Questo protocollo viene descritto come utilizzare una preparazione testa in vitro isolato tartaruga per misurare la cinematica dei loro movimenti oculari. Dopo la rimozione del cervello dal cranio, nervi cranici può essere stimolati con correnti a quantificare le rotazioni dell'occhio e cambiamenti nelle dimensioni della pupilla.
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Articolo metodologico
Oculare cinematica misurata dalla stimolazione In Vitro dei nervi cranici in tartaruga
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dopo che gli animali sono euthanized, loro tessuti cominciano a morire. Le tartarughe offrono un vantaggio a causa di un più lungo periodo di sopravvivenza dei loro tessuti, soprattutto se paragonato ai vertebrati a sangue caldo. Per questo motivo, gli esperimenti in vitro in tartarughe possono essere eseguiti per lunghi periodi di tempo per studiare i segnali neurali e il controllo delle loro azioni mirate. Usando una preparazione testa isolata, abbiamo misurato la cinematica dei movimenti oculari in tartarughe, e loro modulazione di segnali elettrici trasportati dai nervi cranici. Dopo che il cervello è stato rimosso dal cranio, intatti i nervi cranici, la testa dissecata fu posto in un giunto cardanico per calibrare i movimenti oculari. Elettrodi di vetro sono stati fissati ai nervi cranici (oculomotore, trocleare e abducente) e stimolato con correnti di evocare movimenti oculari. Abbiamo monitorato i movimenti di occhio con un video a infrarossi tracking system e quantificati rotazioni degli occhi. Impulsi di corrente con una gamma di ampiezze, frequenze, e treno durate venivano utilizzate per osservare gli effetti sulle risposte. Perché la preparazione è separata dal cervello, la via efferente che va agli obiettivi del muscolo può essere esaminata isolatamente per studiare segnalazione neurale in assenza di informazioni sensoriali centralmente elaborate.
Introduzione
Spiegazione razionale per usando il cursore rosso-eared tartarughe in esperimenti elettrofisiologici:
Le tartarughe dalle orecchie rosse (Trachemys scripta elegans), sono considerati uno dei peggiore specie invasive1 del mondo e può indicare che un ecosistema è nei guai. Il motivo per cui sono tanto successo tartarughe cursore rosso-eared è capito male ma può essere in parte dovuto la loro fisiologia tollerante e possesso di tessuti nervosi che può sopravvivere in condizioni di ipossia2,3,4 . Li utilizzano per sperimen....
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Protocollo
Nota: Le tartarughe cursore rosso-eared sia maschile che femminile, sono state acquistate da un fornitore. Le tartarughe sono state alloggiate in una suite di animale calda contenente due 60-gallone vasche dotate di isole di mattoni per prendere il sole sotto le luci a infrarossi 250-W. L'ambiente è stato effettuato su un ciclo di luce/buio 14/10-h con la temperatura dell'acqua a 22 ° C. Luci erano acceso alle 6:00 e spento alle 20:00. I serbatoi dotati di sistemi di filtraggio sono stati puliti settimanalmente e tartarughe sono state alimentate ad libitum ogni altro giorno. La cura del cursore rosso-eared tartarughe e tutte le seguenti procedure sperimentali....
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Risultati
La figura 1 Mostra stills di immagini tratte da un video che descrive la dissezione. Immagini forniscono posizioni tipiche dei nervi prima del taglio dal cervello.
Figura 1: Stills di immagini catturate dal video della dissezione per mostrare la località del nervo ottico (nII), nervo oculomotore (nIII), nervo.......
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Discussione
Fasi critiche:
I passaggi critici all'interno di questo protocollo sono i seguenti: 1) la dissezione e la cura per mantenere la vitalità dei nervi transected; 2) la corrispondenza di dimensioni dagli elettrodi aspirazione ai nervi cranici di fornire risposte coerenti; e 3) il posizionamento della testa nella sospensione cardanica per fornire un'adeguata calibrazione delle rotazioni dell'occhio.
Risoluzione dei problemi:
La dissezione può essere.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano la Signora Paulette McKenna e Lisa Pezzino in questo studio per supporto segretariale e Mr. Phil Auerbach per il supporto tecnico. Gli autori ringraziano anche i dottori Michael Ariel e Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) per ci ha spiegato che la preparazione della testa in vitro isolato. Contributi a sostegno di questa collaborazione è stata fornita dal dipartimento di biologia (Robert S. Chase Fund), il comitato accademico di ricerca e il programma di neuroscienze al Lafayette College. Infine, questo lavoro è dedicato a Mr. Phil Auerbach, scomparso 28 settembre 2016; ha un microscopio elettronico a scansione ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tartarughe dalle orecchie rosse | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (lunghezza del carapace 15-20 cm) |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich Co., LLC. | P5405 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich Co., LLC. | M7304 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich Co., LLC. | S5761 | |
| Destrosio | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Acido cloridrico concentrato | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Cloruro di calcio | Sigma-Aldrich Co., LLC. | C7902 | |
| Misuratore di pH | Oakton | pH 6+ | |
| Elettrodo di stimolazione ad aspirazione | A-M Systems | 573000 | Elettrodo di aspirazione bipolare. Si noti che 573000 è stato sostituito con 573050. |
| Vetro capillare | Sistemi A-M | 626000 | Vetro capillare borosilicato a cilindro singolo senza microfilamento, lunghezza 10 cm, diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,50 mm |
| Elettrodo di stimolazione ad aspirazione alternativo | A-M Systems | 573050 | Elettrodo di aspirazione bipolare. Richiede un vetro capillare di diametro maggiore: 627000, diametro esterno 1,2 mm, diametro interno 0,68 mm |
| Stereoscopio | Lieca | GZ7 | Gamma di ingrandimenti, 10x - 70x |
| Sorgente luminosa in fibra ottica | Amscope | HL250-A | 150W Scatola luminosa per illuminatore per microscopio a fibre ottiche |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | acciaio inossidabile, molla diritta, 5,25" |
| Sonda di dissezione smussata | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Sonda del centro commerciale Huber, sonda a doppia estremità e cercatore, 6 " |
| Microforbici | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Forbici da microdissezione Iris, acciaio inossidabile, lame da 0,5 pollici, pinze fini lunghe 4,75 pollici |
| Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Pinze per gioiellieri, dumont n. 5, lega inox, 4,25" | |
| Pinze curve | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Punta media, pinza curva, acciaio inossidabile, |
| manico per bisturi | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Manici per bisturi, n. 3, lama |
| per bisturi | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Lame per bisturi, n. 11, |
| ghigliottina | Apparecchio Harvard | 73-1918 | Ghigliottina Kleine tipo 7575 |
| Spatola | Sigma | Z648299 | Micro cucchiaio e set di pesatura a spatola. Usa una spatola piccola: 5,9" lunghezza x 0,07" diametro manico con estremità quadrata: 0,17" x 1,3 pollici lungo, altro giro terminale: 0,17 " x 1,27 pollici |
| gancio | Autozone | 98069 | Set di ganci e grimaldelli SureBilt. Utilizzare la smerigliatrice per smussare le punte affilate del gancio per evitare lesioni alla bocca degli animali. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% di anidride carbonica equilibrio ossigeno miscela di gas standard certificata, dimensione 200 Cilindro, CGA-296 |
| Regolatore | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Regolatore a cilindro analitico monostadio in ottone 0-100 psi CGA-296 con uscita ad ago. Utilizzare una valvola del tubo dell'aria regolabile in ottone per passare da 3/8", diametro interno, tubo dell'aria in vinile collegato al regolatore a un diametro interno da 3/16", connessione dell'aria che va alla pipetta in pietra porosa o in vetro. |
| Valvola regolabile del tubo dell'aria | Dottori Foster e Smith | CD-12061 | Valvola in ottone |
| Tavolo rigido | Sconosciuto | Sconosciuto | Porta autoclave posta sopra un tavolo robusto. Nove palline da tennis da 5" di diametro isolano le vibrazioni dalla superficie superiore del tavolo. |
| 5" pallina da tennis | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: le palline non vengono affettate e tenute all'interno di un telaio integrato nella parte inferiore dello sportello dell'autoclave. |
| Tavolo alternativo di isolamento dalle vibrazioni | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Sistema rigido di controllo delle vibrazioni, integrità 1: Dimensioni della superficie, 3' x 6'Gimbal |
| ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stadio da SUPER III-A Scansione EM | Stadio eucentrico a 5 assi: movimenti lineari X, Y e Z, ± 20 mm, precisione 0,1 mm; Rotazioni verticali, & plusmn; 10 gradi, e orizzontale, ± 12,5°, con 1,25° precisione. Nota: dallo strumento di dismissione. | |
| Mandrino per gimbal | Sconosciuto | Sconosciuto | Il mandrino proveniente da un vecchio microtomo di fabbricazione sconosciuta è stato lavorato per adattarsi all'albero del portacampioni del |
| gimbal alternativo | ThorLabs, Inc. | GN2/M con MBT602/M | Goniometro a doppio asse (GN2/M) montato su tavolino a microblocco a 3 assi con regolatori a vite a testa zigrinata (MBT602/M): progettazione di un mandrino per tenere la testa di tartaruga con occhiello a 12,7 mm sopra la superficie superiore del goniometro (distanza dal punto di rotazione) |
| Sistema di tracciamento oculare basato su video | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Metodo di tracciamento: video a infrarossi con pupilla scura; Telecamera in bianco e nero (Art. BC02): 30 Hz, 640 x 480; Requisiti di sistema: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Campo visivo: Orizzontale +/- 44°; verticale +/- 20 gradi; Precisione ~0,5°; Risoluzione spaziale ~0,15°; Risoluzione della dimensione della pupilla ~0,03 mm; Dati oculari: posizione X, Y dello sguardo, altezza e larghezza della pupilla, torsione, tempo delta, tempo totale e regioni di interesse (ROI); Comunicazione in tempo reale (articolo 0022): AnalogOut a 4 canali con otto canali di ingresso TTL per contrassegnare i codici nel file di dati |
| Base magnetica multiposizione | Harbor Freight Tools | Pittsburg, articolo #5645 | Il supporto magnetico raggiunge fino a 12" e produce 45 libbre di trazione magnetica. Utilizzare per posizionare la telecamera. Infilare a macchina i fori sull'estremità dell'asta per montare le fotocamere. |
| Micromanipolatore | Kopf | 900 | Manipolazione a 5 assi per il montaggio dell'elettrodo di aspirazione: corsa lineare X, Y, Z, 2 assi di rotazione, |
| Cannocchiale di dissezione sul braccio | Lieca | GZ6 | Gamma di ingrandimento, 6,7x - 40x |
| Stimolatore nervoso/muscolare | Astro-Med Grass Telefactor Grass | S88 | Stimolatore di tensione a doppio impulso: due canali di uscita che possono essere azionati in modo indipendente o sincronizzato per generare impulsi di tensione costante non isolati (da 10 mv a 150 V). Gli impulsi possono essere singoli (10 μ sec a 10 sec), ripetitivo (da 0,01 Hz a 1 KHz) e treni (da 1 ms a 10 s) e sincronizzato con ingressi e uscite TTL. Inviate le uscite TTL tramite i canali di uscita di un connettore DB25 ai canali di ingresso TTL del ViewPoint EyeTracker. Nota: Astro-Med Grass Telefactor non è più in attività. |
| Dispositivo di isolamento di corrente | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Unità di isolamento di stimolo di corrente: consente l'erogazione sicura di correnti costanti da parte dell'S88 al preparato. Il PSIU6 si collega tramite un cavo BNC a uno dei canali di uscita dell'S88. Gli interruttori moltiplicatori sul PSIU6 consentono all'S88 di generare un'ampia gamma di ampiezze di corrente che vanno da 0,1 µ A a 15 mA. |
| Stimolatore nervoso/muscolare alternativo con isolamento | A-M Systems | 2100 | Stimolatore a impulsi isolato: L'unità è dotata di un isolatore incorporato per produrre correnti costanti. |
Riferimenti
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-42....
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Ristampe e permessi
