Arricchimento delle lipoproteine batteriche e preparazione del N-terminale lipopeptidi per determinazione strutturale mediante spettrometria di massa

Krista M. Armbruster; Timothy C. Meredith

doi:10.3791/56842

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Articolo metodologico

Arricchimento delle lipoproteine batteriche e preparazione del N-terminale lipopeptidi per determinazione strutturale mediante spettrometria di massa

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DOI:

10.3791/56842

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21 maggio 2018

Krista M. Armbruster¹ , Timothy C. Meredith¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University

In questo articolo

Sommario

L'arricchimento delle lipoproteine batteriche mediante una fase di tensioattivo non ionico metodo di partizionamento è descritto per uso diretto in saggi TLR o altre applicazioni. Ulteriori iniziative sono dettagliate per preparare lipopeptidi triptico N-terminale per la caratterizzazione strutturale mediante spettrometria di massa.

Abstract

Le lipoproteine sono costituenti importanti della busta delle cellule batteriche e potenti attivatori della risposta immunitaria innata dei mammiferi. Nonostante la loro importanza nella fisiologia cellulare e di immunologia, molto resta ancora da scoprire sulle forme di romanzo della lipoproteina, come essi sono sintetizzati e l'effetto delle varie forme su immunità dell'ospite. Per attivare studi approfonditi sulle lipoproteine, questo protocollo descrive un metodo per l'arricchimento della lipoproteina batterica e preparazione del N-terminale triptico lipopeptidi per determinazione strutturale di matrix-assisted laser desorbimento ionizzazione-tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS). Espandendo una consolidata fase di Triton X-114 metodo per l'estrazione della lipoproteina e arricchimento dalla membrana cellulare batterica di partizionamento, il protocollo include ulteriori passaggi per rimuovere i contaminanti non-lipoproteina, aumentano il rendimento della lipoproteina e purezza. Poiché le lipoproteine sono comunemente usate nelle analisi di recettori Toll-like (TLR), è fondamentale innanzitutto caratterizzano la struttura del N-terminale di MALDI-TOF MS. qui, viene presentato un metodo per isolare peptidi idrofobi concentrati arricchiti in N-terminale lipopeptidi adatti per l'analisi diretta di MALDI-TOF MS/MS. lipoproteine che sono stati separati da sodio solfato elettroforesi dodecilica del Gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) sono trasferito ad una membrana di nitrocellulosa, digeriti in situ con tripsina, in sequenza lavata per rimuovere peptidi triptici polar e infine eluito con cloroformio-metanolo. Quando accoppiato con MS dei peptidi trypsinized più polari da soluzioni di lavaggio, questo metodo fornisce la capacità di identificare la lipoproteina e caratterizzano la sua estremità N-terminale in un singolo esperimento. Formazione del complesso di sodio intenzionale può essere impiegato anche come strumento per promuovere più spettri di frammentazione strutturalmente ben informato. In definitiva, arricchimento delle lipoproteine e determinazione delle loro strutture di N-terminale permetterà studi più approfonditi su questa onnipresente classe di proteine batteriche.

Introduzione

Lipoproteine batteriche sono caratterizzate da una N-terminale del lipido-modificato cisteina conservato che le ancore il dominio globulare proteina alla superficie della membrana cellulare. Essi sono distribuiti universalmente nei batteri, che costituiscono il 2 e il 5% di tutti i geni cellulari all'interno di un tipico genoma¹. Lipoproteine giocano un ruolo critico in un'ampia varietà di processi cellulari, tra cui l'assorbimento di nutrienti, trasduzione del segnale, assemblaggio di complessi proteici e nel mantenimento delle cellule busta integrità strutturale². Batteri patogeni, lipoproteine servono come fattori di ....