Articolo metodologico

Quantificazione di endogeno dell'auxina e citochinina durante la coltura di internodo di Ipecac

DOI:

10.3791/56902

⸱

15 marzo 2018

 ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Germogli avventizi possono essere indotta su segmenti internodale di ipecac senza trattamento di fitormoni. Per valutare la dinamica di fitormoni durante la formazione di sparo accidentale, abbiamo misurato endogeno dell'auxina e citochinina in segmenti internodale mediante LC-MS/MS.

Abstract

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Formazione di sparo accidentale è una tecnica importante per la propagazione delle colture economicamente importanti e per la rigenerazione di piante transgeniche. Trattamento di fitormoni è necessaria per l'induzione di germogli avventizi in maggior parte delle specie. Se possono essere indotta germogli avventizi è determinata dall'equilibrio tra auxine e citochinine (CK) livelli. Molto sforzo va a determinare le concentrazioni ottimale e combinazioni di fitormoni in ogni tessuto utilizzato come espianti e in ogni specie di pianta. In ipecac, tuttavia, germogli avventizi possono essere indotto sui segmenti internodale in terreno di coltura senza trattamento di fitormoni. Questo consente la plasticità intrinseca di ipecac per differenziazione delle cellule deve essere valutata. Per indurre i germogli avventizi in ipecac, abbiamo coltivato internodale segmenti a 24 ° C sotto 15 µmol m− 2 s− 1 di luce in un ciclo di buio luce/10-h 14-h il medium di B5 senza fitormoni solidificato con gomma di gellan 0,2% per 5 settimane. Per studiare dinamiche di fitormoni durante la formazione di sparo accidentale, abbiamo misurato acido di indole-3-acetic endogeno e CKs nei segmenti di liquida cromatografia-spettrometria di massa LC-MS/MS. Questo metodo permette l'analisi di acido di indole-3-acetic endogeno e livelli di CKs in modo semplice. Può essere applicato per studiare le dinamiche di auxina endogena e CK durante l'organogenesi in altre specie vegetali.

Introduzione

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Gottlieb Haberlandt (1854-1945) ha proposto il concetto di "totipotenza", da quale pianta cellule possono dividere, differenziare e rigenerare le piante intere anche dopo la loro prima differenziazione in tipi cellulari specifici in piante mature1. Nella coltura del tessuto, se pianta rigenerazione può essere indotta o non è determinata dalla combinazione e concentrazione di fitormoni esogenicamente applicate nel mezzo di crescita. Skoog e Miller trovato che germogli avventizi potrebbero essere indotto dal callo di tabacco su terreno di coltura contenente un alto rapporto di CKs di auxine, mentre radici avventizie potrebbero essere indotto su terreno contenente un rapporto basso2. Da tale constatazione, la coltura del tessuto è stato ampiamente utilizzata per la propagazione delle colture economicamente importanti e per la rigenerazione di piante transgeniche3. Germogli avventizi possono essere indotta da tessuti diversi meristema apicale di sparare, come foglie, radici e internodi. Trattamento di fitormoni è necessaria per l'induzione di germogli avventizi nella maggior parte delle specie di piante. Tuttavia, le concentrazioni ottimale e combinazioni differiscono da specie e tra tessuti utilizzati come espianti. Così, molto sforzo va a determinare le concentrazioni ottimale e le combinazioni di fitormoni per esperimenti.

Psychotria ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecac) è una pianta medicinale che contiene alcaloidi come la emetine e Cefelina, principalmente in radici4. Gli estratti della radice sono utilizzati come espettorante, emetico e un amoebicide5. Anche se ipecacuana cresce spontaneamente nelle foreste pluviali tropicali del Brasile, è riluttante a impostare semi nella cultura, e il tasso di germinazione diminuisce durante la conservazione del seme in Giappone, con il clima più freddo6. Invece, si propaga dalla coltura del tessuto, in cui avventizi spara formazione su internodi è il più efficiente metodo7,8. Interessante, i germogli avventizi possono essere indotta in questa specie senza fitormoni trattamento8.

Germogli avventizi si formano sull'epidermide della regione apicale della internodale segmenti senza forzatura, ma non nella regione basale9. Questa differenza indica la polarità di tessuto nei segmenti internodale, che è probabilmente ai sensi del regolamento phytohormonal. Il sistema di cultura ipecacuana permette un'occasione unica per analizzare i cambiamenti nei livelli endogeni fitormoni durante la formazione di sparo accidentale. Qui vi presentiamo il nostro metodo per l'analisi dei livelli endogeni di uno auxina (acido indolo-3-acetico (IAA)) e quattro CKs (isopentenyl adenina (iP), isopentenyl adenina riboside (iPR), trans-zeatina (tZ) e trans-zeatin riboside (tZR)) nei segmenti internodale attraverso l'uso di LC-MS/MS.

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Protocollo

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Nota: Ipecac (c. ipecacuanha) è stato utilizzato in questo studio perché facilita l'analisi dei fitormoni endogeni.

1. crescita condizioni per indurre i germogli avventizi di Ipecac

  1. Preparare privo di fitormoni B5 supporto regolata a pH 5.710e aggiungere 0,2% gellano. Sterilizzare in autoclave.
  2. Versare 25 mL di terreno sterilizzato nell'autoclave in una piastra Petri sterile (90 mm × 20 mm).
  3. Tagliare 8 mm segmenti internodale piantine di ipecacuana usando un bisturi chirurgico con una lama n. 22 su una lastra di acrilico sterile di e posto sul supporto (Figura 1).
  4. Cultura il medium di B5 senza fitormoni a 24 ° C sotto 15 µmol m− 2 s− 1 di luce in un ciclo di buio luce/10-h 14-h per 5 settimane.
  5. Identificare le aree ho (apicale) IV (basale) in ogni segmento (Figura 1B). Contare il numero di germogli avventizi > 0,3 mm di lunghezza in ogni regione sotto un microscopio una volta a settimana.

2. estrazione e purificazione di fitormoni

  1. Mettere una perlina di zirconia di 5 mm in ciascuna delle quattro provette 2 mL del campione.
  2. Tagliare i segmenti in regioni I a IV (ogni 2 mm di lunghezza) usando un bisturi chirurgico su una lastra di acrilico sterile.
  3. Raccogliere otto segmenti di ciascuna regione in provette separate (10-30 mg di peso fresco).
  4. Pesare e quindi bloccare i campioni in azoto liquido.
  5. Schiacciare i campioni congelati utilizzando un omogeneizzatore basati sul tallone.
  6. Sospendere i campioni schiacciati in 1 mL acetonitrile contenente 500 pg di ogni standard interno di auxina e CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) utilizzando un miscelatore vortex.
  7. Mantenere a 4 ° C per 1 h, quindi centrifugare a 3.500 × g per 5 min a temperatura ambiente.
  8. Lavare la pallina in acetonitrile 80% (v/v) contenente acido acetico 1% (v/v). Centrifugare nuovamente a 3.500 × g per 5 min a temperatura ambiente. Combinare i surnatanti (da punti 2.7 e 2.8) in un tubo di vetro monouso.
  9. Aggiungere 600 µ l acqua che contengono l'acido acetico 1% (v/v) per ogni surnatante combinato ed evaporare l'acetonitrile utilizzando un concentratore a vuoto.
  10. Equilibrare le cartucce di colonna (HLB) idrofilo-lipofilo-bilanciato applicando 1 mL ciascuno di acetonitrile, metanolo e l'acqua contenente acido acetico 1% (v/v).
  11. Applicare una soluzione di esempio per cartuccia HLB equilibrato.
  12. Lavare le cartucce con 1 mL di acqua contenente acido acetico 1% (v/v).
  13. Eluire tutti gli ormoni con 2 mL 80% (v/v) acetonitrile contenente acido acetico 1% (v/v) in un tubo di vetro.
  14. Evaporare l'acetonitrile nell'eluito per ottenere l'estratto in acqua contenente acido acetico 1% (v/v) utilizzando un concentratore a vuoto.
    Nota: Non si asciughi completamente.
  15. Equilibrare le cartucce di colonna di scambio cationico misto, forte (MCX) applicando 1 mL di metanolo, acetonitrile 1 mL, 0,5 mL 0.1 M HCl e 1 mL di acqua contenente acido acetico 1% (v/v).
  16. Applicare una soluzione di esempio per cartuccia MCX equilibrato.
  17. Lavare le cartucce con 1 mL di acqua contenente acido acetico 1% (v/v).
  18. Eluire IAA con 2 mL 30% (v/v) acetonitrile contenente acido acetico 1% (v/v) in un tubo di vetro.
  19. Lavare le cartucce con 2 mL 80% (v/v) acetonitrile contenente acido acetico 1% (v/v).
  20. Lavare le cartucce con 2 mL di acqua e 1 mL di acqua contenente ammoniaca acquosa 5%.
  21. Eluire il CKs con acetonitrile 60% (v/v) di 2 mL contenente ammoniaca acquosa al 5% in un tubo di vetro.
  22. Far evaporare il solvente di ogni frazione di ormone utilizzando un concentratore a vuoto e conservare a − 30 ° C fino all'analisi LC-MS/MS.

3. LC-MS/MS analisi di IAA e CKs

  1. Sciogliere ogni ormone Estratto in una provetta con 600 µ l di metanolo e trasferire la soluzione in un flaconcino di recupero totale del collo a vite. Far evaporare il solvente utilizzando un concentratore a vuoto.
  2. Sciogliere la frazione di IAA in 20 µ l 30% (v/v) acetonitrile e le frazioni CK in acqua di 20 µ l contenente acido acetico 1% (v/v) in vite collo recupero totale fiale.
  3. Analizzare i campioni in modalità ioni positivi su un sistema di MS triplo quadrupolo equipaggiato con un sistema HPLC.
    Nota: Impostiamo le condizioni HPLC come elencato nella tabella 1.
    1. Per l'eluizione di IAA, usare un gradiente binario di 5% - 50% solvente B in 7 minuti, quindi aumentare di 98% solvente B premuto per 1 min e poi equilibrare per 2 min a solvente B al 5% per iniezione di nido.
    2. Per l'eluizione di CK, usare un gradiente binario di 2% - 40% solvente B in 5 minuti, 40% - 70% solvente B in 7 min, poi aumentare da 95% solvente B premuto per 1 min e poi equilibrare per 2 min a 2% solvente B di iniezione del nido.
    3. Impostare l'ionizzazione electrospray (ESI)-MS parametri di sorgente di ioni come elencato nella tabella 2.
  4. Utilizzare la reazione più monitoraggio transizione (MRM) per la quantificazione di ciascun analita riportato nella tabella 3.
  5. Quantificare i livelli endogeni di IAA e CK contro una curva standard del rapporto di adenoide deuterio-etichetta standard.

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Risultati

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A 1 settimana dist , germogli avventizi non avevano formato. Alla settimana 2nd , piccoli germogli apparso. Presso i 3rd e 4 settimane dith , il numero di spara aumentato soprattutto nelle regioni apicale (I e II) (Figura 2A). Presso il 5° settimana, il numero di germogli era circa 7 in regione e 5 nella regione II (Figura 2B). Al contrario, ...

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Discussione

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Per identificare la distribuzione dei fitormoni coinvolti nell'organogenesi, è importante utilizzare materiali vegetali in cui organogenesi può essere osservato su medium senza fitormoni, poiché quando fitormoni esogenicamente vengono applicati agli espianti per l'induzione germogli o radici, colpiscono l'espianto intero, rendendo difficile valutare la plasticità intrinseca delle piante nella differenziazione cellulare e l'organogenesi. Germogli avventizi possono essere indotta su terreni di coltura privo di fitormoni in...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Siamo grati al signor Akira Murakami del dipartimento di scienze biologiche applicate, Università Toyo e signor Koudai Taniguchi del Gunma Agricultural Technology Center per la loro assistenza tecnica. Siamo anche grati al Professor Shosaku Kashiwada e Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo University per i loro suggerimenti. Questo studio è stato sostenuto in parte dal centro di ricerca per la vita e scienze ambientali, Università Toyo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
[2H5]acido indolo-3-aceticoOlchemlm Ltd031 1531Standard interno per LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatinOlchemlm Ltd030 0301Standard interno per LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin ribosideOlchemlm Ltd030 0311Standard interno per LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenil adeninaOlchemlm Ltd030 0161Standard interno per LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenil adenosinaOlchemlm Ltd030 0171Standard interno per LC-MS/MS
acido indolo-3-aceticoWako098 00181standard per LC-MS/
MS trans-zeatinaSIGMA-ALDRICHZ0876 5MGstandard per LC-MS/MS
trans-zeatina ribosideWako262 01081standard per LC-MS/MS
N6-isopentenil adeninaSIGMA-ALDRICHD7674 1Gstandard per LC-MS/MS
N6-isopentenil adenosinaACROS ORGANICS22648 1000standard per LC-MS/MS
acetonitrile ipergrado per LC-MS LiChrosolvMERCK1.00029.1000solvente per LC-MS/MS
Acqua per cromatografia LiChrosolvMERCK1.15333.1000solvente per LC-MS/MS
HPLCSHIMADZUProminence
MSSciex3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 ccColonna cartuccia WatersWAT094225
Colonna Oasis MCX 30 mg/1 ccColonnacartuccia Waters 186000252
collo a vite a recupero totale fiala Waters186002805
blu, tappo collo a vite 12 x 32 mm e setto in PTFE/siliconeWaters
Acquity UPLC BEH C18, 2,1x100 mmWaters186002350colonna UPLC
Proshell 120 EC-C18, 2,1x50 mmAgilent699775-902colonna UPLC
Microscopio digitaleLeicaDHS1000
TissueLyser IIQIAGEN85300
Lama chirurgicaFeatherNo. 22
Manico del bisturiFeatherNo. 4
Savant SpeedVac/Trappola per vapore refregeratedThermo Fisher ScientificSPD111/RVT4104concentratore sottovuoto
Tobe in vetro monouso (13x100 mm)IWAKI9832-1310
Capsula di Petri sterileINA OPTICAI-90-20
186000274

Riferimenti

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  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
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  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
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