Articolo metodologico

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

DOI:

10.3791/56820

⸱

21 dicembre 2017

 ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Boston University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regolazione traduzionale svolge un ruolo importante nel controllo dell'abbondanza di proteine. Qui, descriviamo un metodo di alto-rendimento per analisi quantitativa di traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

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Traduzione di mRNA in proteine è un processo complesso che coinvolge diversi strati di regolamento. Spesso si presume che cambiamenti nella trascrizione del mRNA riflettono cambiamenti nella sintesi proteica, ma sono state osservate molte eccezioni. Recentemente, una tecnica chiamata ribosoma profilatura (o Ribo-Seq) è emerso come un potente metodo che permette l'identificazione, con alta precisione, quali regioni di mRNA vengono tradotti in proteine e quantificazione della traduzione a livello di genoma. Qui, presentiamo un protocollo generalizzato per la quantificazione del genoma di traduzione utilizzando Ribo-Seq in lievito. Inoltre, combinando Ribo-Seq dati con misure di abbondanza del mRNA permette di quantificare contemporaneamente l'efficienza della traduzione di migliaia di trascrizioni del mRNA nello stesso campione e confrontare le modifiche a questi parametri in risposta a sperimentale manipolazioni o in diversi stati fisiologici. Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione delle orme di ribosoma tramite digestione nucleasi, isolamento dei complessi intatti ribosoma-impronta tramite frazionamento gradiente di saccarosio e la preparazione delle librerie di DNA per sequenziamento profondo insieme appropriato controlli di qualità necessari per garantire l'accurata analisi della traduzione in vivo .

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

traduzione del mRNA è uno dei processi fondamentali nella cellula, che svolge un ruolo importante nella regolazione dell'espressione della proteina. Di conseguenza, la traduzione degli mRNA è strettamente controllato in risposta a diversi stimoli fisiologici interni ed esterni 1,2. Tuttavia, i meccanismi di regolazione traduzionale rimangono Zito. Qui, descriviamo il protocollo per la quantificazione del genoma della traduzione nel lievito gemmante dal ribosoma profilatura. L'obiettivo generale della tecnica di profilatura del ribosoma è studiare e quantificare la traduzione di specifici mRNA sotto diverse condizioni cellulari. Questa tecnica utilizza sequenziamento di nuova generazione per analizzare quantitativamente l'occupazione del ribosoma in tutto il genoma e permette di monitorare il tasso di proteine sintesi in vivo al singolo codone risoluzione 3,4. Attualmente, questo metodo fornisce i mezzi più avanzati di misurare i livelli di traduzione di proteine e ha dimostrato di essere uno strumento di scoperta utile fornire informazioni che non possono essere rivelati da altre tecniche attualmente disponibili, ad esempio microarrays o Traduzione stato matrice analisi (TSAA) 5. Come ribosoma profilatura report sui cambiamenti combinati nei livelli della trascrizione e uscita traslazionale, fornisce anche sensibilità molto maggiore rispetto ad altri metodi.

Questo approccio si basa sul sequenziamento profondo del ribosoma-protetto mRNA frammenti 3. Durante la traduzione di proteine, i ribosomi proteggono ~ 28 porzioni di nt del mRNA (chiamato tracce) 6. Determinando la sequenza dei frammenti ribosoma-protetto, Ribo-Seq può mappa la posizione dei ribosomi su mRNA tradotta e identificare quali regioni del mRNA sono probabili essere attivamente tradotto in proteina 3,7. Inoltre, possiamo misurare quantitativamente la traduzione di mRNA contando il numero di impronte che si allineano a una determinata trascrizione di mRNA.

Al fine di isolare i frammenti ribosoma-protetto, lisati cellulari sono inizialmente trattati con un inibitore di traduzione di stallo i ribosomi seguiti da digestione di ribonucleasi. Considerando che libero mRNA e porzioni dei mRNAs tradotta non protetti dai ribosomi sono degradate da ribonucleasi, i frammenti di mRNA ribosoma-protetti possono essere recuperati da purificare complessi intatti ribosoma-impronta. Queste impronte di mRNA sono quindi convertite in cDNA biblioteca e analizzate mediante sequenziamento profondo (Figura 1). In parallelo alla profilatura del ribosoma, mRNA intatto viene estratta dallo stesso campione e sequenziato. Confrontando il livello di traduzione identificato da Ribo-Seq con misure di abbondanza del mRNA, possiamo identificare i geni che sono specificamente up - o down-regolato a livello della traduzione e calcolare l'efficienza della traduzione del mRNA a livello del genoma. Mentre il protocollo descritto in questo articolo è specifico per il lievito, dovrebbe essere anche utile per i ricercatori che cercano di stabilire il protocollo di Ribo-Seq in altri sistemi.

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Protocollo

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1. Estrarre la preparazione

  1. Ceppi di lievito di striscia dagli stock congelati per singole colonie su piastre YPD (1% di Estratto di lievito, 2% di peptone, glucosio di 2% e 2% agar). Incubare le piastre a 30 ° C per 2 giorni.
  2. Inoculare il lievito da una piastra YPD (uso una singola Colonia) in 15 mL di terreno YPD (Estratto di lievito 1%, 2% di peptone, 2% di glucosio) in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e crescere durante la notte con agitazione (200-250 giri/min) a 30 ° C.
  3. Diluire cultura in 500 mL di mezzo YPD in una beuta sterile 2L, di modo che il OD600 < 0.1. Crescere le cellule di lievito con agitazione a 30 ° C per 3-5 h fino al OD600 = 0.5 (Mid-registro fase).
  4. Raccogliere le cellule filtrando attraverso filtri a membrana 0,45 μm utilizzando un sistema filtrante di vetro titolare. Raschiare il pellet con una spatola, freeze flash in azoto liquido e conservare a-80 ° C. La dimensione prevista del pellet congelato è ~ 0,2 - 0,5 g.
    Attenzione: L'azoto liquido è estremamente bassa temperatura; indossare una protezione appropriata.
  5. Preparare un tampone di lisi fresco (20 mM Tris-HCl a pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, cicloesimmide di 100 μg/mL, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) immediatamente prima dell'uso, tenere il ghiaccio.
  6. Messi 3 Perline in acciaio al cromo (3,2 mm) in un tubo di acciaio inox di 1,8 mL. Pre-raffreddare in azoto liquido e aggiungere pellet congelati, coprire con un tappo di gomma in silicone. Omogeneizzare il campione di cryogrinding per 10 s a 4200 giri/min; ripetere 10 volte. Raffreddare il tubo in azoto liquido per almeno 10 s tra ogni round.
    Nota: È importante mantenere sempre il campione congelato.
  7. Aggiungere 1 mL di tampone di Lisi, miscelare bene pipettando. Trasferire in una nuova provetta da 1,5 mL.
  8. Centrifuga a 20.000 x g per 5 min a 4 ° C. Mentre si lavora sul ghiaccio, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL. Trasferire 100 µ l di lisato una nuova provetta da 1,5 mL per l'isolamento di mRNA di poli (a). Procedere immediatamente all'isolamento del RNA o congelamento flash il tubo in azoto liquido. Misura OD260 del resto del lisato, che verrà utilizzato per l'estrazione di impronta e flash congelare i tubi in azoto liquido. Memorizzare i lisati a-80 ° C.

2. impronta estrazione

  1. Preparazione delle pendenze del saccarosio
    1. Preparare le soluzioni per il 50%, 40%, 30%, 20% e 10% di saccarosio in gradienti tampone (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, cicloesimmide di 100 μg/mL, 0,5 mM DTT).
    2. Pipettare 2,2 mL di preparato 50% saccarosio tampone alla parte inferiore del tubo polyallomer 13,2 mL a parete sottile e congelare la soluzione per 10 min a-80 ° C (Figura 2). Poi strato 2,2 mL di tampone di saccarosio di 40% in cima il buffer di saccarosio 50% congelati e congelare per 10 min a-80 ° C. Seguendo le stesse istruzioni, strato 30%, poi il 20% e 10% saccarosio buffer in cima di ogni altro. Evitare di fare bolle d'aria durante la stratificazione. Mantenere le pendenze a-80 ° C fino all'utilizzo. Le pendenze del saccarosio devono essere preparate con almeno un giorno prima dell'esperimento e conservate a-80 ° C.
  2. Digestione di nucleasi
    1. Scongelare i gradienti di saccarosio la notte prima di esperimenti a 4 ° C.
    2. Scongelare il lisato (impronta campione cellulare) sul ghiaccio. Trasferire un'aliquota di cella lysata contenente 50 OD260 unità per una nuova provetta da 1,5 mL e aggiungere Buffer di lisi di fresco fino a 1 mL. Conservare il restante lisato a-80 ° C. Aggiungere 10 μL di RNAsi ho (100 U/μL) e Incubare 1h a temperatura ambiente con delicata rotazione su un rotore di testa-sopra-tacchi.
    3. (Opzionale) Chiarire i campioni a 20.000 x g per 5 min a 4 ° C e recuperare il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.
  3. Ultracentrifugazione
    1. Delicatamente strato lisati campioni alla parte superiore di un gradiente di saccarosio di 10-50%.
    2. Ultracentrifuga il polyallomer tubi a 210.000 x g (35.000 giri/min) a 4 ° C per 3 h utilizzando SW-41 Ti rotore.
  4. Confi gurazione di sistema gradiente frazionamento
    1. Attivare i componenti e consentire al monitor di UV di warm-up per almeno 30 min.
    2. Se utilizzando un registratore digitale software, avviare il software sul computer, è possibile impostare limiti di scala del grafico a -0,01 e 1.
    3. Riempire la siringa con la soluzione di Chase (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% di saccarosio), rimuovere eventuali bolle d'aria all'interno della siringa e la cannula.
    4. Installare un tubo di ultracentrifuga riempito con acqua RNAsi-libera. Forare il tubo con la cannula fino a due segni neri possono essere visto. Avviare la pompa a siringa a 1 mL/min.
    5. Come l'acqua passa attraverso la cella di flusso, premere il pulsante di "Azzeramento automatico" sul monitor UV per regolare la linea di base a 0. Impostare la sensibilità del monitor UV per "2.0 AU". Dopo una linea di base stabile è stato istituito, arrestare la pompa a siringa. Recuperare la soluzione di Chase e rimuovere il tubo ultracentrifuga.
  5. Isolamento monosome
    1. Installare e forare il tubo ultracentrifuga contenente il gradiente di saccarosio. Avviare la pompa a siringa a 1 mL/min, raccogliere le frazioni di 1 mL monitoraggio un valori di254 . Piscina frazioni rappresenta l'apice di monosome anni ' 80 in una provetta, tenere il ghiaccio (Figura 3).
    2. Una volta che Chase soluzione raggiunge la cella di flusso, fermare la pompa a siringa. Recuperare Chase soluzione e rimuovere il tubo ultracentrifuga. Ripetere il frazionamento per il resto dei campioni partendo dal punto 2.5.1.
      Nota: Al termine dell'operazione, pulire il sistema di frazionamento con almeno 30 mL di acqua RNAsi-libera. Lavare accuratamente la tubazione, la siringa e tutti i componenti rimovibili con acqua calda.
    3. Filtrare le frazioni attraverso filtri centrifughi di 0,5 mL (100 kDa MWCO) a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C e scartare il flusso continuo, ripetere fino a quando il volume è < 100 μL. Aggiungere 400 μL di tampone a rilascio (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA, inibitore di 40 U/mL RNasi). Mix di pipettaggio, Incubare in ghiaccio 10 min e l'unità di trasferimento in una nuova provetta di raccolta. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C e raccogliere il flusso continuo.
  6. Purificazione del frammento di impronta
    1. Trasferire i flusso-attraverso contenente impronta RNA frammenti di tubo un nuovo 1,5 mL, aggiungere 20 μL di 20% SDS (a una concentrazione finale dell'1%), Miscelare pipettando.
    2. Aggiungere 1 volume di acido-fenolo: cloroformio (pH 4,5), vortex per 10 s.
      Attenzione: L'acido-fenolo: cloroformio è tossico, evitare il contatto con la pelle e per inalazione.
    3. Scaldare a 65 ° C per 5 minuti, mettere il ghiaccio per 1 min. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C, trasferire la fase acquosa (in alto) per una nuova provetta da 1,5 mL.
    4. Precipitare frammenti di RNA di impronta con l'aggiunta di 1/10 di volume di NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%.
Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.

3. poli (a) mRNA estrazione

  1. Estrazione di RNA totale
    1. Scongelare un'aliquota di 100 μL di lisato cellulare (campione diRNA totale ) sul ghiaccio, aggiungere 300 μL di 20 mM Tris-HCl pH 7.0 e 20 μL di 20% SDS (a una concentrazione finale dell'1%), Miscelare pipettando.
    2. Aggiungere 1 volume (400 µ l) di acido-fenolo: cloroformio (pH 4,5) e vortex per 10 s.
    3. Scaldare a 65 ° C per 5 minuti, mettere il ghiaccio per 1 min. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C, trasferire la fase acquosa (in alto) per una nuova provetta da 1,5 mL.
    4. Eseguire una seconda estrazione del fenolo. Aggiungere 1 volume di acido-fenolo: cloroformio (pH 4,5), vortexare per 10 s. calore a 65 ° C per 5 minuti, mettere il ghiaccio per 1 min. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C, la fase acquosa di trasferimento in una nuova provetta da 1,5 mL.
    5. Precipitare il RNA. Per questo è necessario aggiungere 1/10 di volume di 3 M NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
  2. Isolamento di mRNA di poli (a)
    1. Centrifugare i campioni di RNA a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento e asciugare all'aria il pellet per 5 min.
    2. Dissolva la pallina in 300 μL di tampone di lisi/associazione dal kit di isolamento del mRNA di poli (a). Procedere all'estrazione del mRNA di poli (a) secondo il protocollo del produttore kit isolamento mRNA poli (a).
    3. Precipitare i campioni di mRNA mediante l'aggiunta di 1/10 di volume di 3 M NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
  3. frammentazione di mRNA
    1. Centrifugare i campioni di mRNA a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 sec, rimuovere il resto dell'etanolo con un gel-caricamento punta e asciugare all'aria il pellet per 5 min.
    2. Risospendere mRNA in 18 μL di acqua RNAsi-libera, aggiungere 2 μL di tampone di frammentazione di RNA 10x. Incubare per 5 minuti a 94° C. Tubo al ghiaccio di trasferimento.
    3. Precipitare con l'aggiunta di 1/10 di volume di 3 M NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.

4. defosforilazione

  1. Trattamento di impronta e frammentato campioni di mRNA con chinasi di polinucleotide T4. Per questo, centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con un suggerimento di caricamento del gel. Asciugare all'aria il pellet per 5 min.
  2. Risospendere il pellet in 7.75 µ l di acqua, aggiungere 1 µ l di buffer di 10 x T4 polinucleotide chinasi, 1 µ l della chinasi di polinucleotide T4 (10.000 U/mL) e 0,25 µ l di inibitore di RNAsi (20 U / µ l). Incubare 1h a 37 ° C.
  3. (Opzionale) Pre-corsa un gel di TBE-urea 15% a 180 V utilizzando 1 x TBE buffer per 15 min.
  4. Aggiungere 10 µ l di tampone TBE-urea: 2x a 10 µ l di ciascun campione Footprint e mRNA. Preparare un campione di controllo contenente 1 µ l di 10 del oligonucleotide di marcatore di dimensione superiore µM (32 nt), 1 µ l di 10 µM inferiore dimensione marcatore del oligonucleotide (28 nt), 8 µ l acqua e 10 µ l di tampone TBE-urea per campioni di impronta: 2x. Preparare un campione di controllo contenente 1 µ l di 10 del oligonucleotide di marcatore del RNA di µM (63 nt), 9 µ l acqua e 10 µ l di tampone TBE-urea per campioni di mRNA: 2x.
  5. Incubare i campioni e controlli 3 min a 75 ° C, rotazione verso il basso, mettere il ghiaccio per 1 min carico di ciascun campione in 2 pozzetti del gel 15% TBE-urea, frammenti di RNA separati mediante elettroforesi in gel a 180 V per 1 h.
  6. Macchia del gel per 5 min con una macchia di gel di acido nucleico (10.000 x diluito in acqua), proteggere dalla luce.
  7. Utilizzando un transilluminatore luce blu, tagliato la banda adeguata tra 28 e 32 marcatori di nt per impronta i campioni (Figura 4A) e circa 50-70 nt per mRNA campioni (Figura 4B) con una lama di rasoio pulita. Congelare i pezzi di gel di poliacrilammide a-80 ° C per almeno 10 min.
  8. Estrarre RNA da gel di poliacrilammide come segue. Il calore pezzi gel a 70 ° C per 2 min, macinare il gel utilizzando pellet monouso Pestelli. Eluire RNA con 300 µ l di tampone di eluizione (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA), aggiungere 1 inibitore di RNAsi µ l (20 U / µ l) e incubare a 37 ° C per 3 h.
  9. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C, raccogliere il surnatante e precipitare aggiungendo 1/10 di volume di NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.

5. 3'-adattatore legatura

  1. Centrifugare i campioni di mRNA e impronta a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento. Asciugare all'aria il pellet per 10 min.
  2. Risospendere il pellet in 4.75 µ l di acqua priva di nucleasi, 2 µ l di 50% PEG8000, 1 µ l di 10 X T4 RNA ligasi tampone, 1 µ l di 3'-adattatore (100 ng / µ l), 0,25 µ l di inibitore di RNAsi (20 U / µ l), 1 µ l di ligasi T4 RNA 2 troncata KQ (200.000 U/mL). Incubare per una notte a 16 ° C.
  3. La mattina successiva, rimuovere l'eccesso di adattatore aggiungendo 0,5 µ l di 5'-deadenylase (10 U / µ l) e 0,5 µ l di exonuclease J Rec (10 U / µ l) direttamente alla reazione di legatura. Incubare per 30 min a 30 ° C.
  4. Precipitare i campioni. Per questo, aggiungere 30 µ l di acqua priva di nucleasi, glicogeno di 1 µ l (10 mg/mL), 1/10 di volume di NaOAc (pH 5,5) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.

6. trascrizione inversa

  1. Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento. Asciugare all'aria il pellet per 10 min.
  2. Risospendere il pellet in 11,5 µ l di acqua priva di nucleasi, aggiungere 0,5 µ l delle 8 µM trascrizione inversa primer (RT) e 1 µ l di miscela del dNTP (10 mM). Incubare per 5 minuti a 65 ° C, posto sul ghiaccio.
  3. Aggiungere 4 µ l di 5 X primo buffer strand, 2 µ l di 0.1 M DTT, 0,5 µ l di inibitore di RNAsi (20 U / µ l), 0,5 µ l della trascrittasi inversa (200 U / µ l). Incubare per 30 min a 48 ° C, 1 min a 65 ° C, 5 min a 80 ° C.
  4. Non precipitare e procedere immediatamente all'idrolisi di RNA, con l'aggiunta di 0,8 µ l di NaOH M 2, incubare per 30 minuti a 98 ° C. Aggiungere 0,8 µ l 2M HCl per neutralizzare la reazione.
  5. Precipitare i campioni.
Per questo, aggiungere 20 µ l di acqua priva di nucleasi, glicogeno di 1 µ l (10 mg/mL), 1/10 di volume di NaOAc (pH 5,5) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
  • Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento. Asciugare all'aria il pellet per 10 min.
  • Risospendere il pellet in 5 µ l di acqua priva di nucleasi, aggiungere 5 µ l di tampone TBE-urea: 2x. Incubare per 3 minuti a 75 ° C, rotazione verso il basso, mettere il ghiaccio per 1 min.
  • (Opzionale) Pre-corsa un gel di TBE-urea 10% a 180 V utilizzando 1 tampone TBE 1x per 15 min.
  • Caricare l'esempio 1 bene il gel di TBE-urea 10%. Separare i prodotti della reazione di trascrizione inversa mediante elettroforesi in gel a 180 V per 50 min. Come controllo, preparare un campione contenente 1 µ l di primer di RT 2,5 µM, 1 µ l di 2,5 µM 128 nt marcatore del oligonucleotide, acqua di 3 µ l, e 5 µ l di 2 X TBE-urea buffer di esempio ed eseguire su una corsia separata del gel.
  • Macchia del gel per 5 min con una macchia di gel di acido nucleico (10.000 x diluito in acqua), proteggere dalla luce. Utilizzando un transilluminatore luce blu, tagliare la banda circa 128 nt e superiore (Figura 5) con una lama di rasoio pulita. Congelare i pezzi di gel di poliacrilammide a-80 ° C per almeno 10 min.
  • Il calore pezzi gel a 70 ° C per 2min, macinare il gel utilizzando pellet monouso Pestelli. Eluire il DNA con 300 µ l di 20 mM Tris-HCl a pH 7.0 e incubare a 37 ° C per 3 h.
  • Centrifugare il campione a 12.000 x g, per 5 min a 4 ° C, raccogliere il surnatante e precipitare aggiungendo 1/10 di volume di NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.

    • 7. circularization

    1. Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento e asciugare all'aria il pellet per 10 min.
    2. Risospendere il pellet in 16.75 µ l di acqua priva di nucleasi. Aggiungere 2 µ l di tampone di single-stranded DNA (ssDNA) ligasi, 1 µ l di 50mm MnCl2, 0,25 µ l di ssDNA ligasi 10x (100 U / µ l). Incubare per 1 h a 60 ° C, 10 min a 80 ° C. Non precipitare e conservare il prodotto di reazione di legatura ssDNA a-20 ° C.

    8. PCR biblioteca amplificazione

    1. Mentre lavoro su ghiaccio, mescolare in una provetta PCR i seguenti: 146 µ l di acqua priva di nucleasi, 2 µ l di 20 µM Forward primer, 2 µ l di primer Reverse indicizzati di 20 µM, 40 µ l di 5 x ad alta fedeltà del DNA plymerase buffer, 4 µ l di dNTP (10 mM), 4 µ l di prodotto di reazione di legatura ssDNA e 2 µ l di DNA polimerasi ad alta fedeltà. Scegliere un diverso indicizzati Reverse primer per ogni campione che verrà essere multiplexati per il sequenziamento. Trasferire un'aliquota di 50 µ l della miscela PCR in 4 nuove provette per PCR.
    2. Eseguire l'amplificazione di PCR con numero variabile di cicli (8, 10, 12, 14) utilizzando le seguenti impostazioni:
      1 min a 98 ° C denaturazione iniziale
      da 8 a 14 cicli:
      15 s a 94 ° C
      5 s a 55 ° C
      10 s a 65 ° C
      2 min a 65 ° C estensione finale
    3. Precipitare il prodotto PCR con l'aggiunta di 1/10 di volume di 3 M NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
    4. Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento e asciugare all'aria il pellet.
    5. Risospendere il pellet in 8 µ l di acqua priva di nucleasi, aggiungere 2 µ l di non-denaturante dell'acido nucleico sample buffer 5x. Caricare l'esempio su 1 bene di un gel TBE 8% non-denaturante. Separare i prodotti di DNA mediante elettroforesi in gel a 150 V per 35 min. Come controllo, preparare un campione contenente 0,5 µ l di 10 bp DNA ladder (1 µ g / µ l), 7,5 µ l acqua e 2 µ l di non-denaturante dell'acido nucleico sample buffer 5x ed eseguire su una corsia separata del gel.
    6. Macchia del gel per 5 min con una macchia di gel di acido nucleico (10.000 x diluito in acqua), proteggere dalla luce. Utilizzando un transilluminatore luce blu, tagliare la banda intorno 150 bp per campioni di impronta e circa 180 bp per campioni di mRNA (Figura 6) con una lama di rasoio pulito. Conservare i pezzi di gel a-80 ° C per almeno 10 min.
    7. Il calore pezzi gel a 70 ° C per 2 min, macinare il gel utilizzando pellet monouso Pestelli. Eluire il DNA con 300 µ l di 20 mM Tris-HCl a pH 7.0 e incubare a 37 ° C per 3 h.
    8. Centrifugare il campione a 12.000 x g, per 5 min a 4 ° C, raccogliere il surnatante e precipitare aggiungendo 1/10 di volume di NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
    9. Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento e asciugare all'aria il pellet. Infine, risospendere le librerie in 20 µ l di acqua priva di nucleasi e procedere alla quantificazione, controllo qualità e sequenziamento.

    9. Biblioteca quantificazione e High-throughput sequenziamento

    1. Prima di inviare i campioni per il sequenziamento, determinare la resa e la qualità delle librerie di PCR-amplificato. Profili rappresentativi per impronta e mRNA sequenziamento librerie sono mostrati nella Figura 7. La dimensione prevista della biblioteca PCR-amplificato è 148-152 bp per campioni di impronta e 170-190 bp per campioni di mRNA.
    2. Se diversi campioni con differenti codici a barre saranno riuniti per la sequenza, eseguire accurata quantificazione delle librerie usando un'analisi di quantificazione biblioteca qPCR di sequenziamento.
    3. Piscina le librerie nei rapporti equimolare. Calcolare il volume totale della piscina come 3 µ l x numero totale di campioni da mettere in comune. Determinare il volume di ogni libreria che deve essere aggiunto in modo che le librerie sono mescolate nei rapporti equimolari per ottenere la concentrazione finale di 10 nM della piscina. Aggiungere i volumi calcolati di ogni libreria in una nuova provetta da 1,5 mL, mescolare pipettando. Aggiungere acqua per ottenere il volume totale calcolato. Librerie di negozio in pool a-20 ° C.
    4. Invia un'aliquota della biblioteca in pool da sequenziare usando 50 bp monolato sequencing in una piattaforma di sequenziamento Illumina. Abbiamo ordinariamente multiplex 12 campioni in un singolo sequenziamento eseguire, quali rendimenti ~ 200 milioni legge per corsia di sequenziamento.
      Nota: Il numero finale di impronta letture raccolti per ogni campione dipende la quantità del materiale in ingresso e il livello di contaminazione del rRNA.

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    Risultati

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    Sono state dettagliate condotte per analisi bioinformatica del ribosoma profiling dei dati descritto in precedenza 8,9. Inoltre, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato strumenti bioinformatici per l'analisi dell'espressione genica differenziale e trattamento dei dati di sequenziamento, che sono specifici per ribosoma profilatura metodo 10,11,

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    Discussione

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    L'approccio di Ribo-Seq è emerso come una potente tecnologia per l'analisi del mRNA traduzione in vivo presso il genoma di livello 3. Gli studi che utilizzano questo approccio, che permette di monitorare la traduzione con risoluzione di singolo-codone, ha contribuito alla nostra comprensione della regolazione traduzionale. Nonostante i suoi vantaggi, Ribo-Seq presenta diverse limitazioni. Frammenti di RNA ribosomiale (rRNA) sono sempre co-purificate durante l'isolamento delle orme protett...

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    Dichiarazioni

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

    Ringraziamenti

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute AG040191 e AG054566 di VML. Questa ricerca è stata condotta mentre VML era un destinatario AFAR Research Grant della Federazione americana per la ricerca di invecchiamento.

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    Materiali

    Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
    NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
    0,45 μ Filtri a membrana MMilliporeHVLP04700
    0,5 M EDTAInvitrogenAM9261
    Filtri centrifughi 0,5 mL (100 kDa MWCO)MilliporeUFC510024
    1 M Tris-HCl, pH 7,0InvitrogenAM9850G
    1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 a 4 gradi; C)Invitrogen15567-027
    10X tampone TBEInvitrogenAM9863
    10% TBE-urea gelInvitrogenEC6875BOX
    15% TBE-ureagel InvitrogenEC6885BOX
    2 M MgCl2RPIM24500-10.0
    2X TBE-urea tamponecampione InvitrogenLC6876
    3M NaOAc, pH 5,5InvitrogenAM9740
    5' Deadenilasi (10 U/μ L)EpicentroDA11101K
    5X Tampone di caricamento del campione di acido nucleicoBio-Rad161-0767
    8% TBEgel InvitrogenEC6215BOX
    Acido-Fenolo:Cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)InvitrogenAM9722
    Transilluminatore a luce bluClare Chemical ResearchDR-46B
    Perline in acciaio cromato, 3,2 mmBioSpec Products11079132c
    CryogrinderBiospec prodotto3110BX
    CicloesimideRPIC81040-5.0
    Sistema di acquisizione datiDATAQ InstrumentsDI-245
    Miscela di soluzioni di deossinucleotide (dNTP) (10 mM)NEBN0447L
    GlycogenInvitrogenAM9510
    Sistema di frazionamento a gradienteBrandelBR-184X
    DNA polimerasi ad alta fedeltà (2.000 U/mL)NEBM0530SFornito con tampone Phusion HF 5X
    Kit di quantificazione della libreria di sequenziamento di nuova generazioneKapa BiosystemsKK4824
    Colorante su gel di acido nucleicoInvitrogenS11494
    Ultracentrifuga Optima XE-90Beckman CoulterA94471
    Kit di isolamento dell'mRNA Poly(A)Invitrogen61011
    Rec J esonucleasi (10 U/μ L)EpicentroRJ411250
    Trascrittasi inversa (200 U/μ L)Invitrogen18080093Fornito con tampone 5X per il primo filamento e tampone
    frammentazione dell'RNANEBE6186A
    RNasi I (100 U/μ L)InvitrogenAM2295
    Inibitore della RNasi (20 U/μ L)InvitrogenAM2696
    Tappi in gomma siliconica BioSpecProducts2008
    ssDNA ligasi (100 U/μ L)EpicentroCL9021KFornito con 10 tamponi CircLigase II e 50 mM di MnCl2
    Stainless steel microfiales, 1,8 mLBioSpec Products2007
    SaccarosioRPIS24060-5000.0
    SW-41 Ti rotoreBeckman Coulter331362
    Pompa a siringaEra PumpSystems NE-300
    Polinucleotide chinasi T4 (10.000 U/mL)NEBM0201SFornito con 10X tampone polinucleotidico chinasico
    T4 RNA ligasi T4 troncato KQ (200.000 U/mL)NEBM0373SFornito con 10X tampone RNA ligasi T4 e 50% PEG8000
    TermociclatoreBio-Rad1851148
    Provette in poliallomero a parete sottile, 13,2 mLBeckman Coulter331372
    Triton X-100Monitor UV Sigma AldrichX100-100ML
    Bio-Rad7318160
    Saccharomyces cerevisiae ceppo BY4741Open BiosystemsYSC1048
    di DTT 0,1 M New

    Riferimenti

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