendendo impossibile una misurazione, si verifica un sovraccarico. Premere il pulsante di fase di auto (2) prima di ogni misurazione. C) screenshot del programma Tesla_Magnet_Const_V092 fornito come informazioni supplementari. Il programma permette il controllo del campo magnetico e la registrazione di tutto il segnale uscite come funzione del tempo. Il campo magnetico e la temperatura del campione vengono tracciate in (1). La prima e la seconda armonica figure-protocol-24 e figure-protocol-25 del segnale AC misurato dagli amplificatori lock-in due tracciati in (2). L'intensità della corrente continua figure-protocol-26 viene tracciata in (3). Il ritardo è calcolato come descritto al punto 2.13 e tracciato in (4). L'intensità del campo magnetico è impostato in (5). La misura diretta della temperatura registrata dalla termocoppia tipo K è presentata in (6) e i segnali di uscita ( figure-protocol-27 e figure-protocol-28 ) (7). Informazioni di esempio aggiuntivi possono essere inserite in (8) come la sensibilità autonomo del nome esempio, amplificatori, ecc. I dati possono essere registrati ed esportati in un file. txt fornito (9). Avviare e arrestare l'acquisizione di dati con il pulsante "START log" (10). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Il segnale di birifrangenza di una non-estruso DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) campione è stato monitorato sotto un 5,5 campo magnetico T durante un riscaldamento e raffreddamento da 5 a 40 ° C e ritorno a un tasso di 1 ° C/min (Figura 6). I risultati di birifrangenza confermano alti allineamenti magnetici a 5 ° C con un valore di 1.5 x 10^-5, due volte più forte per quanto riguarda i sistemi di estrusi segnalati.

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Discussione

Un resoconto dettagliato di come birifrangenza misure sono state usate in combinazione con SANS esperimenti per valutare i metodi per la generazione altamente magneticamente reattivo Ln^{3 +}chelanti fosfolipidi assembly è in Isabettini et al. ²³ i protocolli di fabbricazione proposto sono anche applicabili per gli assembly composti dei fosfolipidi DPPC e DPPE-DTPA più lunghi o per quelli contenenti derivati steroidi chimicamente derivati dal loro doppio strato.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono la Swiss National Science Foundation per finanziamento SMhardBi (progetto numero 200021_150088/1). I SANS esperimenti sono stati eseguiti presso la sorgente di neutroni di spallazione svizzero SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Svizzera. Gli autori ringraziano calorosamente il Dr. Joachim Kohlbrecher per la sua guida con gli esperimenti SANS. Il setup di misura birifrangenza sotto alti campi magnetici è stato ispirato dal programma di installazione esistente presso il laboratorio di magnetico ad alto campo HFML, Nijmegen, Paesi Bassi. Ringraziamo Bruno Pfister per il suo aiuto nello sviluppo dell'elettronica del setup birifrangenza, Jan Corsano e Daniel Kiechl per la costruzione dei quadri permettendo bene e facile allineamento del laser e Dr. Bernhard Koller per supporto tecnico continuo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo-etanolammina-dietilene triamminapentaacetato sale acido di esammonio (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Cloruro di tulio (III)	Sigma-Aldrich	439649	anidro, polvere, 99,9% di metalli in tracce di base
Disprosio(III) Cloruro	Sigma-Aldrich	325546	anidro, polvere, 99,9% di metalli in tracce di
base Itterbio (III) Cloruro di itterbio(III)	Sigma-Aldrich	439614	anidro, polvere, 99,9% di metalli in tracce
Cloroformio	Sigma-Aldrich	319988	contiene etanolo come stabilizzante, reagente ACS, ≥ 99,8%
Metanolo	Sigma-Aldrich	34860	≥ 99,9%
Colesterolo	Amresco	433	Grado ultra puro
D2O	Sostanze chimiche ARMAR	1410	99,8 atom % D Acqua
ultrapura	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
misuratore elettronico di pH	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm filtro a membrana	VWR	515-2028
Filtro a membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm	VWR	515-2029
Filtro a membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm	VWR	515-2030
Filtro a membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm	VWR	515-2032
Whatmann Carta da filtro	VWR	230600
Pallone a fondo tondo da 25 ml	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml di vetro snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
Siringa di vetro da 2,5 ml	Hamilton
Sodio diidrogeno fosfato diidrato	Merk	1.06342	Sale usato per fare il tampone fosfato
di-Sodio idrogeno fosfato	Merk	1.06586	Sale usato per fare il tampone fosfato
Azoto liquido	Carbaga-
Azoto gassoso pressurizzato	Bottiglia Carbagas-200		bar
Estrusore lipidico 10 ml	Lipex-Completamente		equipaggiato con thermobarrel
Tubo in PVC ad alta pressione	GR NETUM-deve		resistere a più di 4 MPa
Adattatori Serto	Sertot-Nitrile
	VWR-2
ml pipette di vetro	VWR	612-1702	230 mm di lunghezza
Diodo Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Rivelatore di fotodiodi	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, silicio, fotoconduttivo
5.5 T criogenico magnetico	criogenico/Oerlikon AG-12		bar He-raffreddato. Compressore RW4000/6000, testa criogenica RGD 5/100 TA
Filtro passa-basso di secondo ordine	Alimentatore lineare integrato in casa		24V DC, secondo ordine, Chiave Sallen, frequenza di taglio 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Modulatore fotoelastico	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Polarizzatore di calcite	Newport	10GT04	diametro 25,4 mm
	Hellma	Cella a temperatura controllata 165-10-40	, 0,8 ml, lunghezza percorso 10 mm
Sonda di temperatura	Thermocontrol-Type		K, diametro 0,5 mm, Thermocoax
Specchi non polarizzanti	Newport	50326-1002	Cavi RS 232 da 25,4 mm
	National Instruments	189284-02	Per il collegamento alla porta RS-232 sulla parte anteriore dei controller Compact FieldPoint
BNC 50 e Omega; Cavi e connettori	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	Modulo di ingresso analogico di tensione e corrente a 8 canali per Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Blocco connettore integrato per il cablaggio a Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Blocco connettore isotermico integrato per il cablaggio di termocoppie al modulo cFP-TC-120
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	di input per termocoppia a 8 canali per Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Interfaccia Ethernet/seriale per NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National	Instruments-Industrial
Power Traco	Power	TCL 060-124	100-240V AC
Bagnomaria	Julabo	FP40-HE	Circolatore refrigerato/Riscaldamento

Guanti Cuvetta campione di quarzo Modulo

Riferimenti

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Tag

Assemblaggi Magnetici Estrusione Lipidica DMPC DMPE DTPA Bicelle Dopate con Colesterolo Allineamento tramite Campo Magnetico Formazione di Precursori di Vescicole Assemblaggio a Temperatura Controllata Progettazione di Assemblaggi Polimolecolari

Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly