Regolazione traduzionale svolge un ruolo importante nel controllo dell'abbondanza di proteine. Qui, descriviamo un metodo di alto-rendimento per analisi quantitativa di traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae.
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Articolo metodologico
Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma
In questo articolo
Sommario
Abstract
Traduzione di mRNA in proteine è un processo complesso che coinvolge diversi strati di regolamento. Spesso si presume che cambiamenti nella trascrizione del mRNA riflettono cambiamenti nella sintesi proteica, ma sono state osservate molte eccezioni. Recentemente, una tecnica chiamata ribosoma profilatura (o Ribo-Seq) è emerso come un potente metodo che permette l'identificazione, con alta precisione, quali regioni di mRNA vengono tradotti in proteine e quantificazione della traduzione a livello di genoma. Qui, presentiamo un protocollo generalizzato per la quantificazione del genoma di traduzione utilizzando Ribo-Seq in lievito. Inoltre, combinando Ribo-Seq dati con misure di abbondanza del mRNA permette di quantificare contemporaneamente l'efficienza della traduzione di migliaia di trascrizioni del mRNA nello stesso campione e confrontare le modifiche a questi parametri in risposta a sperimentale manipolazioni o in diversi stati fisiologici. Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione delle orme di ribosoma tramite digestione nucleasi, isolamento dei complessi intatti ribosoma-impronta tramite frazionamento gradiente di saccarosio e la preparazione delle librerie di DNA per sequenziamento profondo insieme appropriato controlli di qualità necessari per garantire l'accurata analisi della traduzione in vivo .
Introduzione
traduzione del mRNA è uno dei processi fondamentali nella cellula, che svolge un ruolo importante nella regolazione dell'espressione della proteina. Di conseguenza, la traduzione degli mRNA è strettamente controllato in risposta a diversi stimoli fisiologici interni ed esterni 1,2. Tuttavia, i meccanismi di regolazione traduzionale rimangono Zito. Qui, descriviamo il protocollo per la quantificazione del genoma della traduzione nel lievito gemmante dal ribosoma profilatura. L'obiettivo generale della tecnica di profilatura del ribosoma è studiare e quantificare la traduzione di specifici mRNA sotto diverse con....
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Protocollo
1. Estrarre la preparazione
- Ceppi di lievito di striscia dagli stock congelati per singole colonie su piastre YPD (1% di Estratto di lievito, 2% di peptone, glucosio di 2% e 2% agar). Incubare le piastre a 30 ° C per 2 giorni.
- Inoculare il lievito da una piastra YPD (uso una singola Colonia) in 15 mL di terreno YPD (Estratto di lievito 1%, 2% di peptone, 2% di glucosio) in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e crescere durante la notte con agitazione (200-250 giri/min) a 30 ° C.
- Diluire cultura in 500 mL di mezzo YPD in una beuta sterile 2L, di modo che il OD600 < 0.1. Crescere le cellule di lievito con agitazione....
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Risultati
Sono state dettagliate condotte per analisi bioinformatica del ribosoma profiling dei dati descritto in precedenza 8,9. Inoltre, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato strumenti bioinformatici per l'analisi dell'espressione genica differenziale e trattamento dei dati di sequenziamento, che sono specifici per ribosoma profilatura metodo 10,11,
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Discussione
L'approccio di Ribo-Seq è emerso come una potente tecnologia per l'analisi del mRNA traduzione in vivo presso il genoma di livello 3. Gli studi che utilizzano questo approccio, che permette di monitorare la traduzione con risoluzione di singolo-codone, ha contribuito alla nostra comprensione della regolazione traduzionale. Nonostante i suoi vantaggi, Ribo-Seq presenta diverse limitazioni. Frammenti di RNA ribosomiale (rRNA) sono sempre co-purificate durante l'isolamento delle orme protett.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute AG040191 e AG054566 di VML. Questa ricerca è stata condotta mentre VML era un destinatario AFAR Research Grant della Federazione americana per la ricerca di invecchiamento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ Filtri a membrana M | Millipore | HVLP04700 | |
| 0,5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| Filtri centrifughi 0,5 mL (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7,0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 a 4 gradi; C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X tampone TBE | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea | gel Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea tampone | campione Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5,5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenilasi (10 U/μ L) | Epicentro | DA11101K | |
| 5X Tampone di caricamento del campione di acido nucleico | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE | gel Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acido-Fenolo:Cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Transilluminatore a luce blu | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Perline in acciaio cromato, 3,2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec prodotto | 3110BX | |
| Cicloesimide | RPI | C81040-5.0 | |
| Sistema di acquisizione dati | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Miscela di soluzioni di deossinucleotide (dNTP) (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Sistema di frazionamento a gradiente | Brandel | BR-184X | |
| DNA polimerasi ad alta fedeltà (2.000 U/mL) | NEB | M0530S | Fornito con tampone Phusion HF 5X |
| Kit di quantificazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Colorante su gel di acido nucleico | Invitrogen | S11494 | |
| Ultracentrifuga Optima XE-90 | Beckman Coulter | A94471 | |
| Kit di isolamento dell'mRNA Poly(A) | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J esonucleasi (10 U/μ L) | Epicentro | RJ411250 | |
| Trascrittasi inversa (200 U/μ L) | Invitrogen | 18080093 | Fornito con tampone 5X per il primo filamento e tampone |
| frammentazione dell'RNA | NEB | E6186A | |
| RNasi I (100 U/μ L) | Invitrogen | AM2295 | |
| Inibitore della RNasi (20 U/μ L) | Invitrogen | AM2696 | |
| Tappi in gomma siliconica BioSpec | Products | 2008 | |
| ssDNA ligasi (100 U/μ L) | Epicentro | CL9021K | Fornito con 10 tamponi CircLigase II e 50 mM di MnCl2 |
| Stainless steel microfiales, 1,8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Saccarosio | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotore | Beckman Coulter | 331362 | |
| Pompa a siringa | Era Pump | Systems NE-300 | |
| Polinucleotide chinasi T4 (10.000 U/mL) | NEB | M0201S | Fornito con 10X tampone polinucleotidico chinasico |
| T4 RNA ligasi T4 troncato KQ (200.000 U/mL) | NEB | M0373S | Fornito con 10X tampone RNA ligasi T4 e 50% PEG8000 |
| Termociclatore | Bio-Rad | 1851148 | |
| Provette in poliallomero a parete sottile, 13,2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Monitor UV Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Bio-Rad | 7318160 | ||
| Saccharomyces cerevisiae ceppo BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
Riferimenti
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., N....
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Ristampe e permessi
