Method Article

Routine di metodo di Screening per microparticelle in trasfusioni della piastrina

DOI:

10.3791/56893

⸱

January 31st, 2018

 ,  ,  , 
1Research & Development, LightIntegra Technology Inc., 2Quality Engineering & Regulatory, LightIntegra Technology Inc., 3Department of Pathology and Laboratory Medicine; Center for Blood Research, University of British Columbia, 4Canadian Blood Services

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gestione del magazzino della piastrina basato su contenuti di microparticelle in concentrati piastrinici di screening è una nuova iniziativa di miglioramento di qualità in banche del sangue. L'obiettivo è quello di differenziare attivato dalle piastrine non attivato per ottimizzare l'uso delle piastrine. Fornendo le piastrine non attivato ai pazienti di Ematologia-Oncologia potrebbe ridurre il loro rischio alto per diventare refrattario.

Abstract

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Gestione del magazzino della piastrina basato su contenuti di microparticelle in concentrati piastrinici di screening è una nuova iniziativa di miglioramento di qualità per banche del sangue. Frammento di cellule fuori microparticelle (MP) quando sono stressati. Sangue e i suoi componenti possono contenere frammenti cellulari da una varietà di cellule, in particolare da piastrine attivate. Quando si eseguono loro ruoli come cellule dell'immunità innata e principali attori in coagulazione e del hemostasis, piastrine cambiano forma e generano microparticelle. Con diffusione dinamica della luce (DLS)-base di rilevamento microparticella, è possibile differenziare attivato (alta microparticella) dalle piastrine non attivato (basso microparticella) nelle trasfusioni e ottimizzare l'uso di questo prodotto di sangue scarso. Ricerca precedente suggerisce che fornendo le piastrine non attivato per uso profilattico in pazienti di Ematologia-Oncologia potrebbe ridurre il loro rischio di diventare refrattario e migliorare la cura del paziente. L'obiettivo di questo metodo di screening è ordinariamente differenziare attivato dalle piastrine non attivato. Il metodo qui descritto viene descritta la procedura da eseguire per la gestione dell'inventario sistematico delle piastrine in una banca del sangue: ottenendo un campione da una trasfusione di piastrine, caricamento del campione nel capillare per la misurazione di DLS, eseguendo il DLS prova a identificare le microparticelle e utilizzando il contenuto segnalato microparticelle per identificare le piastrine attivate.

Introduction

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L'interesse in microparticelle ha ruotava principalmente intorno a loro coinvolgimento nei processi di comunicazione e biologico-cellula delle cellule. 1 , 2 , 3 più di recente, microparticelle hanno anche attirato interesse come potenziale marker precoce di diagnostica delle malattie autoimmuni e cardiovascolari. 4 , 5 microparticelle, noto anche come extracellulare vescicole o esosomi, ampiamente sono state studiate mediante citometria a flusso. Purtroppo, nonostante gli sforzi per standardizzare i protocolli di cytometry di flusso convenzionale non ci è consenso sul protocollo ottimo da utilizzare. 6 , 7 , 8 , 9 , 10

Anche se la citometria a flusso convenzionale può caratterizzare specifiche sottopopolazioni di MP,11 ha molte segnalato limitazioni. 11 , 12 , 13 , 14 alcune di queste limitazioni sono stati risolti utilizzando laser di potenza superiore e rivelatori di un cosiddetto "opzione di piccole particelle",15,16 , nonché rilevamento in avanti di 15 ° - 25 ° angolo di dispersione e modificato guaina pressione . 17 , 18 tuttavia, un metodo di screening rapido e facile da usare che può essere combinato con questi metodi sofisticati è ancora necessario utilizzare microparticelle come marcatori diagnostici precoci. I livelli elevati di microparticelle sono rilevabili in circa un terzo dei donatori di sangue normale19 e potrebbero indicare condizioni infracliniche. Di conseguenza, microparticella alti livelli nei prodotti di donazioni di sangue potrebbero essere incompatibili con i destinatari vulnerabili. 20

Quando si forniscono le trasfusioni della piastrina, c'è un rischio di refrattarietà non immune - una condizione in cui il corpo di un paziente rifiuta le trasfusioni consecutive e non consente una porzione significativa delle piastrine a circolare. 21 , 22 refrattarietà Non-immune può causare le trasfusioni sprecate, complicazioni di salute per i pazienti e ospedale estesi soggiorni. 23 le trasfusioni della piastrina contenente un numero elevato di microparticelle possono essere un fattore di contributo per lo sviluppo della refrattarietà non immune in pazienti vulnerabili di Ematologia-Oncologia. 20 è possibile gestire l'inventario delle piastrine secondo la composizione di trasfusioni piastriniche di screening per microparticelle riducendo quindi il rischio per i pazienti vulnerabili. Tuttavia, la maggior parte microparticella test richiedono l'isolamento delle microparticelle da piastrine5,12 o sono altrimenti molto labor intensive24,25 e pertanto non può essere attuato regolarmente in ospedale banche del sangue.

La tecnica descritta qui usa la dispersione della luce dinamica (DLS) - noto anche come spettroscopia a correlazione di fotoni o diffusione quasi elastica della luce. Per decenni, dispersione della luce dinamica è stato ampiamente utilizzato nell'industria farmaceutica per caratterizzare formulazioni liposomiali farmaci o emulsioni dove le dimensioni delle particelle sono nella gamma sub-micron. 26 , 27 tuttavia, strumenti sviluppati per queste applicazioni non sono ottimizzati per emoderivati di schermo. Un nuovo sistema di liste di distribuzione è stato sviluppato per superare i limiti tecnici e rendere la diffusione dinamica della luce utile per lo screening di trasfusioni piastriniche. 28

Dispersione della luce dinamica misurazioni eseguite illuminando le particelle in sospensione con luce laser e analizzando la variazione di tempo dell'intensità luminosa sparsi che è una conseguenza delle particelle in sospensione in movimento. Inoltre, questo metodo utilizza la relazione inversa tra la velocità della particella e dimensione - piccole particelle si muovono velocemente e grandi particelle si muovono lentamente - per fornire informazioni sulle distribuzioni per ampiezza e relative concentrazioni dei componenti del campione. Utilizzando DLS, le microparticelle di medio raggio di contenuti e medio del componente microparticella può essere quantificato. Il contenuto delle microparticelle nell'emocomponente è dato % MP sulla base della superficie nell'istogramma misurato per raggi di particelle da 50-550 nm. Mentre le particelle con raggi inferiori a 50 nm sono rilevati dal DLS e segnalati dal sistema di liste di distribuzione, non sono inclusi in % MP. Piuttosto che isolare microparticelle dalle piastrine, l'eterogeneità delle trasfusioni della piastrina è determinato sulla base del relativo contenuto in un campione di microparticelle e piastrine. Infatti, il rapporto tra le cime della piastrina e microparticelle può essere utilizzato per calcolare la concentrazione assoluta di MP quando il conteggio delle piastrine è noto. 19

Il sistema di liste di distribuzione fornisce operatori sanitari con informazioni qualitative e quantitative su microparticelle trovate negli esemplari derivati da sangue o emoderivati. Il vantaggio principale della tecnica DLS descritto sopra tecniche alternative quali la citometria a flusso, microscopia elettronica,29 nanoparticle tracking analysis30 o impulso resistivo sintonizzabile31 di rilevamento è la preparazione del campione: le aliquote di concentrati piastrinici possono essere misurate direttamente senza la necessità di isolare MP da piastrine, diluizione del campione o altre modifiche. 9 , 17 inoltre, DLS è un metodo di ridimensionamento assoluto e non soffre la mancanza di perle di calibrazione con indice di rifrazione appropriato. 14 , 32

Una correlazione tra l'attivazione della piastrina e MP contenuto precedentemente è stata indicata da microscopia33,20 e possa essere dedotte dall'aumento nel contenuto di MP in condizioni patologiche15,34, 35 , 36 e in condizioni in vitro conosciute per attivare le piastrine. 19 , 37 , 38 tuttavia, ulteriori studi sono necessari per comprendere appieno il rapporto di attivazione della piastrina e contenuto microparticella DLS-misurato. Basate sulla nostra conoscenza attuale che le piastrine attivate contengono un numero elevato di microparticelle, essi sono i migliori utilizzati per il trattamento terapeutico di spurgo attivamente pazienti39, mentre Ematologia-Oncologia pazienti beneficiano non attivato piastrine con no o bassi livelli di microparticelle20. Recentemente è stato segnalato che in vitro la reattività delle piastrine del donatore non ha impatto significativamente il recupero e la sopravvivenza di queste piastrine nel singole trasfusioni per pazienti stabili, per lo più non-spurgo di Ematologia-Oncologia40 . Da questa constatazione, si potrebbe concludere che l'attivazione della piastrina identificato dall'alto contenuto di MP inoltre non svolge nessun ruolo significativo nel trattamento profilattico di pazienti. Tuttavia, a causa della stretta selezione dei pazienti, questo studio non ha affrontato l'impatto dei fattori di donatore per pazienti complessi che sono febbrili (esclusi dallo studio), non stabile e ricevere molti più di una trasfusione di piastrine. La questione di come è possibile ridurre la complessità di questi casi di pazienti - che mantiene la promessa di ridurre la refrattarietà - rimane senza risposta.

Microparticelle sono marker precoce di infiammazione41,42,43,della piastrina e44 attivazione45 e pertanto vengono rilevate in molti donatori sani. 19 di conseguenza, le piastrine attivate e microparticelle sono presenti nelle donazioni della piastrina. È ragionevole ipotizzare che i pazienti con febbre, vale a dire, un completamente attivato sistema immunitario innato, non possono tollerare la sfida aggiuntiva di una trasfusione di piastrine attivate. Tuttavia, gli studi sono necessari per provare questa ipotesi. Lo screening microparticella può alleviare l'attuale incertezza circa il contenuto di trasfusioni piastriniche e ridurre la complessità del trattamento del paziente.

Il rapporto delle piastrine attivate per non attivato in una banca del sangue dipende principalmente sulla popolazione dei donatori e in misura molto minore per i trasporti, irradiazione, inattivazione dell'agente patogeno e altri processi che potrebbero aumentare l'attivazione piastrinica in concentrati. 19 dati dalle principali banche del sangue negli Stati Uniti ha mostrato che la composizione media dell'inventario della piastrina è attivato di 49% e 51% non attivato (fascia per piastrine attivate: 38-62%, comunicazioni personali). Se i fornitori di prodotti del sangue o banche del sangue vuole sapere quanti concentrati della piastrina attivati e non attivati producono o ricevere e desidera gestire il proprio inventario basato sull'attivazione piastrinica come indicato da microparticelle di contenuto, questo protocollo potrebbe essere appropriato per loro.

Basato sulla composizione della piastrina una banca del sangue sarà in grado di indirizzare le piastrine non attivato, omogenee per profilassi e attivata, piastrine eterogenee per uso terapeutico. Lo screening della piastrina permette agli ospedali di massimizzare l'utilizzo dell'inventario disponibile che migliora la cura del paziente e riduce il costo. Questo protocollo è destinato per il personale di laboratorio che hanno familiarità con la gestione di base e la manipolazione di prodotti del sangue.

Presentato qui è un metodo di screening per microparticelle in trasfusioni della piastrina che possono applicarsi ordinariamente per gestire l'inventario di banca del sangue di ospedale dove selezionando prodotto basato sul contenuto di microparticelle è auspicabile. L'obiettivo del presente protocollo è quello di delineare l'attuazione e la valutazione delle liste di distribuzione per lo screening delle piastrine donate. Il protocollo descritto riguarda le domande comuni di accesso non invasivo ai campioni, integrazione del test nel flusso di lavoro di banca del sangue e caratteristiche prestazionali.

Protocol

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Il seguente protocollo è stato eseguito nel rispetto di tutte le linee guida di Canadian Blood Services (CBS). Volontari hanno dato il consenso che le loro donazioni potrebbero essere utilizzati per effettuare questi studi. Concentrati piastrinici sono stati preparati secondo procedure operative standard CBS. Tutti i test delle prestazioni descritto qui è stato effettuato presso il centro per la ricerca di sangue presso la University of British Columbia, Vancouver, Canada con approvazione istituzionale del Comitato di etica della ricerca.

1. controllo di qualità

  1. Eseguire un controllo di qualità di controllo almeno una volta al giorno per verificare il corretto funzionamento del sistema di liste di distribuzione di test. Misurare le perline di controllo fornito (50 raggio nm) seguendo le istruzioni del produttore per l'uso.
  2. Recuperare il flacone di controllo da celle frigorifere e consentire 15 min a temperatura ambiente. Le perle devono equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso.
  3. Accendere il sistema di liste di distribuzione prima di preparare il campione così il laser 15 min periodo di preriscaldamento è completato entro il tempo che il primo campione è pronto per il test.
  4. Una volta che la console è avviato, seguire le istruzioni sullo schermo di tocco per il login e selezionare l'opzione di sistema Test per misurare il campione di controllo.
  5. Vortice mescolare il flaconcino per 10 s per garantire un campione rappresentativo.
  6. Riempire un vaso capillare con i branelli di controllo usando una pipetta a volume fisso µ l 100, puntale e capillare da kit di test.
  7. Quando il test è stato completato, seguire le istruzioni sullo schermo del sistema liste di distribuzione.
    Nota: I risultati del test di perlina di controllo automaticamente vengono confrontati con le informazioni memorizzate sull'etichetta di codice a barre di controllo perlina e un PASS o FAIL notifica, nonché informazioni di esempio sono mostrate sullo schermo del sistema di liste di distribuzione alla fine del test.

2. ottenimento di un campione da un concentrato della piastrina

Nota: Questa procedura viene descritto il processo per il campionamento non invasivo dalla trasfusione della piastrina in liste di distribuzione capillare per la gestione dell'inventario sistematico della piastrina di test. Una panoramica è illustrata nella Figura 1. Richiesta accessori: tubo sigillante, spogliarellista manuale tubo, forbici e scudo di spruzzo.

  1. Rimuovere il concentrato della piastrina dall'inventario non testato.
  2. Ottenere il campione del prodotto della piastrina sia da un sacchetto di campionamento inutilizzati (procedere al punto 2.3) o un segmento di tubazione (passare al punto 2.4 se vuoto o passo 2.5 se non è vuota).
    Per disconnettere il sacchetto della tubazione o segmento di tubazione utilizzare un sigillante di tubo. Per far funzionare il sigillante di tubo, seguire le istruzioni del produttore. Brevemente, assicurare il tubo flessibile per essere sigillato in una posizione precisa tra due ganasce riscaldate. In un dispositivo palmare, premere il tubo fuso insieme e raffreddare sotto alta pressione mentre si preme la leva (la durata è indicata dalla luce verde) risultante in un sigillo permanente, a tenuta stagna.
  3. Campionamento da una busta
    1. Mescolare bene il contenuto della borsa della piastrina delicato movimento orizzontale per 5 s (ribaltamento dall'inizio alla fine cinque volte).
    2. Aprire il morsetto nella busta. Il sacchetto viene evacuato e riempirà di per sé. Non è necessario riempire il sacchetto completamente come solo 100 µ l di campione sarà necessario per i test di liste di distribuzione.
    3. Scollegare il sacchetto dal sacchetto con un tubo di collegamento della termosaldatura con un sigillante di tubo. Continuare con il passaggio 3.
  4. Campionamento da un tubo vuoto
    1. Verificare che la piastrina borsa della tubazione è stata memorizzata vuota e il blocco di tubazione è ancora al suo posto. Ispezionare visivamente il tubo per verificare che non vi sia una notevole quantità di concentrato della piastrina della tubazione. Se il tubo non è vuoto, continuare con il passaggio 2.5.
    2. Chiudere la spogliarellista tubo sul tubo come vicino al blocco di tubazione come possibile comprimendo le maniglie per spremere il tubo tra i rulli.
    3. Appendere il sacchetto in verticale e mantenere la compressione le maniglie di spogliarellista.
    4. Mentre mantenendo la spogliarellista chiuso, rilasciare il blocco della tubazione.
    5. Tirare lentamente la spogliarellista giù il tubo vuoto permettendo per il tubo a riempire lentamente dietro la spogliarellista. Continuare fino a quando la sezione sotto la spogliarellista ha completamente gonfio o la spogliarellista è all'interno di 1 pollice dell'estremità del tubo.
    6. Una volta raggiunto il punto di arresto con la spogliarellista, uso il sigillante del tubo di calore sigillare il tubo da 1 pollice sopra la spogliarellista.
    7. Rilasciare le maniglie della spogliarellista manuale tubo.
    8. Saldatura a caldo nuovo 1 a 2 pollici sopra il sigillo precedente per creare il segmento test.
    9. Tagliare il segmento test dall'unità della piastrina. Questo segmento verrà utilizzato per test di liste di distribuzione.
  5. Campionamento da un tubo che non è vuoto
    1. Appendere la borsa verticalmente e rilasciare il blocco della tubazione in caso di posto.
    2. Ispezionare visivamente il tubo per determinare se ci sono eventuali grumi solidi significativi. In presenza di grumi solidi, guarnizione sopra di loro tale che questi non possono essere eliminati nel sacchetto.
    3. Chiudere la spogliarellista tubo sul tubo come vicino l'estremità sigillata del tubo come possibile.
    4. Striscia il contenuto del tubo nel sacchetto comprimendo le maniglie per spremere il tubo tra i rulli e, pur mantenendo la forza di serraggio, spostare la spogliarellista di tubo lungo la tubazione verso la borsa.
    5. Rimuovere il sacchetto della piastrina da ganci e mescolare delicatamente il sacchetto per 5 s capovolgendola dall'inizio alla fine cinque volte, mantenendo la spogliarellista chiuso.
    6. Appendere il sacchetto in verticale, mantenendo la spogliarellista chiusa.
    7. Tirare lentamente la spogliarellista giù il tubo vuoto, consentendo per il tubo a riempire lentamente dietro la spogliarellista. Continuare fino a quando la sezione sotto la spogliarellista ha completamente gonfio o la spogliarellista è all'interno di 1 pollice dell'estremità del tubo.
    8. Una volta raggiunto il punto di arresto con la spogliarellista, uso il sigillante del tubo di calore sigillare il tubo da 1 pollice sopra la spogliarellista.
    9. Rilasciare la spogliarellista.
    10. Saldatura a caldo nuovo 1 a 2 pollici sopra il sigillo precedente per creare il segmento test.
    11. Tagliare ed eliminare l'ultima parte del tubo.
    12. Tagliare il segmento test dall'unità della piastrina. Questo segmento verrà utilizzato per test di liste di distribuzione.

3. il campione di riempimento in liste di distribuzione capillare di test

  1. Utilizzando una spruzzata scudo e pulire, asciugare le forbici, tagliare un'estremità del sacchetto della tubazione o il test di segmento.
    Nota: Il capillare utilizzato per DLS test deve essere riempito immediatamente.
  2. Riempire il vaso capillare utilizzando lo strumento di campionamento (pipetta a volume fisso assemblato 100 µ l, punta della pipetta e capillare) per prelevare il campione direttamente dal sacchetto aperto o segmento di tubazione nel capillare.
  3. Sigillare il fondo del vaso capillare riempito spingendo delicatamente il capillare riempito nel sigillante tubo capillare durante l'applicazione di un tocco delicato e un po' di pressione contro il vassoio.
  4. Scollegare il 100 µ l fissa la pipetta a volume e punta dal capillare, garantendo il capillare resta saldamente inserita nel sigillante tubo capillare.
  5. Rimuovere il capillare dal vassoio del sigillante del tubo capillare, pulire con un tampone di alcool isopropilico e garantire che non sono bolle d'aria muovendo delicatamente il fondo del vaso capillare.
  6. Inserire il capillare il sistema di liste di distribuzione.

4. esecuzione della prova di DLS

  1. Selezionare l'opzione di test MP per avviare un nuovo test DLS per misurare il contenuto di microparticelle di un campione della piastrina.
  2. Immettere le informazioni di esempio (numero di identificazione di donazione (ISBT), raccolta/produzione data di scadenza e codice prodotto) utilizzando lo scanner di codici a barre o manualmente.
  3. Se non è disponibile alcun codice prodotto da cui il sistema di liste di distribuzione possono estrarre le informazioni medie fluide, selezionare manualmente il mezzo fluido appropriato (per la maggior parte delle piastrine concentrati selezionare al plasma ma per campioni contenenti soluzione additivo della piastrina (PAS), immettere il percentuale di plasma residuo).
    Nota: Una piccola deviazione della percentuale di PAS dal nominale 65% causerà un piccolo errore della viscosità (calcolato automaticamente dal sistema di liste di distribuzione) che interessa minimamente il calcolato raggio di MP ma non % MP.
  4. Inserire il capillare il sistema di liste di distribuzione quando richiesto e avviare il test.
  5. Al termine del test, è possibile rimuovere l'esempio dal titolare capillare e smaltire i materiali di consumo in modo appropriato secondo le linee guida di impianto. Rimuovere l'esempio dal titolare capillare e smaltire i materiali di consumo in modo appropriato secondo le linee guida di impianto.
  6. Tag il sacchetto della piastrina con il colore corrispondente al risultato, ad esempio arancio per non attivato (omogeneo) con % MP uguale o inferiore al 15% e rosa per attivato (eterogenei) con % MP superiori al 15%.

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Figura 1 : Panoramica metodo. Panoramica dei passaggi da eseguire per la gestione dell'inventario sistematico delle piastrine in una banca del sangue: ottenendo un campione da una piastrina concentrato, caricamento del campione nel capillare per la misurazione di DLS, eseguendo il DLS test per individuare le microparticelle e utilizzando la microparticella segnalato contenuto per identificare le piastrine attivate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Results

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Tempo di preparazione medio
La piastrina processo utilizzando un sistema di liste di distribuzione di screening è riassunto nella Figura 1. Le piastrine sono testate con il sistema di liste di distribuzione al momento della ricevuta direttamente dall'offerente sangue. Come dettagliato nella tabella 1 , il tempo di preparazione medio per gli utenti addestrati è 2 min 23 s mentre il clean-up e tempi di lavoro di post-test sono 14 s e 46 s, rispettivamente. In totale, l'utente medio prende 3 min e 23 s di hands-on tempi per i test.

AttivitàTempo attivoTempo di prova walk-awayTOTALE
Preparare il sistema di liste di distribuzione14 s
Assemblare strumento di campionamento28 s
Ottenere il segmento52 s
Riempimento capillare e avviare test49 s
5 min
Pulizia14 s
Borsa della piastrina tag e inventario46 s
Tempo totale necessario per campione3 min 23 s5 min8 min 23 s

Tabella 1: ripartizione di tempo test attivo. La stessa prova è un test di distanza a piedi con una durata media di 5 min. L'utente medio prende 3 min 23 s per preparare il sistema di liste di distribuzione per un test, ottenere e testare un campione seguendo questo protocollo e tag il sacchetto della piastrina.

Precisione
La precisione del sistema DLS è stata valutata a tre livelli di microparticelle, 0-7%, 12-25% e il 28-75%. La gamma clinicamente rilevante di % MP è 3-75%. Due operatori testato campioni di controllo di bassa, media e alta per 16 giorni di funzionamento su due sistemi di liste di distribuzione in parallelo. I campioni sono stati testati in duplicato, ma in ordine casuale su ogni giornata di test.

La tabella 2 riassume la precisione all'interno del dispositivo delle misurazioni relative piastrine DLS per microparticelle per cento (% MP).

Contenuto di microparticelle
BassoMedioAlta
Dire % MP (%)4.419,553,8
Deviazione standard (%)1.82.65.8
CV (%)40,413.210.6

Tabella 2: precisione all'interno del dispositivo di microparticelle per cento (% MP). Alle microparticelle bassissimo contenuto piccole piastrine possono contribuire alla % MP conseguente aumentata variabilità per microparticella basso contenuto campioni.

La tabella 3 Mostra la precisione all'interno del dispositivo delle misurazioni DLS per microparticella medio raggio tra 50-550 nm.

Contenuto di microparticelle
BassoMedioAlta
Significa raggio (nm)331161188
Deviazione standard (mm)1334125
CV (%)40.125,213,5

Tabella 3: precisione all'interno del dispositivo del raggio microparticella. Alle microparticelle bassissima contenute piccole piastrine possono contribuire a microparticelle per cento (% MP) con conseguente aumentata variabilità per microparticella basso contenuto campioni.

La tabella 4 Mostra la riproducibilità delle misurazioni DLS per microparticelle per cento (% MP).

Contenuto di microparticelle
BassoMedioAlta
Dire % MP (%)4.429.253,6
Riproducibilità (%)1.52.35
CV (%)3511,89.4

Tabella 4: Riproducibilità delle misurazioni Dynamic Light Scattering (DLS) per microparticelle per cento (% MP).

Linearità
Figura 2 Mostra che DLS risultati sono lineari, cioè, forma una linea retta per quanto riguarda i valori assegnati dei campioni. Sette campioni sono stati preparati con differenti contenuti di microparticelle. Campioni ad alta (MP7) e basso contenuto di microparticelle (MP1) e corrispondente concentrazione di piastrine sono stati preparati e miscelati in proporzioni diverse per creare campioni intermedi (MPx). I campioni sono stati testati con citometria a flusso, come descritto in precedenza19 e liste di distribuzione e risultati % MP a ciascuna concentrazione sono stati tracciati come input e output. Il coefficiente di determinazione è stato trovato per essere 0.985. Esempi di istogrammi DLS per contenuto di microparticelle di alta e bassa sono mostrati in Figura 3A. I risultati di liste di distribuzione sono stati confermati da citometria a flusso (Figura 3B).

figure-results-1
Figura 2 : Confronto di citometria a flusso e risultati DLS. Relazione lineare tra % MP determinata dalla citometria a flusso (ingresso) e liste di distribuzione (in uscita), i dati DLS originali dai due campioni segnati dall'aperto simbolo ○ sono mostrati nella Figura 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 3 : Contenuto di microparticelle di differenziare tra le piastrine attivate e non attivato. (A) DLS risultati dei contenuti MP in piastrine attivate (linea tratteggiata) era 57% rispetto al 4% in piastrine non attivato (linea continua). Prove sono state eseguite ad una temperatura di misurazione di 37 ° C, impostazione di viscosità del plasma di 1,06 x10-3 PA · s e le impostazioni di intensità totale tra 200-600 kHz. (B) flusso cytometry risultati (ottenuti come descritto in precedenza19) dei campioni stessi come mostrato in (A); negli istogrammi forward scatter P1 e P2 rappresentano i cancelli della piastrina e MP, rispettivamente; per piastrine attivate (sinistra) 76% degli eventi è caduto nel cancello MP rispetto al 6% per le piastrine non attivata (a destra). La retta di regressione lineare suggerisce un costante contributo relativo del rumore di fondo al % MP da citometria a flusso che conduce ai risultati consistentemente più alti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Specificità/interferenza
L'International Organization for Standardization (ISO) definisce la specificità analitica come la possibilità di una procedura di misurazione per rilevare o misurare solo il misurando, mentre ci sono altre grandezze presenti nel campione. La specificità analitica di microparticelle screening potrebbe essere influenzata dai globuli rossi (RBC). DLS misura MP contenuto rispetto al contenuto della piastrina. RBC potrebbe interferire perché il contributo di scattering di RBC è incluso nel contributo scattering delle piastrine, riducendo il contributo relativo di MP. Esistono limiti normativi per il contenuto di RBC ammissibile in emoderivati; una conversione conservatrice della soglia consigliato da AABB per concentrazione ammissibile di RBC in piastrine concentrati-2 mL di globuli rossi in una sola unità di piastrine-provocato 8.0 x1010 cellule/L (ipotesi: RBC volume è 8.5 x10-14L, ematocrito di RBC imballato è del 68%, volume dell'unità delle piastrine è di 200 mL). Le concentrazioni in RBC residuale segnalate in prodotti diversi sono ben di sotto di questa soglia46.

Tre diversi donatori hanno donato le piastrine e globuli rossi (RBC) in due giorni diversi, come ammissibili, per tre esperimenti indipendenti. Il contenuto iniziale di RBC nei concentrati piastrinici (campione di riferimento) era 0.05 - 0.15 x109 cellule/L come determinato con un emocitometro. Cinque campioni supplementari sono stati creati da chiodare-in quantità note di RBC in aliquote del concentrato della piastrina; i livelli di destinazione RBC in questi campioni erano 1.0, 5.0, 10, 40 e 80 x109 cellule/L.

La soglia di interferenza dei globuli rossi era circa 1,0 x1010 cellule/L (Figura 4), che inoltre ha correlato con il livello a cui la presenza di globuli rossi era visivamente evidente (Figura 5). Sopra questo livello, % MP è stato sottovalutato che significa che in visivamente rosso campioni-che contengono RBC anziché microparticella segnalati dell'emoglobina, il contenuto sarà troppo bassa.

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Figura 4 : Relazione lineare tra % MP (DLS) e concentrazione di RBC (cellule/L). Aumento delle concentrazioni di RBC di 0,1 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010e 8.0 x1010 cellule/L (da sinistra a destra) da 3 esperimenti indipendenti (○ esperimento 1, ● esperimento 2, □ esperimento 3, linee di regressione lineare vengono visualizzati per ciascun esperimento.) Superiore a 1,0 x1010 RBC/L conduce alla sottovalutazione del % MP. Aspetto visivo dei campioni contenenti RBC è illustrato nella Figura 5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5 : Aspetto visivo di RBC contenente campioni. Arrossamento della piastrina campioni contenenti concentrazioni in RBC di 0.1 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010e 8.0 x1010 cellule/L da sinistra a destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Precisione
Precisione è definita come la differenza tra un risultato di misurazione singola e un valore di vera quantità assegnate al campione. Questo errore di misura include un componente sistematica stimato da bias di misurazione e una componente casuale stimato da una deviazione standard. Così, la precisione di un risultato di misurazione è una combinazione di esattezza e precisione.

Un tallone standard è stato utilizzato per determinare l'accuratezza del test DLS. Precisione è stata valutata a due concentrazioni all'interno della gamma clinicamente rilevante del dosaggio di 3-75% MP. Miscele di riferimento sono state utilizzate per preparare campioni di concentrazioni note perché perle di riferimento hanno una dimensione nota e concentrazione. Di conseguenza, perle di riferimento possono essere miscelati per ottenere campioni con concentrazioni e granulometria desiderata.

Perle di polistirolo standard con un raggio di 125 nm sono stati usati per rappresentare le microparticelle e sfere con 1,5 µm raggio sono stati utilizzati per rappresentare le piastrine. La precisione del dosaggio microparticella è stata valutata con miscele di circa 20% e 50% contenuto di MP. La precisione dei raggi misurati delle particelle è stata confrontata con i raggi di particelle documentati su certificati di analisi per le perle di riferimento come mostrato nella tabella 5.

perle di 125 nm1,5 µm perline
Certificato di analisiCertificato di analisi
20% MP50% MP20% MP50% MP
Significa raggio122.0113,8124.41.51.61.60
std Dev4.52,833.60,0350,060.07
CURRICULUM VITAE3.60%2,48%2,89%2.20%3.74%4,05%
Precisione6.70%2,00%6,50%6,30%

Tabella 5: precisione delle misure di Scattering di luce dinamico (DLS). Confronto di formato per DLS risultati contro il certificato di analisi per perline con 125 nm raggio e raggio 1,5 µm in miscele.

Discussion

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Questo protocollo descrive un metodo di diffusione dinamica della luce per lo screening di microparticelle ottimizzato per la concentrazione di particelle ad alta che si trovano in campioni biologici come i concentrati della piastrina. Il metodo di DLS è intrinsecamente standardizzato per misurare con precisione la dimensione. La concentrazione relativa di microparticelle può essere convertita in una concentrazione assoluta, se la concentrazione di piastrine è nota e l'area del picco della piastrina è usato come il picco di riferimento19. Come piastrina concentrazioni sono ottenute solitamente con analizzatori ematologici o citometri a flusso questi metodi possono essere considerati tecnologie compagno a liste di distribuzione.

La funzionalità del sistema DLS è assicurata mediante l'esecuzione di microsfere di controllo regolarmente. Acqua distillata può essere misurato per verificare che il rumore di fondo è minimo. Gli standard disponibili nel commercio della piastrina possono essere analizzati come comandi MP-negativi e, dopo l'aggiunta di perline di raggio 125 nm, come controlli di MP-positivi. All'interno le concentrazioni di gamma biologica di MP di interesse, le procedure sono pratico e veloce da eseguire come parte della banca del sangue di routine.

Al contrario di citometria a flusso, questo metodo non si basa sul confronto tra le intensità di dispersione delle particelle, ma piuttosto la velocità del loro moto browniano. Così, gli esosomi possono essere individuati anche nonostante le loro piccole dimensioni e sono riportati separatamente da MP.

Concepito come uno strumento di screening, le limitazioni di questo metodo sono legate alla sua incapacità di distinguere tra diversi tipi di microparticelle. Non c'è margine potenziale di miglioramento se vengono utilizzate fasi di isolamento aggiuntivo. i campioni potrebbero essere testati prima e dopo la rimozione specifica di microparticelle attraverso anticorpo accoppiato cattura di biglie magnetiche. Inoltre, non si può presumere che tutti rilevati microparticelle sono cellule derivate perché chilomicroni formati in iperlipidemia47,48 e piccoli batteri o virus6 verranno segnalati anche nella gamma microparticella. Tuttavia, altre garanzie esistono all'interno il rifornimento di sangue per evitare altamente lipemici o contaminati le piastrine per immettere l'inventario di banca del sangue di ospedale.

La scelta di anticoagulante nel campione incide sull'estensione dell'attivazione piastrinica e quindi il contenuto di MP49. Per i confronti di prodotti diversi questo fattore deve essere considerato. Inoltre, scambio di plasma con supporti sospensione libera MP come PAS influenzerà il contenuto di MP e la soglia per la determinazione di eterogeneità-se solo circa un terzo del contenuto MP originale viene lasciato all'interno del plasma residuo nel concentrato un MP contenuto soglia indicherà lo stesso livello di attivazione della piastrina come 100% del plasma di conseguenza inferiore. Percentuale MP è il tenore di MP rispetto le piastrine. Precedentemente è stato segnalato che il conteggio delle piastrine medio del prodotto PAS era inferiore in modo che il medio % MP era ancora 9,5%19. La soglia di % MP per le piastrine PAS in licenza negli Stati Uniti è attualmente impostata al 10%.

Mentre la fonte primaria di MP in concentrati piastrinici è il donatore, i processi che causano stress alle piastrine aumenterà il livello di MP a seconda della suscettibilità delle piastrine a sottolineare-se le piastrine sono attivate già altamente, minori fattori di stress come Extended shelf life, inattivazione dell'agente patogeno, lavatrice, irradiazione o trasporto su lunga distanza potrebbe portare ad aumento significativo nel contenuto di MP. Nessuno di questi fattori di stress sono stati indicati per incidere in maniera omogenea, non attivata piastrine19. Inoltre, l'attenzione dovrebbe essere pagato al potenziale per i cambiamenti nella composizione del campione all'interno del capillare se non testato immediatamente dopo la preparazione (completamento del punto 3 del presente protocollo).

Il fuoco di questo protocollo è il determinare la composizione delle particelle presenti in trasfusioni della piastrina e di utilizzare microparticelle come biomarcatori dell'attivazione della piastrina. Le trasfusioni di piastrine sono contrassegnate come non attivato (arancio) o attivate (rosa) basato su una soglia percentuale di microparticelle del 15%. La soglia del 15% MP per le piastrine nel plasma di 100% è stato determinato empiricamente come il percentile dith media 66 da più siti.

L'obiettivo della gestione dell'inventario della piastrina basato su routine microparticella di screening con DLS è di migliorare l'efficienza di costo cura e unità paziente impedendo la refrattarietà della piastrina non immune. L'implementazione del sistema per lo screening dei sacchetti della piastrina DLS consentirà all'utente di indirizzare le piastrine non attivato per popolazioni di pazienti più a rischio per lo sviluppo di refrattarietà della piastrina.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EMS è il fondatore di LightIntegra Technology Inc., un'azienda di dispositivi medici per sviluppare il sistema di ThromboLUX di microparticelle e prova di qualità della piastrina. Tutti gli altri autori sono dipendenti della tecnologia LightIntegra. Produzione e accesso gratuito a questo articolo sono sponsorizzati da LightIntegra Technology Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo i donatori di sangue e il personale Canadian Blood Services Network Centre per sviluppo applicato per raccolta e di produzione delle unità della piastrina utilizzata in questo studio. Riconosciamo la Fondazione canadese per l'innovazione e la Fondazione di Michael Smith per ricerca di salute per il finanziamento delle infrastrutture presso il centro di UBC per la ricerca di sangue. Finanziamenti per la pubblicazione è stato fornito da LightIntegra Technology Inc., produttore di ThromboLUX.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ThromboLUX-MLightIntegra Technology Inc.LPN120Sistema DLS
ThromboSight SoftwareLightIntegra Technology Inc.di analisi DLSLPN124
CapillariesLightIntegra Technology Inc. (incluso nel kit di test, fornitore Optinova MLE)LPN065Tubo in plastica estruso personalizzato non attivante, non birifrangente, ispezionato e irradiato
MiniPet LightIntegra Technology Inc. (incluso nel kit di test, fornitore TriContinent Scientific)LPN082100 µ L pipetta a volume fisso per campionamento   
MicroFlex 1-200 & micro; L Puntali per pipetteLightIntegra Technology Inc. (incluso nel kit di test, fornitore ESBE Scientific)LPN080Puntali per pipette per campionamento
Critoseal LightIntegra Technology Inc. (incluso nel kit di test, fornitore Fisher Scientific)LPN075Sigillante per tubi capillari
Dukal Alcohol Pad o equivalenteLightIntegra Technology Inc. (incluso nel kit di test, fornitore Dukal Corp.)LPN085Pad isopropilico (saturo con alcool isopropilico al 70%)
Perle di controllo, raggio 50 nmLightIntegra Technology Inc. (incluso nel kit di test, fornitore PolySciences Inc.)LPN128Perle di controllo
Microsfere NIST Dimensione delle particelle tracciabile standard, 3 &; mPolySciences Inc.64060Microsfere standard: 1,5 & micro; raggio m Perline di polistirene; gamma 1,43-1,58 & micro; m; Sospensioni di solidi all'1% in acqua deionizzata
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nmPolySciences Inc.64014-15Nanosfere standard: perle di polistirene con raggio di 125 nm; intervallo 120 - 130 nm; sospensioni di solidi all'1% in acqua deionizzata
Genesis BPS RapidSeal II o equivalenteGenesis BPS428-SE640Sigillante
tubi Fresenius Kabi Tube Stripper o equivalenteFresenius Kabi6R4452Estrattore manuale per tubi
Biohazard Shield - Cell Counter o equivalenteCardinalHealthS1389-75Splash Shield
Corning LSE Vortex Mixer o equivalenteCorning Incorporated6775Vortex mixer
FACSCanto II Citometro a flusso  con software FACSDiva versione 6.1.3 o equivalenteBD Biosciences338960Citometro a flusso
Software per

References

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