Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Saman Saeidi; Michael R. McKain; Elizabeth A. Kellogg

doi:10.3791/56837

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Articolo metodologico

Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

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DOI:

10.3791/56837

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8 marzo 2018

Saman Saeidi^*¹ , Michael R. McKain^*¹^,² , Elizabeth A. Kellogg¹

¹Donald Danforth Plant Science Center, ²Department of Biological Sciences, The University of Alabama

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo viene illustrato un protocollo dettagliato per isolamento di DNA e la costruzione della libreria sequenziamento ad alte prestazioni da materiale di erbario tra cui salvataggio di eccezionalmente scarsa qualità del DNA.

Abstract

Gli erbari sono una preziosa fonte di materiale vegetale che può essere utilizzato in una varietà di studi biologici. L'uso di campioni di erbario è associato con una serie di sfide tra cui qualità di conservazione del campione, DNA degradato e campionamento distruttivo di rari esemplari. Per poter utilizzare in modo più efficace materiale di erbario in progetti di sequenziamento di grandi dimensioni, è necessario un metodo affidabile e scalabile di preparazione di isolamento e libreria di DNA. Questa carta dimostra un protocollo robusto, inizio-to-end per DNA alto-rendimento e isolamento costruzione della libreria da esemplari che non richiedono la modifica di singoli campioni. Questo protocollo è su misura per la bassa qualità secchi pianta materiale e approfitta dei metodi esistenti ottimizzando tessuto rettifica, modifica selezione dimensione biblioteca ed introducendo un passo opzionale reamplification per librerie di basso rendimento. Reamplification di librerie di basso rendimento del DNA può salvare i campioni provenienti da campioni di erbario potenzialmente preziosi e insostituibili, negando la necessità per ulteriore campionamento distruttivo e senza introdurre bias di sequenziamento discernibile per comune applicazioni filogenetiche. Il protocollo è stato testato su centinaia di specie di erba, ma dovrebbe essere adatto per l'impiego in altri lignaggi pianta dopo la verifica. Questo protocollo può essere limitato dal DNA estremamente degradato, dove non esistono frammenti nel campo dimensione desiderata, e di metaboliti secondari presenti in alcuni materiale vegetale che inibiscono pulito isolamento del DNA. Nel complesso, questo protocollo introduce un metodo veloce e completo che permette di isolamento del DNA e preparazione della biblioteca di 24 campioni in meno di 13 ore, con solo 8 h di tempo attivo hands-on con modifiche minime.

Introduzione

Erbario collezioni sono una fonte potenzialmente importante di entrambe le specie e diversità genomica per studi compreso phylogenetics¹^,²^,³, genetica delle popolazioni⁴^,⁵, conservazione biologia⁶, specie invasive biologia⁷e tratto evolution⁸. La capacità di ottenere una ricca diversità di specie, popolazioni, luoghi geografici e punti di tempo mette in evidenza il "forziere"⁹ che è l'erbario. Storicamente, la natura degrad....