Articolo metodologico

Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR

DOI:

10.3791/56850

⸱

12 febbraio 2018

 ,  ,  ,  , 
1Medicinal Safety Research Laboratories, Daiichi Sankyo Co., Ltd.

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo rapporto descrive un protocollo per misurare i livelli assoluti di miRNA al plasma, usando trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR, con o senza pre-amplificazione. Questo protocollo offre una migliore comprensione della quantità di plasma Mirna e permette la valutazione qualitativa dei dati corrispondenti da diversi studi o laboratori.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RT-qPCR è uno dei metodi più comuni per valutare i miRNA obiettivo individuale. Livelli di Mirna sono generalmente misurati rispetto a un campione di riferimento. Questo approccio è appropriato per l'esame di cambiamenti fisiologici nei livelli di espressione del gene bersaglio. Tuttavia, la quantificazione assoluta usando meglio l'analisi statistica è preferibile per una valutazione completa dei livelli di espressione genica. Quantificazione assoluta è ancora non di uso comune. Questo rapporto descrive un protocollo per misurare i livelli assoluti di miRNA al plasma, usando RT-qPCR con o senza pre-amplificazione.

Un volume fisso (200 µ l) di plasma EDTA è stato preparato dal sangue raccolto dalla vena femorale di scimmie cynomolgus cosciente (n = 50). il RNA totale è stato estratto utilizzando sistema commercialmente disponibile. Al plasma miRNA sono stati quantificati dall'analisi di RT-qPCR sonda-based che contiene specifici miRNA avanti/indietro PCR primer e sonda. Le curve standard per quantificazione assoluta sono state generate utilizzando oligonucleotidi da RNA sintetici disponibile in commercio. Un sintetico cel-miR-238 è stato usato come un controllo esterno per la valutazione di qualità e di normalizzazione. I miRNA che ha mostrato la quantificazione ciclo (Cq) valori superiori a 35 sono stati pre-amplificati prima il passo di qPCR.

Tra i 8 Mirna esaminati, miR-122, miR-133a e miR-192 erano rilevabili senza pre-amplificazione, considerando che miR-1, miR-206 e miR-499a necessari pre-amplificazione a causa dei loro livelli di espressione bassa. MiR-208a e miR-208b non erano rilevabili anche dopo pre-amplificazione. L'efficienza di elaborazione del campione è stata valutata dai valori Cq di spillo cel-miR-238. In questo metodo di analisi, tecnica variazione è stata stimata in meno di 3 volte e il limite inferiore di quantificazione (LLOQ) era 102 copia / µ l, per la maggior parte dei miRNA esaminati.

Questo protocollo fornisce una migliore stima della quantità di plasma Mirna e permette la valutazione della qualità dei dati corrispondenti da diversi studi. Considerando che il basso numero di miRNA nei liquidi corporei, pre-amplificazione è utile per migliorare la rilevazione di mal espresso Mirna.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un numero crescente di studi è stati esplorare i microRNA (Mirna) come biomarcatori per la diagnosi e la prognosi di tumori, o di monitoraggio e rilevamento di altre malattie in studi non clinici e clinici1,2,3 . Trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR (RT-qPCR) è uno dei metodi più comuni utilizzati per valutare i miRNAs obiettivo individuale, perché questa tecnica è più sensibile la sequenza di RNA e microarray4 basato su piattaforme5. In generale, espressione dei miRNA è misurata rispetto a un campione di riferimento utilizzando il metodo di ΔCq6. Questo approccio è adatto per indagare i cambiamenti fisiologici nei livelli di espressione del gene bersaglio. Tuttavia, quantificazione relativa di Mirna in circolazione ha limitato l'utilità a causa delle loro piccole quantità. Inoltre, variazione tecnica rende difficile confrontare i risultati di diversi studi, perché diversi laboratori personalizzare i protocolli sperimentali di RT-qPCR in modo diverso, che porta a incoerente o contraddittoria anche risultati da diversi studi7.

In considerazione delle problematiche di cui sopra, quantificazione assoluta potrebbe essere più adatto per la valutazione delle quantità piccole di miRNA nei liquidi corporei. Il metodo di quantificazione assoluta utilizza una curva standard generata da concentrazioni note di oligonucleotidi sintetici di RNA che sono identici in sequenza per la corrispondente destinazione miRNA8. La salute e l'Istituto di scienze ambientali (HESI) Comitato tecnico sulla genomica ha recentemente condotto studi completi per confrontare i risultati di misure assolute di Mirna al plasma, in più siti di prova. I risultati hanno mostrato che utilizzando un protocollo standard per la quantificazione assoluta di Mirna ha dato risultati comparabili tra i siti di più prova9. Il metodo di analisi di RT-qPCR descritto nel presente studio è quasi identico al protocollo standard di HESI, che include analisi "multiplex" di molteplici obiettivi di miRNA e pre-amplificazione per facilitare il rilevamento di bassa espressione di Mirna.

In questo studio, un volume fisso (200 µ l) di plasma EDTA preparato dal sangue raccolti dalla vena femorale di scimmie cynomolgus cosciente (n = 50) è stato usato10. Il seguente protocollo descrive la procedura per la preparazione di campioni di plasma, estrazione di miRNA e RT-qPCR, tra cui pre-amplificazione. Ancora più importante, ulteriori informazioni tecniche sul protocollo sono stato inclusi, affinché la quantità di destinazione miRNA nei campioni possa essere convalidata in combinazione con un processo ben qualificato. In primo luogo, la curva standard di ciascun miRNA è stata validata per la sua gamma di rilevazione individuale, prima della relativa quantificazione in campioni biologici. In secondo luogo, la qualità della metodologia corrente completamente è stata valutata per mezzo di valori Cq di un controllo esterno (cel-miR-238). Pertanto, questa piattaforma produce dati più informativi e affidabili per confrontare i risultati di diversi studi o laboratori.

I profili dei 8 miRNA sono stati inclusi in questo rapporto come risultati rappresentativi dal metodo di analisi descritto qui. Questi miRNA sono stati proposti come potenziali biomarcatori di sicurezza associate a lesioni dei tessuti al fegato (miR-122 e miR-192), cuore (miR-1, miR-208a, miR-208b e miR-499a) e muscolo scheletrico (miR-133a e miR-206) in roditori ed esseri umani3, 11,12,13.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di Daiichi Sankyo Co., Ltd.

1. preparazione del campione

  1. Raccogliere il sangue (almeno 0,5 mL) dalla vena femorale di scimmie cynomolgus in provette EDTA 2K-contenenti.
    Nota: Citrato o eparina non sono accettabili perché questi anticoagulanti inibiscono successive PCR14,15.
  2. Posizionare i campioni raccolti immediatamente sul ghiaccio e processo per l'isolamento del plasma entro 2 ore dalla raccolta.
  3. Centrifugare i campioni a 10.000 x g a 4 ° C per 5 min.
  4. Trasferire il surnatante in una microprovetta 2 mL, seguita da centrifugazione a 16.000 x g a 4 ° C per 5 min rimuovere i detriti cellulari e piastrine residue.
    Nota: Quantificazione dei miRNA possa essere influenzate in modo significativo da piastrine contaminazione16.
  5. Inserire 200 aliquote µ l del surnatante in freschi 2 mL-microprovette e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Un volume fisso di ogni campione viene utilizzato per l'estrazione di RNA; di conseguenza, il volume dell'aliquota deve essere esatto.

2. estrazione del RNA

  1. Scongelare i campioni congelati sul ghiaccio (dal punto 1.5).
    1. Mantenere il campione freddo sul ghiaccio durante l'estrazione di RNA. Reagente di lisi di chill e cloroformio il priore di ghiaccio da utilizzare.
  2. Aggiungere 5 volumi (1000 µ l) di reagente di Lisi, contenente soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato, al campione (200 µ l) e mescolare energicamente nel Vortex per 1 min.
  3. Aggiungere 5 µ l di 5 nM sintetico Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-cel-miR-238-3 p).
  4. Aggiungere 1 volume (200 µ l) di cloroformio e mescolare energicamente nel Vortex per 1 min.
  5. Tenere il ghiaccio per 2 o 3 minuti e poi Centrifugare i campioni a 12.000 x g a 4 ° C per 15 min.
  6. Trasferire la fase acquosa con attenzione ad una nuova microprovetta.
    Nota: Non trasferire qualsiasi fase organica (rosso) o interfase (bianco). Il volume della fase acquosa raccolto deve essere uniforme per evitare di gestire incoerenza, che si traduce in una maggiore variazione tecnica. La solita quantità di fase acquosa trasferito in questo protocollo era 650 µ l.
  7. Aggiungere 1,5 volumi (975 µ l) di etanolo e mescolare bene pipettando su e giù.
  8. Trasferire il campione in una colonna corrispondente e adattatore, seguita da essiccazione sotto vuoto per 3 minuti utilizzando collettori sottovuoto. Se il volume del campione è più di 700 µ l, ripetere questo passaggio per elaborare la soluzione rimanente.
    Nota: Isolamento del RNA basata su colonne è compatibile con il metodo vuoto e centrifugazione.
  9. Aggiungere 200 µ l di etanolo per la colonna, seguita da essiccazione sotto vuoto per 1 min.
  10. Aggiungere 800 µ l di tampone di RWT alla colonna, seguita da essiccazione sotto vuoto per 2 min.
  11. Aggiungere 800 µ l di tampone di RPE alla colonna, seguita da essiccazione sotto vuoto per 2 min.
  12. Ripetere il punto 2.11.
  13. Aggiungere 300 µ l di etanolo per la colonna, seguita da essiccazione sotto vuoto per 1 min.
  14. Posizionare la colonna in una nuova provetta e centrifugare a 12.000 x g a temperatura ambiente (15-25 ° C) per 1 min.
  15. La colonna di trasferimento ad una nuova microprovetta e aggiungere 50 µ l di acqua priva di nucleasi.
  16. Riposare a temperatura ambiente (15-25 ° C) per 3 min e centrifugare a 8.000 × g a temperatura ambiente (15-25 ° C) per 1 min.
  17. Riapplicare l'eluato alla colonna.
  18. Ripetere il passaggio 2.16 e memorizzare eluato a-80 ° C fino all'utilizzo.

3. sintesi del cDNA

  1. Scongelare i campioni congelati (dal punto 2.18).
  2. Preparare la concentrazione nota dei oligonucleotides sintetici di RNA che corrispondono a destinazione Mirna.
    1. Utilizzare oligonucleotide sintetico di RNA per generare una curva standard in qPCR. Soluzione madre di concentrazione di 1 x 108 copia / µ l è preparata per scopi di archiviazione.
    2. Diluire la soluzione madre 10 volte per ottenere 1 x 107 copia / µ l (non pre-amplificati campioni) o soluzione di lavoro di 1 x 105 copia / µ l (campioni pre-amplificati) come la più alta concentrazione per costruire la curva standard. In generale, una gamma suggerita per le concentrazioni di curva standard è 1 x 107 a 1 x 102 copia / µ l (non pre-amplificati campioni) o 1 x 105 a 1 x 100 copia / µ l (campioni pre-amplificati).
  3. Preparare piscina di primer multiplex RT mescolando volumi uguali di primers di RT x 20 per destinazione Mirna.
    Nota: Come mostrato nella Figura 2, una piscina contenente fino a 4 destinazione miRNA può essere fatto mescolando i primer RT 20x di ciascuno dei miRNA in piscina. Cel-miR-238 (controllo esterno) deve essere incluso come uno dei miRNA target in ogni provetta. In caso di meno di 4 destinazione Mirna, aggiungere volumi uguali di 1/10 buffer di TE invece di primer di RT x 20.
  4. Preparare la miscela di reazione di RT: 3 µ l di primer RT della piscina (dal punto 3.3), 0.15 µ l di 100 mM dNTPs con dTTP, 1 µ l di trascrittasi inversa (50 U / µ l), 1,5 µ l 10 x tampone RT, 0.19 µ l di inibitore di RNAsi (20 U / µ l) e 4.16 µ l di nucleasi-free acqua.
  5. Miscelare 10 µ l di reazione di RT mescolare con 5 µ l di campione di RNA (dal punto 3.1) o oligonucleotidi (dal punto 3.2) pipettando e incubare in ghiaccio per 5 min.
  6. Eseguire la trascrizione d'inversione su un apparato termociclatore: 16 ° C per 30 min, 42 ° C per 30 minuti, seguita da una fase di inattivazione finale della trascrittasi inversa a 85 ° C per 5 min, esempi di trascritto inverso Store a-80 ° C fino all'utilizzo.

4. preamplificazione (opzionale)

Nota: I miRNA che mostrano valori di Cq sopra 35 o più in qPCR successive sono pre-amplificati.

  1. Scongelare i campioni congelati (dal punto 3.6).
  2. Effettuare diluizioni seriali di 10 volte del prodotto RT da oligonucleotidi sintetici di RNA; 1 x 105 a 1 x 100 copia / µ l per la generazione di curva standard.
  3. Preparare piscina primer multiplex assay mescolando volumi uguali (5 µ l) di 20x primer di dosaggio per miRNA di destinazione con la concentrazione finale di ogni primer saggio essere diluito 200 volte di buffer di TE in un volume finale di 1.000 µ l.
    Nota: Gli iniettori di analisi cui miRNA di destinazione possono essere rilevabili in qPCR successive senza pre-amplificazione e quelli per cel-miR-238 (controllo esterno) non sono inclusi nel pool di primer.
  4. Preparare la miscela di reazione di pre-amplificazione: 12,5 µ l di reagente preamplificazione ready-to-use, 3,75 µ l del pool di primer di analisi (dal punto 4.3) e 6,25 µ l di acqua priva di nucleasi: 2x.
  5. µ L di mix 22.5 del pre-amplificazione mescolare con 2,5 µ l di campione inverso trascritto (dal punto 4.1) o oligonucleotidi (dal punto 4.2) pipettando e incubare in ghiaccio per 5 min.
  6. Eseguire la reazione su un apparato termociclatore: 95 ° C per 10 min; seguita da 12 cicli di 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 4 min. conservare i campioni pre-amplificati a-80 ° C fino all'utilizzo.

5. quantitative PCR in tempo reale (qPCR)

  1. Scongelare i campioni congelati (dal passaggio 3.6 o 4.6).
  2. Diluire i campioni 5 volte con acqua sterile.
  3. Preparare diluizioni seriali x10 del prodotto RT derivato da oligonucleotidi sintetici di RNA; 1 x 107 a 1 x 102 copia / µ l (non pre-amplificati campioni) o 1 x 105 a 1 x 100 copia / µ l (pre-amplificati campioni) per la generazione di curve standard.
  4. Preparare la miscela di reazione qPCR: 10 µ l di reagente di amplificazione di ready-to-use, 1 µ l di reagente di analisi, contenente PCR primer sonda corrispondente alla destinazione miRNA e avanti/indietro: 20x e 7 µ l di acqua priva di nucleasi: 2x.
  5. Trasferire le piastre di reazione veloce ottico a 96 pozzetti 18 µ l dal mix di reazione qPCR e aggiungere 2 µ l dei campioni diluiti (dal passaggio 5.2 o 5.3) nei pozzetti.
    Nota: I campioni e gli standard per qPCR vengono impostati in duplicati.
  6. Sigillare la piastra con la pellicola adesiva e centrifugare.
  7. Eseguire la reazione in un termociclatore in tempo reale: 95 ° C per 20 s, seguita da 45 cicli di 95 ° C per 1 s e 60 ° C per 20 s.

6. analisi dei dati

  1. Calcolare il numero di copia crudo di ogni campione usando il software di analisi dati che funziona con corrispondente termociclatore in tempo reale.
    Nota: Linea di soglia è impostata manualmente su "1.0" in tutte le piastre nello studio, per confermare la riproducibilità rispetto ai loro vales Cq. Livello di cut-off è impostato al Cq > 40 cicli.
  2. Calcolare la media del numero di ciascun campione da duplicati copia crudo.
  3. Calcolare il fattore di correzione dividendo un numero di copia di cel-miR-238 in ciascun campione per la media del numero di copia di cel-miR-238 da tutti i campioni in un tubo corrispondente.
    Nota: Come mostrato nella Figura 2, ogni tubo contiene fino a 4 miRNA di destinazione tra cui cel-miR-238 (controllo esterno). Di conseguenza, fattore di correzione viene calcolato per ogni provetta utilizzando il corrispondente valore di cel-miR-238.
  4. Calcolare il numero di copia regolato dividendo il numero di media copia crudo di ogni campione (da passo 6.2) per il fattore di correzione (da passo 6.3) per ogni campione.
  5. Calcolare il numero di copia assoluta moltiplicando il numero di copia crudo rettificato di ciascun campione (da passo 6.4) il fattore di diluizione per ciascun campione.
    Nota: Il fattore di diluizione è "5" nel presente protocollo, che è derivato dal punto 5.2.
  6. Calcolare l'efficienza di amplificazione di PCR dal versante della trama dei valori Cq per ogni diluizione seriale contro concentrazione di cDNA di registro.
    Nota: Formula per calcolare l'efficienza; E = (10(-1/slope) -1) x 100%.
  7. Calcolare la variazione tecnica utilizzando i valori di Cq di cel-miR-238 da tutti i campioni usando la formula E = (efficacia di amplificazione 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    Nota: I passaggi 6.5 e 6.7 sono utilizzati per la valutazione di qualità della procedura.

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Risultati

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Flusso di lavoro di analisi di miRNA da RT-qPCR e la valutazione di qualità deit
La figura 1 Mostra il flusso di lavoro di analisi di miRNA da campioni di sangue usando qPCR10. La qualità degli esperimenti può essere verificata includendo cel-miR-238 come un controllo esterno. Questo rivelerà varianti tecniche in estrazione del RNA e i processi successivi RT-qPCR. In questo studio, la media ± SD di Cq valor...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La nostra valutazione globale fornito un'analisi statistica più rigorosa dell'estensione della gamma dinamica, che ha chiaramente indicato che la grandezza della variazione tra singoli campioni era estremamente diversa tra i miRNA testati. Anche se queste variazioni possono essere attribuibili ai loro piccoli quantitativi nei liquidi corporei, si deve osservare che questi dati riflettono non solo variazioni biologiche, ma anche varianti tecniche. La maggior parte della variazione tecnica può essere valutata mediante valo...

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Dichiarazioni

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L'autore non ha alcun conflitto d'interessi di divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca non ha ricevuto alcuna sovvenzione specifiche da agenzie di finanziamento nel settore pubblico, commerciale, o non-profit.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BD Microtainer tube (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974Per la raccolta del sangue
Eppendorf PCR Tubes, 0,2 mLEppendorf0030124359
Eppendorf Safe-Lock microprovette   1,5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro provette   2,0 mLEppendorf 0030120094
Oligonucleotide sinteticoHokkaido SystemScience-IndividualmiRNA (0,2 μ mol, grado HPLC)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8,0)Nippon Gene314-90021tampone TE
Tampone RPEQIAGEN-Contenutoin miRNeasy mini kit 
Tampone RWTQIAGEN-Contenutoin miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004
Acqua Senza Nucleasi QIAGEN129114
QIAzol Reagente per lisiQIAGEN-Contenutoin miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID:MSY0000293, 5 nmol
SC AdattatoriTAIGEN Bioscience CorporationS0120Per l'estrazione dell'RNA
VacEZor 36 Sistema completoTAIGEN Bioscience CorporationM3610Per l'estrazione dell'RNA
7900HT Sistema PCR in tempo reale veloceThermo Fisher Scientific Inc.4351405PCR GeneAmp a blocchi a 96 pozzetti veloce
9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
MicroAmp Piastra di reazione ottica veloce a 96 pozzettiThermo Fisher Scientific Inc.
Pellicola adesiva ottica MicroAmpThermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.
Saggi di microRNA TaqMan (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.ID deltest 4427975: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID saggio: 002245
Saggi TaqMan MicroRNA (has-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID saggio: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID del test: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID saggio: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.ID 4427975test: 000510
Saggi TaqMan MicroRNA (has-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.ID 4427975test: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.ID 4427975test: 002290
Saggi TaqMan MicroRNA (has-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.ID del test 4427975: 001352
Kit di trascrizione TaqMan MicroRNA Reverse
Thermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan PreAmp Master Mix (2 volte)Thermo Fisher Scientific Inc.
CloroformioWako Pure Chemicals035-02616
Etanolo (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456
Sistema 43469074311971444455743665974391128

Riferimenti

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