Articolo metodologico

Privo di detersivo ultraveloce ricostituzione delle proteine di membrana in lipidici utilizzando fusogena proteoliposomi complementari a carico.

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DOI:

10.3791/56909

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5 aprile 2018

 ,  ,  ,  , 
1First Pavlov State Medical University, 2Clarendon Laboratory, Department of Physics, Oxford University, 3Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo due protocolli ultraveloce per la ricostituzione delle proteine di membrana in fusogena proteoliposomi e la fusione di tali proteoliposomi con lipidici di destinazione per la consegna senza detersivo di queste proteine di membrana nel bilayer del postfusion. La combinazione di questi approcci consente montaggio veloce e facile da controllare di sistemi complessi multi-componente della membrana.

Abstract

Detergenti sono indispensabili per la consegna delle proteine di membrana in vescicole unilamellari piccole di 30-100 nm, mentre lipidici di modello più complesso, più grandi sono meno compatibili con detergenti.

Qui descriviamo una strategia per bypassare questa limitazione fondamentale utilizzando fusogena caricata opposta liposomi recanti una proteina di membrana di interesse. Fusione tra tali vescicole si verifica entro 5 min in un buffer di bassa forza ionica. Liposomi caricati positivamente fusogena utilizzabile come vettori di semplice navetta per detergente-libero consegna delle proteine di membrana nelle lipidici di biomimetic destinazione, che sono caricati negativamente. Mostriamo anche come ricostituire le proteine di membrana in fusogena proteoliposomi con un protocollo veloce 30-min.

Combinando questi due approcci, dimostriamo a montaggio rapido di una catena di trasporto degli elettroni che consiste di due proteine di membrana da e. coli, un protone primario pompa bo3-ossidasi e F1Fo ATP sintasi, nelle membrane dei vescicole di varie dimensioni, che vanno da 0,1 a > 10 micron, come pure la produzione di ATP da questa catena.

Introduzione

Funzionalizzazione di lipidici artificiali con proteine di membrana è un passo fondamentale nel montaggio di sistemi modello di membrana. Il modello più semplice, proteoliposomi (PL), costituito da piccole (30-200 nm di diametro) vescicole unilamellari (SUV, anche chiamati liposomi), con proteine integrate nelle loro membrane. PL tradizionalmente sono formate in due passi1. Primo, preformato SUV sono mescolati con una proteina di membrana di interesse e un detergente ad una concentrazione sopra la sua concentrazione micellare critica (CMC). In secondo luogo, il detergente viene rimosso con varie tecniche di dialisi, "bio-perline" o gel filtrazione, lasciando la proteina nella membrana. Quest'ultimo approccio è molto più veloce (~ 30 min1) e pertanto è preferibile per la ricostituzione delle proteine di membrana fragile e sensibile, mentre i primi due approcci sono limitati dalla velocità di rimozione del detersivo, che richiede molte ore e può causare un sostanza perdita di attività e perdita di integrità strutturale delle proteine. Funzionalizzazione di più grandi vescicole (unilamellari grandi vescicole, LUV, fino a 1 micron di diametro) di questo approccio è più impegnativo, come vescicola dimensione si riduce dopo la rimozione del detersivo e non è possibile per le vescicole unilamellari gigante (GUV, > 1 µm), così come sono destabilizzato dai detergenti (ma Vedi Johnson et al. 2 per lenta 2D-cristallizzazione di proteine di membrana in grandi strati lipidici). Approcci alternativi per GUV membrana funzionalizzazione3,4,5 esistono ma sono laboriosa, che richiede tempo e richiedono ancora qualche detersivo a concentrazioni inferiori CMC. Più complesse o fragile del lipido modelli (ad esempio, gocciolina idrogel bilayer6 e tessuti artificiali basati su goccia interfaccia Bilayer stampabile 3D7) non possono tollerare detergenti. Rapidamente emergendo biologia sintetica applicazioni8,9,10 criticamente dipendono dalla funzionalizzazione di tali strutture di membrana complessa. Di conseguenza, un metodo facile e robusto che permette la consegna veloce e delicata delle proteine di membrana nel bilayer fragile di destinazione è molto richiesto nel campo.

Un'alternativa, metodo di consegna senza detersivo proteina è fusione della vescicola, dove le membrane interagenti vescicole uniscono in doppio strato postfusion intatto, mentre loro contenuto acquoso intravesicular si mischiano, senza essere rilasciata all'esterno ambiente. È attivata la fusione della vescicola e pilotato da riarrangiamenti conformazionali all'interno gli agenti complementari fusogena (alcune proteine11,12 e peptidi13 o appositamente modificato DNA14) situati nel contatto con bilayer, o interazioni coulombiane tra lipidici formate di complementarità carica lipidi cationici e anionici15,16, o doppii strati cationici e proteine caricate negativamente17.

Il primo approccio richiede la presenza di agenti fusogena nelle membrane interagenti prima della fusione, è relativamente lento (~ 30 min per raggiungere mezzo massimo di fusione12,18), ma può essere applicato a sia naturali che artificiali membrane.

Un vantaggio dell'approccio utilizzando fusogena lipidi (Figura 1) è che esso consente molto più veloce fusione della membrana (~ 1 min per raggiungere mezzo massimo e 5-10 min per finire la reazione). Inoltre, nella misura di fusione può essere controllata da i) un facile formulare contenuto relativo dei lipidi caricati in fusogena strati lipidici e ii) ionico e, in generale, osmotico resistenza del mezzo di reazione (sali a sopra 50 mM e, per esempio, saccarosio15 vengono mostrati per interrompere fusione), o una combinazione di entrambi. Per avviare la fusione, carica opposta fusogena vescicole sono mescolate in un mezzo di forza ionica bassa (in genere sale di 10-20 mM) per 5-10 min. Uno svantaggio relativo del metodo è che i lipidi cationici possono esercitare un effetto negativo sulla funzionalità delle proteine di membrana nei proteoliposomi cationici prima della fusione, soprattutto a bassa forza ionica, ma questo effetto è reversibile e mitigato da un naturale composizione lipidica della membrana post-fusione e relativo ritorno al medium normale forza ionica.

Protocollo

1. preparazione del fusogena LUV e SUV

  1. Preparazione della miscela del lipido fusogena
    1. Preparare soluzioni di riserva di lipidi neutri, cationici, anionici e fluorescenti in cloroformio a 25-50 mg/mL (ad esempio, neutro DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), cationici etilico-PC (1,2- dimyristoleoyl-sn-glicero-3-ethylphosphocholine), POPA anionico (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate) e fluorescente del colesterile-Bodipy-FL12, rispettivamente) pesando adeguate quantità di lipidi asciutti e loro dissoluzione in 100% cloroformio (attenzione! Farlo sotto cappa aspirante), o diluendo gli stock di cloroformio commercialmente disponibili dei lipidi con cloroformio.
      Nota: Sia lipidiche naturali estratti e lipidi sintetici puri possono essere utilizzati e dimostrano risultati simili.
    2. Una cationica di mix 2.5 mg e 2,5 mg di un lipide neutro in magazzino di cloroformio (1.1.1) in un flaconcino di vetro.
      Nota: Questo passaggio produce 5 mg di miscela di lipidi cationici in cloroformio, contenente la frazione di peso del 50% di lipidi cationici. Quando necessario, è possibile aggiungere 0,5% frazione di peso di un lipide fluorescente per la miscela.
    3. Mescolare 1 mg di anionici e 4 mg di lipidi neutri (1.1.1) delle scorte di cloroformio in un flaconcino di vetro. Questo dà 5 mg di miscela di tensioattivi anionici del lipido contenente 20% peso frazione dei lipidi anionici.
    4. Evaporare il cloroformio sotto un flusso di azoto per formare un sottile strato di lipidi asciutto.
    5. Rimuovere il cloroformio residuo sotto vuoto per 10 min.
      Nota: Tradizionalmente questo passaggio richiede molto più tempo (1-12 h), ma abbiamo trovato che un trattamento più lungo non fornisce nessun miglioramento evidente in proprietà di SUV di accoppiamento.
    6. Idratare il film lipidico asciutto aggiungendo 0,5 mL di tampone A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, MOPS di 50 mM, pH 7.4) per ogni flaconcino e lasciandoli riposare a temperatura ambiente per 30 minuti e poi vortice fino il film lipidico è completamente staccato dalla superficie del vetro e b riconoscibilissimo una sospensione omogenea del lipido. Questo dovrebbe prendere circa 20-40 s.
  2. Formazione di SUV e LUV di estrusione
    1. Assemblare un sistema di estrusione (Vedi la Tabella materiali) con due siringhe da 1 mL, utilizzando un filtro in policarbonato con uno dei seguenti formati del poro: 100 o 200 nm a forma SUV e 400 o 800 nm per formare LUV.
    2. Trasferire la sospensione del lipido in una siringa.
    3. Estrudere la sospensione facendolo passare attraverso il filtro 21 volte, come illustrato altrove18,19.
      Nota: Un numero dispari di passaggi è necessario per ridurre al minimo il trasferimento nella soluzione delle vescicole di lipidi grandi ciuffi attaccato al lato filtro rivolto verso la sospensione del lipido originale.
    4. Trasferire la soluzione di vescicola in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.

2. formazione di fusogena GUV dal metodo emulsione invertito

Nota: Questa procedura è illustrata nella Figura 2.

  1. Preparazione della soluzione lipidica-in-olio
    1. Mescolare un brodo di cloroformio (Vedi punto 1.1.1) di un lipide neutro (2 mg) e un lipido anionico (0,5 mg) con 1 mL di esadecano in provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Evaporare il cloroformio dalla miscela sotto costante miscelazione e riscaldamento a 80 ° C per 30 min mantenendo aperto il tubo. Tappare la provetta e lasciate raffreddare a temperatura ambiente.
  2. Formazione di un monostrato lipidico all'interfaccia del lipido-in-olio/tampone acquoso
    1. Posto 200 µ l della soluzione lipidica in olio sulla cima di 0,5 mL di tampone B (20 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, MOPS 10 mM a pH 7.4) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Si noti la forma convessa del confine di separazione di fase a causa di mancata corrispondenza di tensione superficiale tra l'olio e il tampone acquoso (Figura 2A).
    2. Attendere fino a quando il bordo di separazione di fase si appiattisce, che è indicativo di formazione dello strato monomolecolare del lipido su di esso. Questo richiede in genere 30-60 min a temperatura ambiente.
  3. Preparazione di un'emulsione acqua in olio
    1. Preparare una soluzione di un polisaccaride solubile in acqua e non ionici nel buffer B, con una densità maggiore di densità dell'acqua (ad es. 15% Ficoll-400 (w/v), con densità 1,05 g/mL)
      Nota: Facoltativamente, si possono aggiungere coloranti fluorescenti solubili in acqua per il buffer per una migliore visualizzazione di GUV e qualsiasi altro contenuto acquoso desiderato del Guv.
    2. Trasferire 0,5 µ l di miscela di cui sopra a una separata 1,5 mL centrifuga con 100 µ l della soluzione lipidica in olio da 2.1.2.
    3. Sottoporre ad ultrasuoni (44kHz alle 14 W) la miscela per 30 s in un bagno d'acqua ad ultrasuoni. Quindi, vigorosamente vortice per 45 min a formare un'emulsione acqua in olio, dove ogni goccia sarà rivestita da un monostrato lipidico (Figura 2B).
  4. Conversione dell'emulsione acqua in olio in GUV
    1. Posizionare l'emulsione risultante in cima l'interfaccia del lipido-in-olio/acquoso e centrifugare immediatamente la provetta in una centrifuga di tavolo a 10.000 x g per 2 min. Il pellet risultante di GUV dovrebbe essere chiaramente visibile (Figura 2).
    2. Raffreddare il tubo a 4 ° C in frigorifero a solidificare la miscela di lipidi in olio (Figura 2D, esadecano solidifica sotto i 18 ° C), rimuovere con cura l'olio congelato e poi ritirare la fase acquosa.
      Nota: Per facilitare l'olio è stato usato rimozione congelare un filo piegato a forma di un ancoraggio.
    3. Risospendere il pellet GUV in 50 µ l di tampone fresco B, trasferimento in una nuova provetta ed esaminare sotto un microscopio di fluorescenza usando un obiettivo a immersione in olio (Figura 2E) X 100.

3. monitoraggio fusione della vescicola con cobalto-calceina metodo

  1. Preparazione di una colonna di gravità di gel-filtrazione.
    1. Ammollo ~ 10 g di una resina di gel-filtrazione (ad es. superfine sephadex G-50) in 100 mL di acqua deionizzata e lasciare che si gonfiano durante la notte.
    2. Confezione da 3 mL della resina in una colonna di flusso di gravità di plastica usa e getta, lavarlo con acqua ultrapura ed equilibrare con buffer C (100 mM KCl, MOPS di 10 mM, pH 7,4) a temperatura ambiente.
  2. Preparazione di SUV+ o SUV0 caricato con cobalto-calceina.
    1. Preparare una soluzione contenente calceina 1 mM, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM MOPS, quindi portare il pH a 7.4.
      Nota: L'essenza del metodo è che quella gratuita calceina fluorescente forma un complesso non fluorescenti con Co2 +. Diventa fluorescente nuovamente con l'aggiunta di EDTA, che avendo maggiore affinità per Co2 +, sposta calceina dal complesso cobalto-calceina (Figura 3A).
    2. Aggiungere 500 µ l di questa soluzione per un film secco di lipidi cationici o neutri preparato come descritto in 1.1.
    3. Preparare 100 nm SUV di estrusione come descritto in 1.2.
    4. A pellet estruso SUV a 1.000.000 x g per 20 min in un tavolo ultracentrifuga e risospendere in 1 mL di tampone C. Ripetere cubettatura e risospensione tre volte; utilizzare 0,6 mL di tampone C per la risospensione di ultimo.
      Nota: Questa procedura rimuovere la maggior parte della calceina-cobalto esterno.
    5. Rimuovere i resto esterno cobalto-calceina passando SUV attraverso una colonna di gravitá monouso caricata con la resina di gel-filtrazione equilibrata con buffer C come descritto al punto 3.1.2.
      Nota: In genere scartare il primo volume di millilitro del flusso continuo e raccogliere la seconda millilitro, che contiene cobalto-calceina esterno gratuito SUV.
  3. Preparazione di SUV– caricato con EDTA
    1. Preparare la soluzione di 10 mM EDTA, 80 mM NaCl, MOPS di 10 mM, pH 7.4.
    2. Aggiungere 500 µ l di questa soluzione per un film secco di lipidi anionici preparata come descritto in 1.1.
    3. Preparare SUV– di estrusione come descritto in 1.2.
    4. Pellet e risospendere SUV– , come descritto in 3.2.4.
    5. Rimuovere l'EDTA rimanente passando SUV– attraverso la colonna di gel-filtrazione, come descritto in 3.2.5.
  4. Preparazione di SUV per fusione
    1. Diluire il SUV0,+di SUV e SUV– con tampone D (MOPS di 1 mM, pH 7.4) completati con 0,2 mM CoCl2 e la concentrazione di KCl. uso 5 µ l di ciascun tipo di SUV per 1 mL di tampone D.
    2. Incubare la miscela per almeno 1 h.
      Nota: Questo passaggio riduce al minimo il livello di fluorescenza di fondo bloccando calceina che è associata a superficie ai SUV+.
  5. Fusione della vescicola
    1. Avviare la reazione di fusione mescolando 1 mL di SUV+ o SUV0 con 1 mL di SUV− (diluito in tampone D come descritto sopra) in una provetta 2 mL fluorimetro e monitor aumento di fluorescenza di calceina utilizzando 480 nm eccitazione e 510 nm emissione (Figura 3B).
    2. Attendere fino a quando la reazione viene a compimento.
    3. Aggiungere una miscela di detergente Triton X-100 ed EDTA (concentrazione finale di 0.05% e 7 mM, rispettivamente) per rilasciare calceina fuori vescicole e ottenere il segnale di fluorescenza massima.
    4. Determinare la portata della fusione definito come la percentuale del segnale massimo fluorescenza dopo l'aggiunta di detersivo come mostrato in Figura 3.

4. veloce ricostituzione delle proteine di membrana nei proteoliposomi fusogena

Nota: Questa procedura è illustrata in Figura 4A.

  1. Preparare una colonna di flusso di gravità con la resina di gel-filtrazione, come descritto in 3.1 ed esso equilibrare con tampone A temperatura ambiente.
    Nota: Tutte le manipolazioni ulteriore devono essere fatto rigorosamente a ≤ 4 ° C, a meno che non diversamente indicato, per minimizzare la perdita di attività della proteina.
  2. Regolare la concentrazione della proteina purificata membrana a 0,7 mg/mL diluendo con il tampone di estrazione stesso utilizzato per l'isolamento di proteine.
  3. µ L di mix 140 della proteina con 300 µ l di SUV preformato, 160 µ l tampone A e 60 µ l di 10% colato in Buffer A; Questo dà 01:30 proteine: rapporto peso del lipido in un volume finale di 660 µ l.
  4. Agitare delicatamente il composto su una piattaforma a dondolo per 15 min.
    Nota: La seguente procedura può essere eseguita a temperatura ambiente.
  5. Passare il composto attraverso resina di gel-filtrazione e raccogliere torbide frazioni contenenti proteoliposomi.
  6. A pellet proteoliposomi con un tavolo ultracentrifuga a 400.000 x g per 15 min.
  7. Eliminare il supernatante contenente proteine non ricostituito e risospendere il pellet in 1 mL di tampone fresco A.
  8. Determinare il contenuto di proteina in PL e il supernatante utilizzando il metodo di Amido-Nero20.
  9. Determinare il rendimento di ricostituzione, che in genere è di circa 50-70%.
    Nota: Passaggi 4.6-4.8 facoltativamente possono essere sostituiti mediante il passaggio di soluzione PL attraverso 1 mL di resina Ni-NTA imballato in una colonna di gravità monouso e lavato con tampone A come descritto in 3.1.2. Tale passaggio si separerà non ricostituito proteina, che sarà preferenzialmente associata alla resina, da PL, più sarà nel flusso continuo.

5. test funzionali dell'attività della proteina nei proteoliposomi

Nota: Entrambe le proteine utilizzate in questo studio sono pompe del protone potente, che pompa H+ in proteoliposomi con l'aggiunta di loro substrati (coenzima Q1 per bo3-ossidasi e ATP per F1Fo, rispettivamente), così edificio una pendenza del protone attraverso la membrana (ΔpH). In caso di successo co-ricostituzione di fusione, tale acidificazione può essere osservato come una diminuzione in fluorescenza di una sonda di pH sensibili ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, che è usato ordinariamente per tali attività ( Figura 4B -C). Inoltre substrato-specifica attività delle proteine (coenzima Q1 ossidazione di bo3-ossidasi22 e idrolisi dell'ATP da F1Fo23,24) può essere monitorata spettrofotometricamente usando vari metodi. Qui, noi dimostrare attività di idrolisi di ATP di F1Fo PL utilizzando un ATP rigenerante test (Figura 4), dove due enzimi (piruvato chinasi (PK) e lattato deidrogenasi (LDH) mantenere una costante concentrazione di ATP come segue. PK ricicla ATP convertendo ADP prodotto da F1Fo indietro nell'ATP a scapito del suo substrato fosfoenolpiruvato (PEP). Piruvato, che è un prodotto di questa reazione, viene convertito in lattato di LDH a scapito di NADH, l'ossidazione di cui può essere monitorato come diminuire la densità ottica a 340 nm.

  1. Preparazione di prodotti chimici
    1. Preparare 1 mM brodo di ACMA in etanolo.
    2. Preparare uno stock di 1 mM di Nigericina (o qualsiasi altro disaccoppiatore) in etanolo.
    3. Preparare stock di 25 mM coenzima Q1 in etanolo e 1 M tra gli stock DTT nel buffer A.
    4. Preparare un brodo di 100mm ATP in tampone A e regolare il pH a 7.4.
    5. Preparare scorte di ATP rigenerando i componenti del sistema a tampone a: 100 mM PEP, 1mm NADH e soluzioni di PK e LDH a concentrazione di ~ 500-1.000 unità/mL.
  2. Coenzima Q1 ossidazione-driven protone pompaggio dal bo3-ossidasi PL
    1. Aggiungere 20 µ l di PL per una cuvetta fluorimetro con tampone 2 mL A in presenza di 0,5 µM ACMA e attendere il segnale stabile utilizzando 430 nm eccitazione e 515 nm emissione.
    2. Aggiungere 40 µM coenzima Q1 la cuvetta.
    3. Avviare protone pompaggio aggiungendo 2 mM DTT al PL (Figura 4B).
      Nota: DTT riduce ossidata di coenzima Q1 e lo rende disponibile a bo3-ossidasi.
    4. Dissipare ΔpH formate aggiungendo disaccoppiatore di 2 µM (ad esempio Nigericina). Segnale di fluorescenza di ACMA dovrebbe tornare rapidamente a quasi il livello originale.
      Nota: non ci dovrebbe essere nessun ACMA tempra con l'aggiunta del substrato, se il corredo è inizialmente presente nella miscela di reazione.
  3. Protone basati su idrolisi di ATP di pompaggio di F1FoPL
    1. Aggiungere 40 µ l di PL in una cuvetta fluorimetro come descritto al punto 5.2.
    2. Avviare protone pompaggio aggiungendo 0,2 mM ATP al PL (Figura 4).
    3. Dissipare il ΔpH come descritto in 5.2.4.
  4. Idrolisi dell'ATP da F1FoPL e la sua stimolazione dal disaccoppiatore
    1. Aggiungere 40 µ l di PL in una cuvetta spettrofotometro con 2 mL tampone A, contenente ATP di 1 mM, 0,2 mM NADH, 2mm PEP e 15 µ l di PK e LDH.
    2. Seguire la reazione misurando la diminuzione di assorbanza del NADH a 340 nm. 3-4 min aggiungere successivamente, disaccoppiatore µM 2 la cuvetta per rilasciare la contropressione del ΔpH su idrolisi dell'ATP. La velocità di reazione dovrebbe aumentare immediatamente.
      Nota: PL attraversato resina Ni-NTA come descritto nella 4.10 dimostrerà la stimolazione più forte del disaccoppiatore (traccia diFigura 4, rosso), mentre l'eluato sarà a malapena stimolata (traccia blu).

6. test influenza dell'ambiente del lipido e della forza ionica sulla funzionalità delle proteine di membrana nei proteoliposomi fusogena

  1. Valutare il protone pompaggio da 40 µ l di PL+, PL– e PL0 con il saggio dissetante ACMA in 2 mL Tampone D completati con 1 mM MgCl2 e 20 (Figura 5, pannello A) o 100 mM KCl (pannello B) come descritto in 5.2 o 5.3 (Figura 5 tracce di rosse, nere e blue).
  2. Fusibile 40 µ l di PL+ con lo stesso volume di LUV– in 2 mL di tampone D completati con 20 mM KCl e prova per tempra (traccia verde) ACMA.
  3. Eseguire esperimenti di controllo come in passaggio 2 di miscelazione, ad esempio, PL e SUV della stessa carica (grigio traccia).
    Nota: Protone pompaggio dovrebbe essere migliorato mediante postfusion pl

7. consegna delle proteine di membrana in LUV e GUV da fusogena proteoliposomi

  1. Fusibile 50 µ l di PL+ con 50 µ l di 800 nm LUV– in 1 mL di tampone D completati con 1 mM MgCl2e 20 mM KCl per 5 min.
  2. A pellet le vescicole a 6.000 x g per 5 min e scartare il supernatante contenente non reagito PL+. Risospendere il pellet in 1 mL di tampone D completati con 1 mM MgCl2 e 100 mM KCl e ripetere la cubettatura e risospendere due volte più.
  3. Eseguire ACMA tempra dosaggio come descritto in 5.2 o 5.4.
  4. Eseguire esperimenti di controllo, come nei passaggi 1-3, utilizzando combinazioni di vescicole complementari caricate in alto sale (200 mM KCl), non-fusogena vescicole e solo vuote LUV– senza PL+.
    Nota: Protone di pompaggio di postfusion LUV deve essere rilevato solo quando modo complementare caricate vescicole sono state utilizzate come mostrato nella Figura 6.

8. montaggio della catena di trasporto degli elettroni da singoli componenti in membrane di LUV GUV e produzione di ATP da questa catena.

Nota: Lo schema di questa procedura è illustrato nella figura 7A. ATP prodotto in questo esperimento verrà registrato dal sistema luciferina-luciferasi, dove la conversione di ATP sintetizzato in AMP e pirofosfato di luciferasi è seguito da emissione di luce registrata con un luminometro. È consigliabile utilizzare un luminometro tubo singolo, anziché il meno sensibile luminometri micropiastra.

  1. Mix 3 µ l di bo3-ossidasi PL+ e 5 µ l di F1Fo PL+ formata come descritto nella sezione 4.
  2. Li con 3 µ l di LUV o GUV– (formata come descritto nella sezione 2) fusibile in 800 µ l di tampone D completati con 20 mM KCl e 1 mM MgCl2 per 5 min.
  3. Utilizzano supporti di alta concentrazione, aggiungere KCl e MOPS alla concentrazione finale di 100 mM e 50 mM per le membrane postfusion.
    Nota: In caso di post-fusione LUV, questo passaggio impedirà loro gonfiore a causa di offset osmotico tra esterno (tampone A) e concentrazione di sali di intravesicular (buffer D).
    1. Facoltativamente, le membrane postfusion il pellet come descritto al punto 7.2 per separare non reagito SUV+e risospendere il pellet in 800 µ l di tampone A.
  4. Preparare 200 µ l di un luciferina-luciferasi-ADP cocktail contenenti 400 µM ADP, luciferina di 50 µM e 2,5 µ g luciferasi in tampone A
  5. Aggiungere il cocktail per la miscela di postfusion da Step8.3.
  6. Aggiungere 40 µM di ossidato coenzima Q1e innescare energizzazione delle membrane postfusion da bo3-ossidasi aggiungendo 2 mM DTT. Attendere per 1 min.
  7. Avviare la sintesi di ATP con l'aggiunta di fosfato di potassio 5 mM (KPho, pH 7.4) alle vescicole eccitate e rilevare la produzione di ATP con un luminometro (figura 7B). Eseguire la reazione per ~ 3 min.
    Nota: La reazione di sintesi di ATP procede per 5-7 minuti fino ad esaurimento dell'ossigeno consumato dal bo3-ossidasi e luciferasi.
  8. Aggiungere due volte la miscela di reazione standard di riferimento di ATP (0,5 nmol ATP). Misura ATP prodotta.
  9. Ottenere la quantità effettiva di ATP prodotto nella reazione dividendo il segnale dalla reazione di sintesi di ATP ATP segnale di riferimento standard. Modificare questo valore per la quantità totale di F1Fo utilizzati nella reazione e infine esprimere il tasso di sintesi di ATP in µmol ATP / (mg F1Fo* min).

Risultati

L'uso di fusogena complementari-addebitato proteoliposomi per consegna veloce senza detersivo delle proteine di membrana nelle membrane di doppio strato di destinazione include tre fasi (Figura 1): A, formazione di fusogena SUV da miscele di lipidi con alta contenuto di lipidi caricati; questi SUV facoltativamente possono trasportare un carico di intravesicular; B, conversione di fusogena SUV in PL utilizzando nostro ricostituzione di proteine di membrana veloce; C, fusione di fusogena PL con strati lipidici di destinazione in un mezzo a basso contenuto di sale, seguita dalla aggiunta di sale alta per interrompere la reazione di fusione. In caso di grandi vescicole (D), una strategia preferibile è quello di fornire proteine di membrana nel bilayer del bersaglio anionici, che fornisce un ambiente lipidico migliore per l'attività delle proteine di membrana (ulteriormente discusso nel testo).

Il protocollo di formazione GUV con metodo invertito emulsione viene evidenziato in dettaglio nella Figura 2. Preferiamo usare esadecano nella miscela del lipido-olio a causa della sua relativamente elevata (18 ° C) temperatura di congelamento, che permette una facile rimozione di olio solidificato dopo GUV cubettatura.

Nella figura 3 viene illustrato fusione della vescicola con metodo di cobalto-calceina-EDTA. Fusione è visto solo quando le vescicole cariche complementari vengono utilizzate nei buffer sale basso, mentre le più alte concentrazioni di sale (> 50 mM14) o l'uso di non-fusogena vescicole non dimostrare alcuna fusione.

Questo protocollo veloce di ricostituzione delle proteine di membrana in fusogena SUV è illustrato in Figura 4A. Usando questo protocollo, dimostriamo velocemente la ricostituzione del protone primario pompa bo3-ossidasi e F1Fo ATP sintasi in PL e valutazione della loro attività specifiche in queste membrane. È importante ricordare che il rendimento di ricostituzione di proteina non dipende il costo di un lipido utilizzato15 ed è di circa 50-75%25,12, e che dopo la ricostituzione in PL, la proteina può essere conservata per almeno tre giorni, anche a temperatura ambiente senza evidente perdita di attività della proteina. Questa procedura fornisce inoltre orientamento unidirezionale del trifosfato di adenosina synthase, dove oltre il 95% di esso ha la sua frazione idrofila F1 orientato verso l'esterno15,26.

Figura 5 dimostra che il protone pompaggio attività di F1Fo (pannello A) e bo3-ossidasi (pannello B) in lipidi cationici è ridotta e sensibile a bassa forza ionica, rispetto al ambiente lipidico anionici e neutro, ma Questo effetto è attenuato in membrane postfusion dopo la fusione PL+ con anionici LUV–.

Figura 6 dimostra la consegna di F1Fo trifosfato di adenosina synthase nelle membrane delle vescicole di grandi dimensioni. In questo esperimento, PL+ e 800 nm LUV– sono stati fusi in 20 mM KCl per 5 min e il prodotto di reazione è stato pellettato per rimuovere unfused PL+, risospese e analizzati per il pompaggio di protoni. Esperimenti di controllo hanno mostrato nessun protone pompaggio quando LUV0 invece di LUV– sono stati utilizzati nella reazione di fusione (traccia nera), o vuoto LUV– da solo sono stato dosato (traccia blu).

Montaggio rapido di una catena di trasporto dell'elettrone funzionante nelle membrane delle vescicole grandi mediante fusogena PL è illustrato nella Figura 7. Abbiamo usato F1Fo SUV+ e bo3 SUV+ per fusione con 800 nm LUV-e ha dimostrato la produzione di ATP da questa catena nelle vescicole postfusion aggiungendo sequenzialmente coenzima Q1 e DTT per eccitare membrane e quindi l'aggiunta di fosfato per innescare la sintesi di ATP da F1Fo.

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Figura 1: concezione di consegna ultraveloce senza detersivo delle proteine di membrana in lipidici di destinazione tramite fusione delle vescicole unilamellari formato dei lipidi caricati complementari. (A) formazione di vescicole unilamellari piccole fusogena cationici e anionici (+SUV, SUV–) facoltativamente caricato con carichi intravesicular. (B) conversione di fusogena SUV in fusogena proteoliposomi (PL) mediante ricostituzione delle proteine di membrana. (C) senza detersivo consegna delle proteine di membrana nelle membrane postfusion con strategia preferibile di fusogena PL. (D) per la consegna delle proteine di membrana nelle membrane delle vescicole grandi, illustrate dalla fusione tra 100 nm PL+ e 800 nm LUV–. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: GUV protocollo di formazione con un metodo di emulsione invertito. (A) formazione di un monostrato lipidico sul confine tra la miscela olio-lipidi e l'acqua. (B) la formazione di un'emulsione (acqua in olio) invertita. (C) GUV formazione passando l'emulsione attraverso il confine di olio-acqua mediante centrifugazione. (D) raffreddamento del tubo sotto < 18 ° C per solidificare e rimuovere l'olio. (E), A immagine di microscopia fluorescente di un GUV contenente lipidi fluorescenti (1% peso frazione del colesterile-Bodipy-FL12) nella sua membrana (verde) e un fluoroforo polar (1 mM solforodamina 101) nel lume di vescicola (rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: fusione di vescicole lipidiche studiato con il metodo di cobalto-calceina-EDTA. (A) schema del metodo, dove calceina gratis viene rilasciato da un complesso di cobalto non fluorescente-calceina con EDTA. (B) fusione di SUV in varie concentrazioni di KCl. (C) rilascio della calceina intravesicular mediante aggiunta di EDTA e Triton X-100 detergente alle vescicole postfusion mostrato in B come descritto nel testo. Nella misura di fusione (%) per traccia rossa è calcolata dividendo il segnale di massima fusione sfondo-rettificato (1 - 2) dal segnale massimo sfondo-corretti dopo il rilascio di calceina incapsulato (3-2) e moltiplicando per 100. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Ricostituzione ultraveloce di bo3-ossidasi e F1Fo in fusogena proteoliposomi e misure dell'attività della proteina in tali proteoliposomi. (A) schema del protocollo la ricostituzione. (B), coenzima Q1 ossidazione guidato protone pompaggio dal bo3-ossidasi in PL misurata con ACMA tempra (spiegato nel testo). (C) ATP idrolisi-driven protone pompaggio di F1Fo in PL misurata con ACMA tempra (spiegato nel testo). (D) ATP idrolisi di F1Fo in PL misurata con sistema ATP-rigenerante (spiegato nel testo) e la sua stimolazione dal disaccoppiatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: influenza dell'ambiente del lipido e della forza ionica sull'attività delle proteine di membrana. Protone pompaggio di F1Fo (A) e bo3-ossidasi (B) in PL cationici (traccia rossa), PL anionici (traccia blu), neutro PL (traccia nera) e cationici PL fuso con LUV anionici (linea verde) in 20 e 100 mM KCl. controllo traccia ( grigio) non mostra alcun cambiamento nel protone pompaggio di F1Fo PL– con la miscelazione con SUV–. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Consegna di F1Fo ATP sintasi nelle membrane di 800 nm LUV– via fusione con PL+. (A) schema dell'esperimento: PL+ e 800 nm LUV– sono stati fusi in 1 mM MOPS (pH 7.4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl per 5 min, pellettati per rimuovere 6P PL e risospesi nello stesso buffer. (B) Proton pompaggio dalla postfusion LUV (traccia rossa). Esperimenti di controllo hanno mostrato nessun ACMA tempra quando PL0 sono stati mescolati con LUV– (traccia nera), o vuoto LUV– da solo sono stato dosato (traccia blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: 5-min detergente-montaggio gratuito di una catena di trasporto degli elettroni nelle membrane di 800 nm LUV– via fusione con PL+. (A) schema dell'esperimento: 100 nm F1Fo PL+ e 100 nm bo3-ossidasi PL+ si fusero con LUV-, come descritto nella Figura 6. Fusione è stata interrotta con l'aggiunta di KCl e MOPS per 100 e 50 mM, rispettivamente. Le membrane sono state mescolate con ADP-luciferina-luciferasi cocktail e stimolate dall'aggiunta di DTT e Q1, come descritto nel testo. Produzione di ATP è stata avviata tramite l'aggiunta di fosfato di 1 mM (Pio) e monitorati in tempo reale con sistema luciferina-luciferasi come descritto nel testo. (B) ATP sintesi dalle vescicole postfusion (linea rossa). Esperimenti di controllo hanno mostrati nessuna produzione di ATP quando PL+ sono stati mescolati con LUV– in alto sale (grigio), o PL0 sono stati mescolati con LUV– (nero). Tasso di sintesi di ATP è stato calcolato come indicato nel testo (passaggi 8,8-8,9). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Di seguito alcuni problemi devono essere considerati per il successo di questo approccio sperimentale:

Scelta gratuitamente dei lipidi bilayer proteoliposomi e destinazione: Lipidi cationici non si trovano in natura, mentre i lipidi anionici sono abbondanti nelle membrane biologiche, raggiungendo, per esempio, ~ 25, 35 e 20% nella membrana interna di e. coli, membrana plasmatica di lievito S. cerevisiaee membrane mitocondriali interne dei molte specie, rispettivamente di28,27,29. Sarebbe ragionevole aspettarsi che la funzionalità delle proteine di membrana in PL+ può dipendere dalla forza di una carica positiva del bilayer, che a sua volta dipenderebbe da un contenuto relativo di lipidi cationici in doppio strato ed esterni ionico forza. Pertanto, è importante affrontare sperimentalmente fino a che punto funzionalità delle proteine di membrana di interesse dipenderebbe la carica dell'ambiente dei lipidi cationici. Qui, ci mostrano che entrambi F1Fo ATP sintasi e bo3-ossidasi sono sensibili all'ambiente dei lipidi cationici, ma siamo riusciti a modulare e invertire questo effetto prima posizionando le proteine in PL+ e consegnarli in anionici accettando lipidici e quindi aumentare la forza ionica del mezzo di reazione dopo la fusione è finito.

Scelta di un particolari lipidi cationici: Maggior parte dei lipidi cationici commercialmente disponibili sono di natura non-triacylglyceride; pertanto un lipido di candidati potenziali dovrà essere testato per la compatibilità con le proteine di membrana di interesse. Abbiamo trovato in precedenza15 che il trifosfato di adenosina synthase utilizzato in questo studio ha dimostrato la che sua migliore prestazione in PL+ formata di etile-PC, che ha la più alta somiglianza strutturale per i lipidi naturali triacylglyceride, mentre in DOTAP (non-triacylglyceride lipidica) PL+ questa proteina è stato meno attiva.

Saggi di fusione della vescicola: Fusione della vescicola vero (quando intravesicular contenuto liquido mix) deve essere differenziato da stati intermedi di hemi-fusione, quando le vescicole aderiscono a vicenda senza miscelazione loro contenuto acquoso, ma prontamente mescolano il contenuto del loro esterno o entrambi del lipido 30di volantini. In caso di miscele del lipido non ottimale o di certe condizioni, vescicole dimostrano anche perdite di contenuto liquido pronunciate durante fusione31. Concentrazioni minime di caricati lipidi in miscele fusogena attivazione vera e propria fusione devono essere trovati sperimentalmente per ciascuna specie di lipidi, ma in generale, si è scoperto che le membrane con meno del 10% addebitato lipidi sono resi non-fusogena 32.

Mentre forma fusogena SUV in presenza di ioni di multi-valent, è importante non mescolare componenti di caricate opposta, poiché ciò può causare agglutinamento immediato e aggregazione dei lipidi di questi ioni. Ad esempio, durante la preparazione di SUV per il metodo di cobalto-calceina-EDTA, è importante evitare di miscelare una miscela di lipidi cationici con EDTA per impedire l'intasamento del filtro in policarbonato da componenti ragruppate.

È anche importante ricordare che il metodo di cobalto-calceina-EDTA, pur essendo molto sensibile e conveniente per il monitoraggio in tempo reale fusione, può continuano a sottovalutare la portata della fusione dovuto 1) auto-estinzione della fluorescenza di calceina libero all'interno postfusion vescicole, che dovrebbe raggiungere 1 mM, mentre la soglia di auto-spegnimento è segnalata per essere circa 20 µM33e 2) associato a superficie cobalto-calceina, che rimane legato ai SUV+ anche dopo il passaggio attraverso la resina di gel-filtrazione e colori, vescicole di un brillante colore arancione, mentre SUV0 hanno un colore arancio pallido. Si noti inoltre che rilascio del cobalto-calceina associato con l'aggiunta di detergente Triton X-100 in presenza di EDTA genera segnali molto più forti per SUV+ (Figura 3, traccia rossa) di SUV0 (grigio traccia).

Prospettive: ci aspettiamo che i veloci approcci descritti qui possono notevolmente facilitare e velocizzare il montaggio delle membrane complesse per le esigenze delle applicazioni di biologia sintetica emergenti. Il nostro protocollo di ricostituzione della proteina di membrana prende solo mezz'ora per la ricostituzione delle proteine di membrana grande fragile conosciuto per essere sensibile alle tecniche di ricostituzione basati su dialisi lunga, mentre questo approccio fusogena prende solo il 5-10 min per consegnare tali proteine in grande lipidici. Qui, noi dimostrare i vantaggi di questi approcci manipolando Escherichia coli F1Fo ATP sintasi, che è un esempio di una proteina fragile. Esso è composto di 23 unità secondarie ed è conosciuto per prontamente perde la sua integrità se esposto a condizioni non ottimali (ad esempio, calore) durante/dopo solubilizzazione, ma viene utilizzato in queste procedure, la proteina dimostra riproducibile ad alta attività in protone di pompaggio.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati a Robert Gennis dall'Università dell'Illinois e Christoph von Ballmoos dall'Università di Berna per la fornitura di un plasmide e un ceppo di esprimere bo3-ossidasi. Il progetto è stato sostenuto dalla BBSRC concedere BB/L01985X/1 a R.I. e R.B.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lipidi neutri DOPCAvanti Lipids850375
POPA lipidi anionici AvantiLipids840857
E-PC lipidi cationiciAvanti Lipids890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12ThermofisherC3927MP
Sephadex G-50, Super FineSigmaG5050
Ficoll 400, Type 400-DLSigmaF8016
ACMASigmaA5806
NigericinSigmaN7143
ATPSigmaA26209
Q1SigmaC7956
DTTSigmaD0632
PEPSigma860077
NADHSigmaN8129
PKSigmaP9136-1KU
LDHSigmaL1254-1KU
LuciferinSigmaL6882
LuciferaseSigma/Roche10411523001
CalceinInsight Biotechnologysc-202090
CoCl2SigmaC8661
EDTASigmaE6758
Sulforhodamine 101SigmaS7635
Sistema di estrusioneAvanti Extruder
Luminometro a tubo singolo, modello Sirius LTitertek Berthold
Filtro in policarbonato, D19 mmSigma, Whatman NucleporeTrack-Etched MembranesWHA800309, WHA800284100 o 200 nm per formare SUV e 400 o 800 nm per LUV
NameAziendaNumero catalogoComments
Tamponi utilizzati nella carta
Buffer A100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4, 0,1 mM MgCl2
Buffer C100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4
Buffer D1 mM MOPS pH 7,4
Varie concentrazioni di KCl

Riferimenti

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