Il cluster regolarmente intervallate proteine brevi ripetizioni/CRISPR palindromi associato 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornisce uno strumento promettente per l'ingegneria genetica e apre la possibilità di integrazione mirata dei transgeni. Descriviamo un fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-base di strategia per DNA efficiente mirata integrazione in vivo e mirate terapie geniche utilizzando CRISPR/Cas9.
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Articolo metodologico
Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Come una promettente piattaforma di editing del genoma, il sistema CRISPR/Cas9 ha un grande potenziale per la manipolazione genetica efficiente, soprattutto per l'integrazione mirata dei transgeni. Tuttavia, a causa della scarsa efficienza di ricombinazione omologa (HR) e le varie mutazioni indel di non-omologo fine unirsi (NHEJ)-basato su strategie in cellule di divisione, in vivo genome pubblica rimane una grande sfida. Qui, descriviamo una fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-CRISPR/Cas9 sistema efficiente in vivo precisa mirata integrazione basato. In questo sistema, il genoma mirato e il donatore vector contenente armi di omologia (~ 800 bp) fiancheggiato da destinazione di RNA (sgRNA) guida singola sequenze sono spaccate da CRISPR/Cas9. Questa strategia basata su HMEJ realizza integrazione efficiente transgene in zigoti del mouse, così come in epatociti in vivo. Inoltre, una strategia basata su HMEJ offre un approccio efficace per la correzione di fumarylacetoacetate idrolasi (Fah) mutazione negli epatociti e Salva Fah-deficit indotto da topi di insufficienza epatica. Presi insieme, concentrandosi su mirata integrazione, questa strategia basata su HMEJ fornisce uno strumento promettente per una varietà di applicazioni, inclusa la generazione di modelli animali geneticamente modificati e terapie geniche mirate.
Introduzione
L'editing genomico precisa, mirata è spesso necessaria per la produzione di modelli animali geneticamente modificati e terapie cliniche. Molto sforzo è stato fatto per sviluppare varie strategie per efficiente genoma mirata modifiche, ad esempio l'apparato nucleasi a dita zinco (ZFN), nucleasi di trascrizione attivatore-come effettore (TALENs) e sistemi di CRISPR/Cas9. Queste strategie creare rotture a doppio filamento del DNA mirate (DSB) nel genoma e trarre vantaggio intrinseci sistemi di riparazione del DNA, come ricombinazione omologa (HR)1,2, basi-mediata fine unirsi (MMEJ)3 ,....
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Protocollo
Tutte le procedure tra cui animali soggetti sono state approvate dal comitato etico di ricerca biomedica presso gli istituti di Shanghai per scienze biologiche (CAS).
1. progettazione dei plasmidi di donatore
-
Selezione di sgRNA
- Utilizzare strumenti di progettazione online CRISPR per prevedere sgRNAs la destinazione regione11,12,13,14,15. Per il locus di Cdx2 , progettare sei diversi sgRNAs (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6)....
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Risultati
Editing basato su HMEJ genomico in embrioni di topo: Per definire l'efficienza knock-del metodo basato su HMEJ in zigoti mouse, abbiamo consegnato Cas9 mRNA, sgRNA targeting del gene Cdx2 e il donatore HMEJ in zigoti del mouse, che è stato progettato per fondere un gene reporter p2A-mCherry al codone ultimo di Cdx2 gene (Figura 2A). Gli zigoti iniettati sviluppato in blastocisti nella cultura. Per valutare l.......
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Discussione
I passaggi più critici nella costruzione di plasmidi di donatore HMEJ sono: (1) selezione di sgRNA con alta efficienza di clivaggio del DNA e bassa distanza tra sito di taglio sgRNA e codone di arresto e costruzione (2) corretta del donatore HMEJ. CRISPR/Cas9-mediata cleavage su entrambi vettoriale di donatore del transgene (contenente siti di destinazione sgRNA e ~ 800 bp omologia braccia) e genoma mirato è necessario per l'integrazione mirata efficiente e precisa in vivo. I passaggi più critici della generazio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da CAS strategico priorità Research Program (XDB02050007, XDA01010409), la nazionale Hightech di R & D programma (programma 863; 2015AA020307), National Natural Science Foundation of China (NSFC concede 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), China Youth mille talenti programma (HY), rottura attraverso il progetto dell'Accademia delle scienze cinese, Shanghai città comitato della scienza e della tecnologia del progetto (16JC1420202 a HY), il Ministero della scienza e della tecnologia della Cina (la maggior parte; 2016YFA0100500).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| vettore pAAV | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | vettore AAV per la codifica di un SpCas9 ottimizzato per il codone umano guidato dal promotore EFs |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | Donatore HMEJ per la fusione di un reporter p2A-mCherry con Actb di topo. EGFP guidato dal promotore EF1a e dagli sgRNA U6-driven che hanno come bersaglio Actb. Spina dorsale AAV. |
| AAV_Cdx2 Donatore HMEJ | Addgene | 97319 | Donatore HMEJ per la fusione di un reporter p2A-mCherry con Cdx2 di topo. |
| Lipofectamine 3000 Reagente di trasfezione | Technology | L3000015 | |
| Acqua senza nucleasi | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonucleasi I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmide EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Fiammante/Marrone Estrattore per micropipette | Strumento Sutter | P-97 | Estrattore per micropipette (parametri: calore, 74; trazione, 60; velocità, 80; tempo/ritardo, 200; pressione, 300) |
| Vetro borosilicato | Sutter Instrument | B100-78-10 | tipo di capillari (diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,78 mm con filamento) |
| Microiniettore FemtoJet | Eppendorf | ||
| Microtomo di congelamento | Leica | CM1950-Spessore del criostato | di 40 μ m per cervello, 10 μ m per fegato |
| Coniglio anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen, Strepto, Glutammina | Gibco | 10378016 | |
| Kit di estrazione del gel | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Citocalasina B | Sigma | CAT # C6762 | |
| KSOM + AA con D-glucosio e fenolo rosso | Millipore | CAT # MR-106-D | |
| M2 Medium con Millipore Rosso Fenolo | CAT#MR-015-D | ||
| Olio minerale | Sigma |
Riferimenti
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells usin....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy
Posted by JoVE Editors on 3/10/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay" to " T7 endonuclease I" respectively.
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
- Surveyor nuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
to:
- T7 endonuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
