Articolo metodologico

Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

DOI:

10.3791/56827

⸱

25 gennaio 2018

 ,  , 
1Muscle Health Research Centre, York University, 2School of Kinesiology and Health Science, York University, 3National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive l'uso del modello di attività contrattile cronica di esercizio per osservare gli adattamenti indotti da stimolazione del muscolo scheletrico nell'arto posteriore del ratto.

Abstract

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Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente adattabile, poichè le proprietà biochimiche e fisiologiche sono notevolmente alterate in risposta all'esercizio cronico. Per studiare i meccanismi di fondo che portano a vari adattamenti muscolari, un numero di protocolli di esercizio come tapis roulant, ruota running e nuoto esercizio è stato utilizzato negli studi sugli animali. Tuttavia, questi modelli di esercitazione richiede un lungo periodo di tempo per raggiungere adattamenti muscolari, che possono anche essere regolamentati da fattori umorali o neurologici, limitando le loro applicazioni nello studiare gli adattamenti indotti da contrazione muscolo-specifico. La stimolazione indiretta bassa frequenza (10 Hz) per indurre l'attività contrattile cronica (CCA) è stata utilizzata come modello alternativo per l'allenamento, come correttamente può portare ad adattamenti mitocondriale muscolare entro 7 giorni, indipendente da fattori sistemici. Questa carta descrive in dettaglio le tecniche chirurgiche necessari per applicare il trattamento di CCA a muscolo scheletrico di ratti, per studi di applicazione diffusa in futuro.

Introduzione

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Muscolo scheletrico può adattarsi per esercitare attività di formazione attraverso i cambiamenti nella sua bioenergetica e struttura fisica1. Una delle principali alterazioni provocate da allenamento di resistenza è la biogenesi mitocondriale, che può essere valutata da un aumento nell'espressione di componenti mitocondriali (ad es., le unità secondarie del citocromo c ossidasi [COX]), così come l'espressione di il coactivator transcriptional, PGC-1 α2. Un crescente numero di studi hanno indicato che numerosi altri fattori, tra cui fatturato mitocondriale e mitophagy, sono anche importanti per l'adattamento del muscolo. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali esercizio acuto o cronico regolano questi processi in muscolo scheletrico sono ancora poco chiari.

Per delineare le vie che regolano gli adattamenti indotti dall'esercizio muscolare, vari modelli di esercizio sono stati utilizzati comunemente negli studi nei roditori, tra cui tapis roulant, corsa ruota e il nuoto esercizio. Tuttavia, questi protocolli hanno alcune limitazioni, in quanto sono necessarie ~ 4-12 settimane per osservare questi cambiamenti fenotipici3,4,5. Come metodo alternativo sperimentale, bassa frequenza indotta da stimolazione cronica attività contrattile (CCA) è stato effettivamente utilizzato, come può portare ad adattamenti muscolari in un periodo sostanzialmente più corto (cioè, fino a 7 giorni) e suoi effetti sembrano essere paragonabile o addirittura superiore di altri protocolli di esercizio. Inoltre, la presenza di ormonale6, temperatura7ed effetti neurologici8 può rendere difficile capire muscolo-specifiche risposte all'esercizio cronico. Ad esempio, dell'ormone tiroideo9,10 e fattore di crescita insulino-simile (IGF) -111 sono stati identificati per mediare adattamenti indotto dall'allenamento del muscolo, che possono regolare anche altre vie di segnalazione in scheletrico muscolo. In particolare, gli effetti indotti da CCA minimamente sono regolati da fattori sistemici, che permette di concentrare attenzione sulla risposta diretta del muscolo scheletrico all'attività contrattile.

L'unità esterna per CCA fu introdotto da Tyler e Wright12ed è stato sviluppato con modifiche12. In breve, l'unità si compone di tre parti principali: un rivelatore ad infrarossi che può essere attivato e disattivata tramite l'esposizione a luce infrarossa, un generatore di impulsi e un indicatore del polso (Figura 1). Il disegno di circuito dettagliate dell'unità stimolatore è stato descritto in precedenza13. Le caratteristiche dettagliate e specifiche di CCA possono essere trovate maggiore profondità in un numero di revisione articoli14,15,16,17. In breve, il protocollo di stimolazione è progettato per attivare il nervo peroneo comune a bassa frequenza (cioè, 10 Hz), e i muscoli innervati (tibiale anteriore [TA] e muscolo estensore digitorum longus [EDL]) sono costretti a contratto per un lunghezza predeterminata di tempo (ad esempio, 3-6 h). Nel corso del tempo, questo sposta i muscoli di cui sopra ad un fenotipo più aerobico, dimostrato da un aumento della densità capillare18 sia contenuto mitocondriale19,20,21. Pertanto, questo metodo è un modello collaudato di imitare alcuni degli adattamenti formazione resistenza principali all'interno del muscolo scheletrico di ratti.

Questa carta presenta una procedura dettagliata della chirurgia l'impianto dell'elettrodo per indurre CCA in modo che i ricercatori possono applicare questo modello nei loro studi di esercizio. CCA è un eccellente modello per studiare il corso di tempo degli adattamenti muscolari, fornendo così un efficace strumento per l'indagine sui vari eventi molecolari e segnalazione ad entrambi i punti tempo presto e tardi segue l'inizio dell'allenamento fisico.

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Protocollo

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Tutte le procedure relative agli animali erano esaminate e approvate dal comitato di cura di York University degli animali. All'arrivo presso la struttura animale all'Università di York, tutti i ratti sono stati dati un minimo di cinque giorni per acclimatarsi al loro ambiente prima della procedura chirurgica, con cibo fornito ad libitum. Anche se questo protocollo è stato applicato in precedenza per altre specie15,17,22, la carta corrente si basa sul lavoro pionieristico di Pette e colleghi23 e si concentra sul modello del ratto, in particolare.

1. preparazione dell'unità di attività contrattile cronica

  1. Utilizzando un voltmetro, controllare il potenziale delle batterie al litio moneta.
    Nota: Il potenziale di ogni batteria deve essere 3.0 ± 0,10 V.
  2. Inserire due o tre batterie nello slot dell'unità in modo che il potenziale totale è 6-9 V.
    Nota: È a discrezione dei ricercatori a considerare quanto potenziale (6 o 9 V) per mantenere durante la procedura intera sperimentale. Secondo lo studio di progettazione e l'intensità desiderata dello stimolo, 2 o 3 batterie possono essere usate.
  3. Verificare che l'unità stia funzionando correttamente tramite l'indicatore di impulso, di esporre l'unità a 1 impulso emesso da una portatile luce stroboscopica ad infrarossi.

2. intervento chirurgico di attività contrattile cronica

Nota: Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima della procedura chirurgica. Durante e immediatamente dopo l'intervento chirurgico, la temperatura corporea dei topi è mantenuta da un rilievo di riscaldamento. È preferibile eseguire l'intervento chirurgico su un telo chirurgico. Il chirurgo deve indossare guanti chirurgici sterili, nonché un camice da laboratorio pulito. Se necessario, si consiglia di indossare una maschera respiratore monouso.

  1. Anestetizzare ratti sotto 1-3% isoflurane inalazione con l'ossigeno, che è gestito da un sistema di Vaporizzatore gas. Confermare l'animale è completamente sedata controllando hindlimb pizzico di punta e osservando la frequenza e profondità respiratoria. Applicare il lubrificante oculare sugli occhi per evitare la secchezza. Applicare un'iniezione sottocutanea di Meloxicam (0,5 mg/mL) a 2 mg/kg.
    Nota: Si consiglia inoltre di avere un'applicazione multi-modale di analgesia (ad es., Meloxicam più lidocaina) per ridurre al minimo qualsiasi dolore durante e dopo l'intervento chirurgico.
  2. Delicatamente Radere l'arto posteriore sinistro, come pure una striscia intorno al tronco dalla parte posteriore del collo, intorno alle spalle degli arti anteriori e attraverso il torace anteriore. Strofinare delicatamente le zone rasate con iodio e alcol etilico per disinfettare.
  3. Con l'animale che pone sul suo stomaco, praticare una piccola incisione (~0.5 cm) sul retro del collo al centro della regione rasata (l'area palpabile tra scapole) usando un bisturi (lama n. 10).
  4. Individuare il nervo peroneo comune.
    1. Animale sul suo lato destro del rullo e fare un ~ 2-3 cm-lungo taglio nella pelle dell'arto posteriore sinistro. L'area di incisione intorno i gruppi muscolari di coscia superiore che è monumentale tra la fossetta dell'articolazione del ginocchio e la parte posteriore vicino all'origine della coda di destinazione.
      Nota: Fare attenzione a non contaminare la prima area di incisione quando si cambia la posizione del corpo.
    2. Utilizzando punte blunt curvo forbici chirurgiche, sezionare la zona sottocutanea ampiamente ~3.5 - 4 cm, che separa la pelle dal muscolo sottostante al fine di rendere una tasca tra la pelle aperta e muscolo sottostante. Aprire la pelle dal tessuto di fondo su tutta la circonferenza dell'incisione (~1.5 cm2).
    3. Praticare una piccola incisione (meno di 0,5 cm) sul muscolo bicipite femorale con forbici chirurgiche, assicurando che le punte delle forbici sono di taglio basso direttamente attraverso il muscolo.
    4. Aprire delicatamente la zona del taglio fino a quando i gruppi muscolari interna e il nervo peroneo comune sono visibili (la profondità dei tessuti muscolari esterne (cioè, bicipite femorale) è di circa ~0.5 cm). Utilizzando forcipe, delicatamente tocco/pizzico il nervo visibile e osservare le risposte dei gruppi muscolari di destinazione (ad es., TA muscolo) e dita dei piedi (visibile dorsiflexion) per confermare che il nervo peroneo comune è isolato.
      Nota: Questo passaggio deve essere effettuato con estrema cautela per evitare di tagliare o danneggiare il nervo.
    5. Fissare la finestra tirandola aperta con metallo divaricatori tale che la dimensione della finestra è ~1.5 cm2 con il nervo peroneo che si trova al centro della finestra. Utilizzare il piccolo gancio metallico collegato a cinghie e/o elastici che vengono fissate alla superficie del tavolo (o bordo di chirurgia) (Figura 2A).
  5. Fissare il cavo a entrambi i lati del nervo.
    1. Preparazione di ~ 50-60 cm di politetrafluoroetilene (PTFE)-rivestito di filo di acciaio sottile e piegarlo a metà.
      Nota: Potrebbe essere utile per esporre PTFA-rivestito filo sotto la luce UV prima dell'intervento.
    2. Agganciare la parte piegata del filo nella fessura di una canna di acciaio inox lungo cm 30. Passare l'asta, insieme con il filo, per via sottocutanea da tasca aperta del hindlimb verso l'area piccola incisione sul retro del collo, in un modello di L-forma fino alla gamba e lungo il centro della schiena.
    3. Trovare le due estremità del filo presso l'arto posteriore. Spelare i fili dal momento che tutti i fili sono isolati in PTFE. Con attenzione usando un bisturi, spelare le estremità del filo di ~1.5 cm. Se i fili diventano sfilacciati, ritagliale e ri-strip. Avvolgere le estremità dei conduttori spogliato intorno ad un ago 21G smussata (5 volte), rendendo una bobina. Una volta che le bobine siano state effettuate correttamente, rimuovere l'ago da loro.
    4. Utilizzando una dimensione di seta chirurgica 6-0, fissare ciascuna delle bobine su entrambi i lati del nervo peroneo comune (Figura 2A).
      1. Fare un nodo alla fine della bobina e si sutura sul lato sinistro del nervo. Assicurarsi che la bobina sia 1.5-2.5 mm dal nervo.
      2. Per fissare la bobina, applicare due o tre suture supplementari lungo la bobina.
      3. Ripetere questi passaggi sul lato destro del nervo.
    5. Applicare 2-3 gocce di soluzione antibiotica (ampicillina in soluzione salina; 132 mg/mL) e quindi con attenzione la finestra (cioè, tessuto del muscolo bicipite femorale) usando la seta di dimensioni 5-0 suturare.
  6. Senza bloccare vento slack rimanenti di filo (circa il diametro del dito indice) e spingere la tasca sottocutanea sopra l'incisione suturata del muscolo bicipite femorale (circa sopra l'anca).
  7. Applicare 2-3 gocce di soluzione antibiotica nuovamente (ampicillina in soluzione salina; 132 mg/mL). Chiudere la pelle aperta di pinzatura.
  8. Collegare i fili (che fuori dell'area di incisione del collo) per lo stimolatore CCA.
    1. Collegare prese pin con i fili.
      1. Tagliare l'anello del filo che esce l'incisione nella parte superiore del collo per creare 2 estremità del filo (questi conducono le bobine suturato ai lati del nervo peroneo).
      2. Usando un bisturi, spelare le estremità dei fili da ~0.5 cm. tagliare i fili sfilacciati, se presente.
      3. Lentamente spingere le parti spogliate dei cavi nel foro delle prese pin e utilizzando un saldatore, saldare i fili sulle prese pin.
    2. Facoltativamente, selezionare la connessione dei cavi.
      1. Collegare i pin ad un'unità di stimolatore grande benchtop tramite morsetti a coccodrillo.
      2. Fornire un singolo impulso di 9 V (0,1 ms, 10 Hz) per confermare che TA muscoli contratti e sinistra piede dorsiflexes.
    3. Passare le estremità dei conduttori collegati pin attraverso il tampone di garza sterile che è ~ 4 x 4 cm.
    4. Collegare i pin per l'unità di stimolatore CCA.
      1. Passare i cavi attraverso il foro nella base della casella di stimolatore.
        Nota: Questa casella è una camera fatta in casa per l'unità di stimolatore CCA ed è 3,5 cm × 3,5 cm × 2,5 cm13.
      2. Inserire le spine nelle prese di connessione dell'unità di CCA. Inserire delicatamente l'unità CCA nel vano. Utilizzare una virata appiccicosa per fissare l'unità CCA nella parte inferiore della camera.
    5. Utilizzando un nastro atletico o il nastro chirurgico poroso, difficoltà della camera con nastro adesivo intorno il torso rasato. Chiudere il coperchio dell'alloggiamento con tre strati di nastratura e finire avvolgendo un nastro intorno ai lati della finestra di stimolatore per garantire la casella (Figura 2B).
  9. Verifica se il CCA sta lavorando di esporre l'unità a un singolo impulso di luce infrarossa (spettro di lunghezza d'onda > 770 nm) che viene emesso da una portatile luce stroboscopica ad infrarossi.
    Nota: Se il CCA è correttamente funzionante, i ricercatori sarà in grado di vedere che i muscoli del hindlimb (cioè, TA) sono contraenti in risposta alla luce a infrarossi.
  10. Il ratto di osservare e monitorare la temperatura fino a quando non ha pienamente riacquistato coscienza. Casa in una gabbia di singolo occupante per prevenire qualsiasi danno da altri animali e non lasciare alcun tunnel o oggetti di plastica nella gabbia per il resto dello studio per mitigare il rischio di danni all'apparecchio stimolatore o lesioni all'animale. Alimentazione con una bottiglia di acqua incluso Amoxicillin (0,5 mg/mL).
  11. Applicare la dose di 1 mg/kg di Meloxicam per via sottocutanea ogni 24 h dopo l'intervento chirurgico, che continua almeno per 72 h.

3. cronica attività contrattile

  1. Dopo l'intervento chirurgico, consentire almeno 5-7 giorni per un pieno recupero dell'incisione e zone di sutura in/intorno i muscoli scheletrici.
    Nota: Durante e dopo la procedura CCA, controllare accuratamente la condizione di ogni animale osservando i loro comportamenti (ad es., mangiare, bere, e/o in movimento). Inoltre, determinare qualsiasi stress grave o effetti negativi verificando un cambiamento di peso corporeo prima e dopo la procedura CCA.
  2. Il giorno di stimolazione di CCA, accendere CCA esponendo l'unità stimolatore ad un singolo impulso di luce infrarossa (lunghezza d'onda > 770 nm) da una portatile luce stroboscopica ad infrarossi.
  3. Applicare 3 o 6 h di stimolazione CCA 10 Hz.
    Nota: I tempi per la stimolazione è fino al ricercatore. La frequenza di stimolazione non è mai stata alterata in questi esperimenti, e solo molto modesti miglioramenti nell'adattamento mitocondriale sono state osservate estendendo la stimolazione da 3 a 6 ore al giorno, nella nostra esperienza. Se possibile, controllare la stimolazione e l'animale ogni 30-60 min.
  4. Successivamente al periodo CCA desiderato, spegnere l'unità CCA tramite esposizione alla luce a infrarossi (stessa procedura di accensione dell'unità).
  5. Se l'applicazione di più giorni, ripetere il passo 3.2. 3.4.
  6. Determinare i tempi di raccolta del tessuto. Ad esempio, raccogliere tessuti 24 h dopo l'inizio del combattimento finale di CCA (cioè, 18 h dopo l'ultima stimolazione di CCA di 6 h), che si svolge sotto l'anestesia, come fatto durante la procedura chirurgica di CCA. Immediatamente dopo aver raccolto tutti i tessuti, eutanasia animali asportando il cuore mentre l'animale è ancora sotto anestesia.

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Risultati

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Abbiamo dimostrato che l'attività contrattile cronica (CCA) è uno strumento efficace per indurre adattamenti favorevoli mitocondriali nel muscolo scheletrico. I ratti sottoposti a 7 giorni di CCA (6 h al giorno) visualizzare rafforzata la biogenesi mitocondriale nel muscolo stimolato rispetto l'arto posteriore non stimolate controlaterale (controllo). Questo aumento della biogenesi mitocondriale è indicato dall'espressione aumentata della proteina di PGC-1 α (Figura 3...

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Discussione

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Il modello di attività contrattile cronica (CCA) di esercizio, attraverso il muscolo bassa frequenza stimolazione in vivo, è un eccellente modello per studiare gli adattamenti fenotipica del muscolo per esercitare13,24,25 , 26. come dimostrato in precedenti studi20,27, CCA è un efficace strumento mediante il quale i ricercatori...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Siamo grati a Liam Tyron per la sua lettura esperta del manoscritto. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti dalle scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) D. A. cappa. D. A. Hood è anche titolare di un Canada Research Chair in fisiologia cellulare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sprague Dawley RatCharlesRiver Strain 400
Unità di attività contrattile cronicaper unità CCA n/afatta in casa
(3,5 x 3,5 x 2,5 cm)Fatta in casan/aLa scatola deve essere realizzata in materiale opaco o coperta da un nastro opaco
Batterie agli ioni di litio a bottone (3V)PanasonicCR2016
MedwireLeico Industries316SS7/44T
Pin a saldare (presa)Digi-KeyED6218-ND
Nastro porosoZonas Johnson & Johnson5104
Seta da sutura (Misura 5)Ethicon640G
Seta da sutura (Misura 6)Ethicon706G
Forbice smussata curva (Lunghezza 11,5 cm)F.S.T.14075-11
Forbice smussata curva (lunghezza 15 cm)F.S.T.14111-15
Pinze emostatiche delicate (lunghezza 16 cm)Lawton06-0230
ScalpelFeather3
Pinze curveF.S.T.11052-10
Asta in acciaio inox (30 cm; diametro 7 mm)Fatta in casan/aL'asta deve avere una fessura di 5 mm in un'estremità per trattenere il filo per il tunneling sotto la pelle Pinza per l'applicazione di
clipKLS Martin20-916-12
Graffe (clip)BbraunBN507R
Ganci/divaricatore in metalloFatto in casan/a
Povidone-iodio (500 mL)Rougier#NPN00172944
Ampicillina sodicaNovopharm#DIN00872644
MetacamBoehringer#DIN02240463
Multimetro digitale (voltmetro)Soar CorporationME-501
LED stroboscopio digitaleLutron Electronic EnterpriseDT-2269
Scatola protettiva

Riferimenti

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