Il cluster regolarmente intervallate proteine brevi ripetizioni/CRISPR palindromi associato 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornisce uno strumento promettente per l'ingegneria genetica e apre la possibilità di integrazione mirata dei transgeni. Descriviamo un fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-base di strategia per DNA efficiente mirata integrazione in vivo e mirate terapie geniche utilizzando CRISPR/Cas9.
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Articolo metodologico
Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Come una promettente piattaforma di editing del genoma, il sistema CRISPR/Cas9 ha un grande potenziale per la manipolazione genetica efficiente, soprattutto per l'integrazione mirata dei transgeni. Tuttavia, a causa della scarsa efficienza di ricombinazione omologa (HR) e le varie mutazioni indel di non-omologo fine unirsi (NHEJ)-basato su strategie in cellule di divisione, in vivo genome pubblica rimane una grande sfida. Qui, descriviamo una fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-CRISPR/Cas9 sistema efficiente in vivo precisa mirata integrazione basato. In questo sistema, il genoma mirato e il donatore vector contenente armi di omologia (~ 800 bp) fiancheggiato da destinazione di RNA (sgRNA) guida singola sequenze sono spaccate da CRISPR/Cas9. Questa strategia basata su HMEJ realizza integrazione efficiente transgene in zigoti del mouse, così come in epatociti in vivo. Inoltre, una strategia basata su HMEJ offre un approccio efficace per la correzione di fumarylacetoacetate idrolasi (Fah) mutazione negli epatociti e Salva Fah-deficit indotto da topi di insufficienza epatica. Presi insieme, concentrandosi su mirata integrazione, questa strategia basata su HMEJ fornisce uno strumento promettente per una varietà di applicazioni, inclusa la generazione di modelli animali geneticamente modificati e terapie geniche mirate.
Introduzione
L'editing genomico precisa, mirata è spesso necessaria per la produzione di modelli animali geneticamente modificati e terapie cliniche. Molto sforzo è stato fatto per sviluppare varie strategie per efficiente genoma mirata modifiche, ad esempio l'apparato nucleasi a dita zinco (ZFN), nucleasi di trascrizione attivatore-come effettore (TALENs) e sistemi di CRISPR/Cas9. Queste strategie creare rotture a doppio filamento del DNA mirate (DSB) nel genoma e trarre vantaggio intrinseci sistemi di riparazione del DNA, come ricombinazione omologa (HR)1,2, basi-mediata fine unirsi (MMEJ)3 , 4 , 5e alla fine non-omologo unendo (NHEJ)6,7,8 per indurre l'integrazione mirata di transgeni1,9. La strategia basata su HR è attualmente il più comunemente usato genoma modificando l'approccio, che è molto efficiente in linee cellulari, ma non prontamente accessibile alle cellule di divisione a causa del relativo avvenimento limitata verso la fine della fase S/G2. Così, la strategia basata sulla non è applicabile per in vivo l'editing genomico. Recentemente, la strategia basata su NHEJ è stata sviluppata per efficiente gene knock-in mouse tessuti8. Tuttavia, il metodo basato su NHEJ introduce solitamente indels alle giunzioni, rendendo difficile generare l'editing genomico preciso, soprattutto quando si tenta di costruire in-frame fusione geni8. Integrazione mirata basata su MMEJ è capace di editing preciso genomico. Tuttavia, solo modestamente aumenta l'efficienza di integrazione mirata in precedenti relazioni5. Di conseguenza, migliorare l'efficienza della precisa integrazione mirata in vivo è urgente per applicazioni terapeutiche ampio3.
In un lavoro pubblicato recentemente, abbiamo dimostrato un fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-base di strategia, che ha mostrato la massima efficienza di integrazione mirata a tutti segnalati strategie sia in vitro che in vivo10. Qui, descriviamo un protocollo per l'istituzione del sistema HMEJ, e anche la costruzione dei vettori di RNA (sgRNA) singolo-guida il gene di interesse e il donatore di targeting vettori harboring siti di destinazione sgRNA e ~ 800 bp di braccia di omologia (Figura 1) . In questo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata per la generazione di topi knock-in DNA e brevi passi per l'integrazione mirata in tessuti in vivo. Inoltre, uno studio di proof-of-concept della strategia basata su HMEJ dimostrato la sua capacità di correggere Fah mutazione e salvare Fah- / - fegato guasto topi, che ulteriore ha rivelato il suo potenziale terapeutico.
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Protocollo
Tutte le procedure tra cui animali soggetti sono state approvate dal comitato etico di ricerca biomedica presso gli istituti di Shanghai per scienze biologiche (CAS).
1. progettazione dei plasmidi di donatore
-
Selezione di sgRNA
- Utilizzare strumenti di progettazione online CRISPR per prevedere sgRNAs la destinazione regione11,12,13,14,15. Per il locus di Cdx2 , progettare sei diversi sgRNAs (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) intorno alla fermata codone con maggiore potenziale di rango e inferiore off-target (Figura 1A)16.
- Linearizzare 2 µ g di vettori di espressione Cas9-CMV-EGFP e sgRNA di BbsI digestione (1 µ l di BbsI per 2 ore a 37 ° C ad una concentrazione finale di 1 U / µ l in un volume di 20 µ l). Quindi purificare il prodotto con kit di purificazione di gel con un gel di agarosio 1% in tampone TAE × 1.
- Mix una coppia di oligonucleotidi sgRNA in 10 µ l di 1 × buffer di ligasi del DNA T4 per una concentrazione finale di 50 µM. Incubare la soluzione di oligo utilizzando un gradiente di temperatura da 95 ° C a 25 ° C con un tasso di cambiamento di temperatura di 5 ° C/5 min (95 ° C per 5 min quindi 90 ° C per 5 min, 85 ° C per 5 min, ecc.), che sarà temprare i oligos.
- Mix 4 µ l di ricotto prodotto, 2 µ l di vettore linearizzato con 1 µ l di T4 DNA ligasi in 10 µ l di tampone di 1 × T4 DNA ligasi e quindi legare a 22 ° C per 1-2 h (Figura 1B).
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Surveyor nuclease dosaggio della sgRNA
Nota: L'efficienza di targeting di sgRNA utilizzato per l'esperimento di knock-in viene valutata dall'analisi di surveyor nuclease (noto anche come T7 endonucleasi ho (T7EI) analisi)17. Selezionare il sgRNA con alta efficienza di clivaggio del DNA e una bassa distanza tra il sito di taglio sgRNA e il codone di stop.- Transfect vettori di espressione di Cas9-sgRNA-EGFP in linee di cellule N2a coltivate in DMEM completati con 10% siero bovino fetale, 1% PSG e 1% aminoacidi non essenziali per la transfezione kit (Vedi Tabella materiali). Incubare le cellule transfected a 37 ° C in 5% CO2.
- Dopo 48 h di incubazione, raccogliere 5.000 cellule trasfettate (GFP+) di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) utilizzando cellule trasfettate con non come un controllo.
- Digerire le cellule raccolte in 2-5 µ l oflysis tampone (0,1% Triton X-100, 0.1% Tween 20 e 100 µ g/mL proteinasi K) a 56 ° C per 30 min e poi calore inattivare proteinasi K a 95 ° C per 10 min.
- Amplificare il campione dalla PCR annidata (tabella 1) utilizzando il protocollo del produttore. La dimensione dei prodotti di PCR è impostata a 300-500 bp.
- Mescolare 1 µ l di prodotto di lisi con DNA polimerasi e una coppia di primer esterno riconoscendo la sequenza attorno al sito di destinazione sgRNA (0,1 µM, concentrazione finale) (tabella 1) ed eseguire la PCR primaria in un volume di 20 µ l.
- Attivazione della polimerasi di DNA a 95 ° C per 5 min ed eseguire la PCR primaria per 30 cicli a 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 24 s (1 min/1 kb), con un'estensione finale a 72 ° C per 5 min.
- Eseguire la PCR secondaria utilizzando 1 µ l di prodotto PCR primario e una coppia di primers interna nidificati.
- Denaturare e ri-tempri 300-600 ng del prodotto PCR purificato in 20 µ l di tampone di reazione di 1 × T7EI (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10mm MgCl2, pH di 1 mM DTT 7,9) utilizzando un gradiente di temperatura da 95 ° C a 25 ° C con un tasso di 5 ° C/5 min.
- Aggiungere 1 µ l di enzima T7EI per i prodotti di PCR Ricotti e digest a 37 ° C per 2 h. Quindi eseguire il prodotto di digestione su gel di agarosio 2% in tampone TAE 1x 120 V per 40 min, fino a quando i frammenti sono separati (Vedi Tabella materiali).
- Utilizzare ImageJ per determinare le intensità di banda del taglio e del DNA uncut. Calcolare la frequenza di indel utilizzando i metodi come precedentemente segnalato9 (Figura 1C).
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Costruzione del vettore di donatore
Nota: Per generare dei vettori-donatore HMEJ per gene Cdx2 , costruire un donatore del DNA (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp HAR) fiancheggiato con 23 nt Cdx2-sgRNAs targeting sequenza ad entrambe le estremità (Figura 1D e 1 di figuraE). Il PAM di sequenza di destinazione era adiacente all'estremità del braccio omologo. Assemblea di Gibson è raccomandato per donatore HMEJ clonazione.- Amplificare il braccio di sinistra omologia di bp (HAL) 800 con forward primer-1F (contenente 15-20 nt sovrapposizione sequenza dal vettore, 23 nt sequenza targeting Cdx2-sgRNA e circa 20 nt sequenza da HAL) e reverse primer-1R (contenente 15-20 bp sovrapposizione sequenza da p2A-mCherry e circa 20 nt sequenza da HAL) alla concentrazione finale di 0,1 µM usando il DNA genomic del mouse a 200 ng / µ l (Figura 1D, tabella 1).
- Amplificare il frammento di inserimento p2A-mCherry con forward primer-2F (contenente la sequenza di sovrapposizione di nt 15-20 da HAL e circa 20 nt dal frammento di inserimento) e reverse primer-2R (contenente la sequenza di sovrapposizione di nt 15-20 da HAR e circa 20 nt da il frammento di inserimento) alla concentrazione finale di 0,1 µM utilizzando DNA genomico o plasmide con sequenze di reporter a 100 ng / µ l o 30 ng / µ l (Figura 1D, tabella 1).
- Amplificare il braccio di destra omologia di bp (HAR) 800 con forward primer-3F (contenente 15-20 nt sovrapposizione sequenza dal vettore, 23 nt sequenza targeting Cdx2-sgRNA e circa 20 nt sequenza da HAR) e reverse primer-3R (contenente 15-20 nt sovrapposizione sequenza da p2A-mCherry e circa 20 nt sequenza da HAR) alla concentrazione finale di 0,1 µM usando il DNA genomic del mouse a 200 ng / µ l (Figura 1D, tabella 1).
- Eseguire tutti i prodotti PCR su gel di agarosio all'1% in 1 × TAE tampone e purificare i prodotti di PCR delle dimensioni previste dal kit di estrazione del gel, secondo le istruzioni del produttore (tabella 1).
- Digerire 50-100 ng di un vettore di costrutto con KpnI e XbaI. Mix 2 µ l del vettore linearizzato a 30-40 ng / µ l con tre PCR amplificati frammenti (1 µ l per ogni, 100-200 ng / µ l) 2 x Gibson mix. Aggiungere H2O per regolare il volume finale di 10 µL.Incubate il mix a 50 ° C per 60 min.
- Trasformare competente Escherichia coli cellule con tutti il prodotto assemblato ed estrarre il plasmide costruisce da kit di estrazione del DNA secondo le istruzioni del produttore. Verificare il donatore HMEJ di sequenziamento del DNA.
2. genome Editing in embrioni di topo utilizzando il metodo basato su HMEJ
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Produzione di mRNA Cas9
- Per la preparazione di Cas9 mRNA, aggiungere la sequenza del promotore T7 per la Cas9 regione di codificazione dall'amplificazione di PCR utilizzando la coppia di primer appropriato elencata nella tabella 1. Aggiungere il primer Cas9 F/R a una concentrazione finale di 0,1 µM e 20 ng di Cas9 esprimendo vettore da 1 × alta fedeltà mix di polimerasi del DNA. Regolare il volume finale di 50 µ l con H2O.
- Attivazione della polimerasi di DNA a 95 ° C per 5 min ed eseguire la PCR per 36 cicli a 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 68 ° C per 4 min (min 1/1 kb), con un'estensione finale a 68 ° C per 10 min.
- Purificare il prodotto di PCR di T7-Cas9 per trascrizione in vitro (IVT) e poi trascrivere 0,5-1 µ g di DNA da kit di trascrizione di mRNA a 37 ° C per 8 h in un volume totale di 20 µ l, secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali).
- Aggiungere 1 µ l di dnasi alla miscela per rimuovere il modello di DNA a 37 ° C per 15 min. Aggiungi una coda poli-A per 45 min a 37 ° C e recuperare il mRNA Cas9, kit di purificazione di RNA, secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali).
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Produzione di sgRNA
- Generare il modello di sgRNA guidato da un promotore T7 con la polimerasi del DNA di alta fedeltà come sopra. Scegliere un'impalcatura di sgRNA contenente vettoriale come il modello. I primers utilizzati sono elencati nella tabella 1.
- Purificare il prodotto PCR di T7-sgRNA ed usare 0,5-1 µ g di DNA come il modello per la trascrizione in vitro di sgRNA utilizzando un kit di trascrizione breve RNA a 37 ° C per 6 h in un volume totale di 20 µ l, secondo le istruzioni del produttore (vedere tabella materiali < / c11 >).
- Aggiungere 1 µ l di dnasi alla miscela e continuare l'incubazione a 37 ° C per 15 minuti togliere la mascherina del DNA. Purificare il sgRNAs con kit di purificazione di RNA, come sopra (Vedi Tabella materiali).
- Diluire il sgRNA a 500 ng / µ l in acqua RNAsi-libera e conservare i campioni a − 80 ° C fino a 3 mesi.
Nota: Ribonucleoproteine CRISPR (RNP) sono un'alternativa sostituzione con un migliore taglio efficienza18,19,20.
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Coltura di collezione, microiniezione e in vitro dell'embrione
- Superovulate B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) topi femminili (7-8 settimane) di gonadotropina del siero di cavalla gravida (PMSG), seguiti da gonadotropina corionica umana (hCG) 48 ore più tardi. Dopo l'iniezione di hCG, le femmine di casa con i maschi B6D2F1 durante la notte.
- Sacrificare le femmine di CO2 anestesia, 24 h dopo l'iniezione di hCG. Raccogliere gli embrioni fecondati dal loro ovidotti (con 30-50 embrioni per ogni femmina) nel terreno di M2.
- Posto gli embrioni fecondati (circa 300 uova un giorno iniettabile) nel mezzo di KSOM (5,55 g/L NaCl, KCl, 0,05 g/L KH2PO4, 0,05 g/L MgSO4•7H2O, 0,04 g/L glucosio, 1,12 g/L sodio 0,19 g/L lattato, 2,1 g/L NaHCO3 , piruvato di sodio 0,02 g/L, 0,25 g/L CaCl2•2H2O, 0,004 g/L EDTA, 0,146 g/L L-glutamina e 1 g/L albumina di siero bovino) a 37 ° C in un incubatore con 5% CO2.
- Mix Cas9 mRNA (100 ng / µ l), sgRNA (50 ng / µ l) e donatore HMEJ (100 ng / µ l) di vettore e aggiungere H2O per regolare il volume finale di 10 µ l. mettere il composto sul ghiaccio.
- Tirare aghi capillari (diametro esterno 1,0 mm, diametro interno mm 0,78 con filamento) utilizzando un estrattore micropipetta (parametri: calore, pressione, 300; velocità, 80; ritardo, 200; tirare, 60, 74. Vedi tabella materiali). Aghi delle imprese sarebbe una sostituzione alternativa per la microiniezione.
- Iniettare un probabile volume della miscela nel citoplasma degli zigoti con pronuclei ben definite in una goccia di mezzo CZB HEPES contenente 5 µ g/mL citocalasina B utilizzando un microinjector con costante flusso impostazioni (Figura 2A) (Vedi Tabella materiali)21.
Nota: Deve essere iniettato ogni gruppo degli zigoti entro 20-30 min Cytochalasin B potrebbe aumentare la redditività dello zigote del mouse dopo l'iniezione. In alternativa, microinjection può essere azionato con il sistema piezo, come descritto in precedenza22. - Cultura gli zigoti iniettati nel mezzo KSOM a 37 ° C, inferiore al 5% di CO2 fino a quando la blastocisti fase dopo 3,5 giorni per l'osservazione della fluorescenza (figure 2B e 2C).
-
Trasferimento dell'embrione e la generazione di topi
- Compagno di estro topi femminili ICR con vasectomia topi maschi ICR lo stesso giorno come iniezione.
- Cultura gli zigoti iniettati nella fase 2 celle a 37 ° C in 5% CO2e trasferire 25-30 2 celle gli embrioni in ovidotti di femmine pseudopregnant ICR a 0,5 giorno coitum dell'alberino (dpc). Destinatario madri offrono cuccioli a 19,5 dpc.
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Genotipizzazione del mouse
- Estrarre il DNA genomico del mouse da campioni di punta o coda utilizzando un kit di estrazione del DNA, secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali).
- Identificare svincolo 5' e 3' di knock-in eventi utilizzando 200-400 ng di DNA genomic misurato tramite spettrometria UV/vis come un modello per eseguire il amplification PCR.
- Attivazione della polimerasi di DNA a 95 ° C per 5 min ed eseguire la PCR per 38 cicli a 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min (min 1/1 kb), con un'estensione finale a 72 ° C per 10 min. Per il 5' junction, utilizzare il primer forward a monte dell'HAL, con quella inversa sul frammento knock-in (p2A-mCherry). Per quanto riguarda 3' incrocio, è necessario utilizzare il primer avanti sul frammento knock-in (p2A-mCherry), con quello inverso sulla valle di HAR (tabella 1).
- Eseguire 6 µ l del prodotto della PCR su gel di agarosio 1% in tampone TAE × 1 e controllo per la dimensione del frammento previsto. Quindi verificare loro DNA sequencing (Figura 2D).
3. HMEJ-base In Vivo Genome Editing negli epatociti
- Inserire destinatario mouse C57BL/6J (8 settimane) in un dispositivo trattenente e mettere la coda attraverso la fessura.
- Mescolare HMEJ donatore vettori (30 µ g) e vettori di espressione di spCas9 (30 µ g) in 2 mL di soluzione salina. Per l'esperimento di controllo, è necessario sospendere vettori di HMEJ donatore (30 µ g) in 2 mL di soluzione salina (Figura 3A).
- Pulire la coda di topo con etanolo al 70%. Inserire l'ago nella coda della vena e iniettare la soluzione di DNA plasmidico entro 5-7 s. rimuovere l'ago e rilasciare il mouse dal dispositivo trattenente.
- Sacrificare i topi di CO2 anestesia dopo 5-9 giorni dopo l'iniezione. Irrorare la via di topi con soluzione fisiologica allo 0,9%, seguita da paraformaldeide 4% utilizzando una pompa peristaltica e difficoltà del fegato durante la notte a 4 ° C.
- Disidratare il tessuto con 30% di saccarosio durante la notte, fino a quando scende fino al fondo del tubo.
- Sezione del tessuto congelato con uno spessore di 10 µm per i campioni del fegato.
- Risciacquare le sezioni tre volte in tampone fosfato 0,1 M (PB) e li incubare con l'anticorpo primario: Rabbit anti-mCherry (diluito in 5% NGS) overnight a 4 ° C.
- Lavare sezioni tre volte in PB e quindi li incubare con l'anticorpo secondario: Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG per 2 h a temperatura ambiente su agitatore orbitale.
- Colorante di contrasto le sezioni con DAPI per 20 min e montaggio con glicerina su vetrini per l'osservazione della fluorescenza (Figura 3B) ulteriormente.
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Risultati
Editing basato su HMEJ genomico in embrioni di topo: Per definire l'efficienza knock-del metodo basato su HMEJ in zigoti mouse, abbiamo consegnato Cas9 mRNA, sgRNA targeting del gene Cdx2 e il donatore HMEJ in zigoti del mouse, che è stato progettato per fondere un gene reporter p2A-mCherry al codone ultimo di Cdx2 gene (Figura 2A). Gli zigoti iniettati sviluppato in blastocisti nella cultura. Per valutare l...
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Discussione
I passaggi più critici nella costruzione di plasmidi di donatore HMEJ sono: (1) selezione di sgRNA con alta efficienza di clivaggio del DNA e bassa distanza tra sito di taglio sgRNA e codone di arresto e costruzione (2) corretta del donatore HMEJ. CRISPR/Cas9-mediata cleavage su entrambi vettoriale di donatore del transgene (contenente siti di destinazione sgRNA e ~ 800 bp omologia braccia) e genoma mirato è necessario per l'integrazione mirata efficiente e precisa in vivo. I passaggi più critici della generazio...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da CAS strategico priorità Research Program (XDB02050007, XDA01010409), la nazionale Hightech di R & D programma (programma 863; 2015AA020307), National Natural Science Foundation of China (NSFC concede 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), China Youth mille talenti programma (HY), rottura attraverso il progetto dell'Accademia delle scienze cinese, Shanghai città comitato della scienza e della tecnologia del progetto (16JC1420202 a HY), il Ministero della scienza e della tecnologia della Cina (la maggior parte; 2016YFA0100500).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| vettore pAAV | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | vettore AAV per la codifica di un SpCas9 ottimizzato per il codone umano guidato dal promotore EFs |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | Donatore HMEJ per la fusione di un reporter p2A-mCherry con Actb di topo. EGFP guidato dal promotore EF1a e dagli sgRNA U6-driven che hanno come bersaglio Actb. Spina dorsale AAV. |
| AAV_Cdx2 Donatore HMEJ | Addgene | 97319 | Donatore HMEJ per la fusione di un reporter p2A-mCherry con Cdx2 di topo. |
| Lipofectamine 3000 Reagente di trasfezione | Technology | L3000015 | |
| Acqua senza nucleasi | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonucleasi I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmide EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Fiammante/Marrone Estrattore per micropipette | Strumento Sutter | P-97 | Estrattore per micropipette (parametri: calore, 74; trazione, 60; velocità, 80; tempo/ritardo, 200; pressione, 300) |
| Vetro borosilicato | Sutter Instrument | B100-78-10 | tipo di capillari (diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,78 mm con filamento) |
| Microiniettore FemtoJet | Eppendorf | ||
| Microtomo di congelamento | Leica | CM1950-Spessore del criostato | di 40 μ m per cervello, 10 μ m per fegato |
| Coniglio anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen, Strepto, Glutammina | Gibco | 10378016 | |
| Kit di estrazione del gel | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Citocalasina B | Sigma | CAT # C6762 | |
| KSOM + AA con D-glucosio e fenolo rosso | Millipore | CAT # MR-106-D | |
| M2 Medium con Millipore Rosso Fenolo | CAT#MR-015-D | ||
| Olio minerale | Sigma |
Riferimenti
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- Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy
Posted by JoVE Editors on 3/10/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay" to " T7 endonuclease I" respectively.
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
- Surveyor nuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
to:
- T7 endonuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
