Che utilizzano un sistema di arricchimento di immunoprecipitazione completa per identificare un profilo di modificazione post-traduzionale endogeno per proteine bersaglio

Summary

Indagando più, modificazioni post-traduzionali endogeni per una proteina bersaglio possono essere estremamente impegnativi. Tecniche descritte qui utilizzano un sistema di tampone e di filtro ottimizzato Lisi sviluppato con PTM-targeting specifico, matrici di affinità per rilevare le modifiche di fosforilazione di acetilazione, ubiquitinazione, sumoilazione 2/3 e tirosina per una destinazione proteine utilizzando un unico sistema semplificato.

Abstract

Ora è ben apprezzata che modificazioni post-traduzionali (PTM) giocano un ruolo fondamentale nella regolazione di una proteina struttura e funzione, che può essere essenziale per il ruolo di una data proteina sia fisiologico e patologico. Arricchimento di PTMs è spesso necessario quando si esamina lo stato PTM di una proteina dell'obiettivo, perché PTMs sono spesso transitori e relativamente basso in abbondanza. Molte insidie sono incontrate quando arricchimento per un PTM di una proteina dell'obiettivo, come incompatibilità buffer, l'anticorpo di proteina bersaglio non è compatibile con IP, perdita di segnale PTM e altri. Il grado di difficoltà è amplificato quando indagando PTMs multipli come la fosforilazione di acetilazione, ubiquitinazione, sumoilazione 2/3 e tirosina per una proteina di destinazione specificata. Studiare una combinazione di questi PTMs può essere necessario, come diafonia tra PTMs è prevalente e fondamentale per la regolazione della proteina. Spesso, questi PTMs sono studiati in buffer di lisi diverse e con composizioni di unico inibitore. Per semplificare il processo, un sistema unico di lisi denaturante che è stato sviluppato in modo efficace gli isolati e conserva queste quattro PTMs; consentendo così, indagine di crosstalk potenziali in un sistema singolo lisi. Un sistema di filtro unico è stato progettato per rimuovere la contaminazione di DNA genomico da lisato, che è un sottoprodotto problematico di denaturare il buffer. Matrici di affinità robusto targeting per ciascuno dei quattro PTMs sono stati sviluppati in concerto con il sistema di buffer per massimizzare l'arricchimento e il rilevamento degli Stati endogeni di questi quattro PTMs. Questo set di strumenti completo rilevamento PTM semplifica il processo di ottenimento di informazioni critiche se una proteina viene modificata da uno o più di questi PTMs.

Introduction

Modificazioni post-traduzionali (PTM) sono altamente regolamentate alterazioni ad una proteina, per cui la modifica viene aggiunto o rimosso in modo specifico. PTM sono spesso cambiamenti dinamici, transitori che alterano significativamente la struttura della proteina, interazioni con proteine partner e la localizzazione spaziale e in ultima analisi, consentendo alle proteine di eseguire funzioni distinte^{1,2 , 3 , 4}. PTMs sono così abbondanti che aumentare il numero di moduli di proteina unica (o proteoforms) da circa 30.000 prodotti del gene a oltre 1 milione proteoforms^5,6. Individuare le PTMs e definire il loro effetto su una proteina dell'obiettivo è critico verso la comprensione funzioni fisiologiche e patologiche^{7,8,9,10, della proteina 11,12,13,14}. Il lavoro sulle proteine selezionate come tubulina, p53 e recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) sono chiariti i ruoli regolatori di PTMs^15,16,17. Questi studi ha scoperto il fatto che il regolamento di queste proteine si verifica da più PTMs, e in molti casi queste modifiche funzionano di concerto per promuovere una funzione specifica. Nuovi studi hanno mostrato che diafonia PTM cooperativa sia negativo può verificarsi su parecchie proteine differenti^{18,19,20,21,22, 23,24,25}. Tuttavia, i profili PTM della maggior parte delle proteine sono costruiti da diversi studi che hanno utilizzato diversi modelli e condizioni uniche. Avere un sistema ottimizzato di indagare PTMs multipli in un unico sistema sarebbe estremamente utile per ottenere informazioni sulle potenziale diafonia PTM per una proteina dell'obiettivo.

Una sfida con indagando PTMs in un unico sistema è che PTMs specifici sono studiati utilizzando il buffer di lisi distinti. Ad esempio, l'utilizzo di buffer come RIPA o NP-40 che sono comunemente usati per le indagini di fosforilazione o ubiquitinazione può essere inadeguato per studiare un PTM labile come piccolo ubiquitina-come modificatore (SUMO) ylation²⁶. Inoltre, non-denaturante buffer sono inadeguate per la dissociazione di interazioni della proteina e può portare a falsi positivi PTM identificazione²⁷. Indagando PTMs in un buffer di lisi di denaturazione può essere comodo, come esso è significativamente migliore a isolare proteine da tutti i compartimenti cellulari²⁸, dissocierà la maggior parte delle interazioni della proteina e inibirà la proteasi che alterano gli Stati PTM, come deSUMOylases ²⁶; Tuttavia, denaturazione buffer possono compromettere l'integrità dei reagenti di affinità specifica quali ubiquitina associazione strumenti basati su dominio²⁷. Sviluppando un sistema di denaturazione-come Lisi per studiare più PTMs di una proteina in un sistema compatibile con reagente di affinità sarebbe estremamente utile per le indagini di diafonia PTM.

Anche se buffer denaturante hanno vantaggi chiave respingenti non-denaturante per indagare PTMs, sono meno comunemente usati a causa delle loro notevoli inconvenienti, quali incompatibilità con analisi convenzionali proteina, significative genomica contaminazione di acido desossiribonucleico (DNA) e la rottura di immunoprecipitazione (IP) reagenti²⁹. Questi inconvenienti possono causare nel tempo di preparazione estesa e danni potenziali proteine bersaglio quando tosatura DNA genomic. Due metodi comunemente utilizzati per la tosatura del DNA includono siringa Lisi e sonicazione²⁹. Entrambi i metodi richiedono la vasta ottimizzazione e spesso non riproducibilità precisa. Metodi alternativi per rimuovere il DNA di genomic includono l'aggiunta di DNasi; Tuttavia, questo può richiedere ulteriore ottimizzazione e modifiche nella composizione del buffer. In definitiva, un metodo semplice e riproducibile per rimuovere la contaminazione di DNA genomico sarebbe vantaggioso quando si lavora con denaturazione buffer di lisi per indagini di PTM.

L'obiettivo di questa tecnica è quello di sviluppare un sistema per isolare e studiare ubiquitinazione (Ub), fosforilazione della tirosina (pY), sumoilazione 2/3 (SUMO 2/3) e PTMs acetilazione (Ac) in un unico sistema per meglio indagare diafonia PTM per una proteina dell'obiettivo. Questo sistema di rilevazione di PTM è stato utilizzato per indagare rapidamente il profilo PTM endogeno di diverse proteine bersaglio in un unico sistema. Nuovo approfondimento diafonia potenziale era identificato^30,31. Nel complesso, la tecnica descritta qui migliora i metodi esistenti per indagare PTMs e PTM area interattiva in tre modi diversi: 1) un unico buffer denaturante è stato sviluppato che gli isolati di proteine da tutti i compartimenti cellulari, pur essendo compatibile con Reagenti di affinità PTM, 2) è stato sviluppato un sistema di filtro unico che rapidamente rimuove la contaminazione di DNA genomico da lisati denaturato con elevata riproducibilità e richiede nessuna attrezzatura specializzata e 3) le perle di affinità robusto, sistema di lisi e inibitori i reagenti sono compatibili; semplificando in tal modo, l'isolamento di questi quattro PTMs per una proteina dell'obiettivo di massimizzare arricchimento PTM ed esaminare in modo efficiente potenziale area interattiva.

Protocol

1. preparazione del campione: Coltura cellulare

1. Crescere quattro piatti di 150 mm di cellule A431 nel mezzo dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale.
   1. Crescere le cellule A431 al confluency di 50%.
   2. Siero limitare le quattro piastre di cellule A431 con DMEM privo di siero per 24 h.
   3. Trattare due piastre di cellule A431 33,3 mg/ml di fattore di crescita epidermico per 1 h. lasciare le altre due piastre non trattate.
      Nota: Condizioni di crescita e trattamento di cella indicate qui forniscono un esempio; Tuttavia, questa metodologia è applicabile a molti tipi differenti delle cellule e le condizioni di trattamento.
2. Preparare blastR buffer di lisi e diluizione con inibitori (tabella 1). Combinare 2,895 mL di tampone di lisi blastR con 15 µ l di inibitore di tirosin fosfatasi, 30 µ l di deubiquitinase e deSUMOylase inibitore, 30 µ l dell'inibitore dell'istone deacetilasi (HDAC) e 30 µ l di inibitore della proteasi cocktail.
   1. Combinare 9,65 mL di tampone di diluizione blastR con 50 µ l di inibitore di tirosin fosfatasi, 100 µ l di deubiquitinase e deSUMOylase inibitore, 100 µ l dell'inibitore dell'istone deacetilasi (HDAC) e 100 µ l di inibitore della proteasi cocktail.
      Nota: Vedi Tabella materiali per informazioni di composizione e di inibitore di buffer.
3. Versare i terreni di coltura e le cellule sul ghiaccio. Quindi, lavare le cellule due volte con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x.
   1. Rimuovere tanto PBS come possibile prima dell'aggiunta di tampone di lisi blastR per massimizzare la lisi cellulare.
      Nota: Vedi Tabella materiali per la composizione di buffer.
4. Aggiungere 600 µ l di tampone di lisi blastR per ogni piatto di 150 mm. La quantità di tampone è basata sul rendimento atteso della proteina (tabella 2).
   1. Lisare le cellule con un raschietto in cella. Il lisato diventerà viscoso a causa di lisi nucleare.
5. Utilizzare una punta di Pipetta 1ml tagliato per trasferire il greggio lisato in un filtro di blastR che è stato messo in una provetta di raccolta da 15 mL (Figura 1). Qui, viene utilizzato un tubo falcon da 15 mL.
6. Usare un filtro in dotazione stantuffo completamente comprimere il filtro blastR e raccogliere il lisato flusso continuo, compresi eventuali bolle, in una provetta da 15 mL (Figura 1).
7. Facoltativo: Trasferimento chiarito lisato di una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare il lisato a circa 10.000 x g per 1 min a 4 ° C.
   1. Trasferire il surnatante di un nuovo tubo falcon da 15 mL.
8. Diluire il chiarificato lisato con tampone di diluizione blastR ad un volume finale di 3 mL per ogni piatto di 150 mm. Il volume finale è basato sul rendimento atteso della proteina (tabella 2).
   Nota: Questo passaggio è importante come la composizione di buffer finale influenzerà il rigore di reazione di IP.
9. Quantificare la concentrazione di proteina (sezione 2).

2. proteina quantificazione Assay

Nota: Utilizzare un dosaggio di quantificazione della proteina colorimetrico standard per determinare la quantificazione della proteina. Qui, la quantificazione della proteina è determinata mediante analisi di rosso della proteina avanzata di precisione.

1. Aggiungere 1 mL di reagente di dosaggio di precisione rosso proteina avanzata a ciascuna delle due provette da 1 mL.
2. Miscelare 10 µ l di tampone di lisi blastR e 40 µ l di tampone di diluizione blastR in una microcentrifuga pulito 1,5 mL sul ghiaccio.
   Nota: Questo verrà utilizzato per la lettura del campione della proteina in bianco.
3. Aggiungere 20 µ l del mix di buffer di lisi/diluizione (dal punto 2.2) prima provetta e mescolare capovolgendo due o tre volte.
4. Aggiungere 20 µ l del lysate delle cellule diluito (da esperimento) per la seconda cuvetta, miscelazione come sopra.
5. Incubare i campioni per 1 min a temperatura ambiente.
6. Spettrofotometro in bianco con l'esempio di mix del buffer di lisi/diluizione (dal punto 2.3).
7. Misurare l'assorbanza del campione lisato (dal punto 2.4) a 600 nm.
8. Determinare la concentrazione di lisato proteico come segue;
   campione di lettura OD₆₀₀ x 5 = concentrazione nella proteina in mg/mL
   Nota: Letture di OD inferiori 0,05 o superiori a 0,5 si trovano anche la capacità di intervallo lineare del dosaggio della proteina. Per letture > 0.5, i campioni possono essere diluiti. Per letture < 0.05, più lisato può essere aggiunto al reagente di dosaggio di precisione rosso proteina avanzata (fino a 50 µ l). Vedere tabella 3 per i moltiplicatori per convertire letture spettrofotometro in concentrazione lisato proteico mg/mL. Se c'è proteina insufficiente in un piatto, si consiglia di utilizzare 2 o più piastre per IP. In questo caso, piastre saranno raccolte in serie, trasferendo l'originale 300 µ l di tampone di lisi tra le piastre.
9. Basato su concentrazione nella proteina, diluire il campione con un mix di buffer (1 parte blastR Lisi: 4 parti blastR diluizione) ad una concentrazione finale desiderata (di solito 1 mg/mL).
10. Snap congelare aliquote di campioni che non verranno utilizzati immediatamente.
    1. Conservare i campioni a-70 ° C.
    2. Procedere al punto 3.

3. analisi di immunoprecipitazione (IP)

Nota: Perlina concentrazioni affinità, lisate concentrazioni e tempi di incubazione sono linee guida raccomandati e possono essere unici per ogni proteina bersaglio e PTM specifico oggetto di indagine.

1. Provette di reagente stock Inverti contenente perle di affinità di Ub, branelli di affinità pY, 2/3 affinità SUMO e Ac affinità perline diverse volte per assicurarsi che le perle sono risospese completamente nel tubo.
2. Per ogni dosaggio di IP, sospensione di aliquota perlina in microcentrifuga separata 1,5 mL su ghiaccio (tubo IP). Qui, aggiungere 20 µ l di branelli di affinità di ubiquitina, 30 µ l di phosphotyrosine branelli di affinità, 40 µ l di SUMOilazione perle di 2/3 affinità o 50 µ l di branelli di affinità di acetilazione per microcentrifuga individuali 1,5 mL sul ghiaccio.
   Nota: Vedere tabella 4 per il volume consigliato di sospensione tallone da utilizzare per ogni branello di affinità.
3. Inverti stock provette contenenti microsfere di controllo IP ubiquitinazione e IgG Controllo perline diverse volte per assicurarsi che le perle sono risospese completamente nel tubo.
4. Microsfere di controllo aliquota per reazione di controllo per determinare il legame non specifico (tubo di controllo IP). Qui, aggiungere 20 µ l di sfere di controllo Ub, 30 µ l di sfere di controllo pY, 40 µ l di sfere di controllo di 2/3 di SUMO o 50 µ l di sfere di controllo Ac per microcentrifuga individuali 1,5 mL sul ghiaccio.
   Nota: Vedere tabella 4 per il volume consigliato di sospensione tallone da utilizzare per ogni tipo di cordone di affinità.
5. Salvare una piccola quantità di lisato (20 µ l) per l'esecuzione come un western blot lisato controllo input. Aggiungere 5 µ l di tampone di campione 5 x e far bollire a 95 ° C per 5 min.
   Nota: Vedi Tabella materiali per la composizione di buffer.
6. Aggiungere lisato per ogni IP tubo e tubo di controllo IP. Qui, 1 mg di lisato è stata usata per reazione IP e controllo, risultante in un totale di 8 reazioni di IP.
   Nota: 1,0 mg di lisato per test è raccomandato come punto di partenza. La quantità di lisato sarà necessario variare dipendendo l'abbondanza di proteine modificate.
7. Incubare le provette su una piattaforma rotante di fine oltre a 4 ° C per 2 h. Qui, un rotatore del tubo ATR è stato utilizzato a velocità 22.
8. Raccogliere perle per centrifugazione a 3.000-5.000 x g per 1 min a 4 ° C.
9. Aspirare sovranatante quanto più possibile senza disturbare le perline.
10. Lavare perline in 1ml blastR tampone di lavaggio (inibitori non sono necessari in questa fase) per 5 min a 4 ° C piattaforma rotante.
11. Raccogliere perle per centrifugazione a 3.000-5.000 x g per 1 min a 4 ° C.
12. Aspirare sovranatante quanto più possibile senza disturbare le perline.
13. Ripetere la fase di lavaggio (passaggi 3.10-3.12) altre due volte.
14. Dopo il lavaggio finale, rimuovere completamente il surnatante di buffer. Un'interruzione minima del pellet perlina è accettabile (fino a una perdita del 5%). Rimuovere residui supernatante utilizzando una multa foro proteina carico di punta.
15. Aggiungere 30 µ l di tampone di eluizione del branello e risospendere le perline, maschiatura/spostando delicatamente il lato del tubo. NON utilizzare una pipetta in questa fase.
    Nota: Vedi Tabella materiali per la composizione di buffer.
16. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
17. Trasferire delicatamente ogni sospensione di perlina a una colonna di spin per microcentrifuga da 1,5 mL che è stata inserita in una microcentrifuga da 1,5 mL.
    Nota: È consigliabile tagliare la fine fuori la punta della pipetta di trasferimento per il trasferimento più delicato.
18. Centrifugare a 9.000-10.000 x g per 1 min a temperatura ambiente per raccogliere il campione IP.
19. Aggiungere 2 µ l di 2-mercaptoetanolo per ogni campione e mescolare bene.
    Nota: È conveniente agganciare il coperchio la colonna di spin e utilizzare questa opzione per chiudere la provetta di raccolta per l'ulteriore elaborazione.
20. Posizionare il campione nel bagnomaria a 95 ° C per 5 min esempio Collect mediante centrifugazione a 10.000 x g per 1 min a TA.
21. Se necessario, conservare i campioni a-70 ° C e fermarsi qui o procedere all'esecuzione di SDS-PAGE, trasferimento e analisi western blot (sezione 4).

4. Western Blot analisi: Identificazione della proteina di interesse

1. Campioni separati di sodio dodecil solfato elettroforesi del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) e trasferire ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF), secondo protocolli di laboratorio standard³².
2. Utilizzare un anticorpo primario per rilevare le versioni modificate traduzionalmente della proteina di interesse. Qui, PD-L1 anticorpo è stato usato per rilevare traduzionalmente modificate PD-L1.
3. Utilizzare il reagente di rivelazione ultrasensibile chemiluminescenza per il rilevamento.
   Nota: Il reagente chemiluminescente dovrebbe essere usato in combinazione con un anticorpo secondario marcato HRP in grado di rilevare l'anticorpo primario.
4. Utilizzare un volume di 2 mL di reagente chemiluminescente a membrana di dimensioni mini-gel trasferimento (circa 8 x 7 cm).
   1. Dopo incubazione con anticorpo secondario appropriato (60 min a RT è consigliato), lavare la macchia 6 x 10 min in 30 mL di soluzione fisiologica tamponata con tween-20 (TBST).
      Nota: Vedi Tabella materiali per la composizione di buffer.
   2. Immediatamente prima dell'uso, mescolare 1 mL di reagente chemiluminescente A con 1 mL di reagente chemiluminescente B (sufficiente per membrana 8 x 7 cm).
   3. Aggiungere il reagente chemiluminescente alla membrana e incubare con dolce dondolo a temperatura ambiente per 1-5 min prima della visualizzazione del segnale della proteina usando la pellicola di raggi x o imaging fotocamera charge coupled device (CCD).
      Nota: I tempi di incubazione nel reagente chemiluminescente eventualmente per proteine altamente abbondanti.

Results

La capacità di questi strumenti per indagare la diafonia PTM rilevando efficacemente questi 4 PTMs dipende in parte il sistema di buffer di lisi unico. Il buffer denaturante blastR isolate in modo efficace proteine da tutti i compartimenti cellulari allo stesso modo altri buffer denaturante, che assicura un profilo di proteina completa (Figura 2A). Inoltre, conserva altamente labile PTM segnali come SUMO 2/3, che è rapidamente diminuito nel buffer non-denaturante come radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (Figura 2B). Cosa importante, quando diluiti in modo appropriato, non influenza l'integrità dei reagenti affinità come altri buffer denaturante (ad es., Laemmli buffer).

Un ostacolo significativo quando si lavora con buffer denaturante è la capacità di rimuovere efficacemente la contaminazione di DNA genomico. La metodologia convenzionale per ridurre la viscosità è di taglio del DNA utilizzando un ago di siringa o sonicating il campione. Figura 3A Mostra contaminazione di DNA genomico in A431 cella lysate dopo il trattamento con il filtro BlastR, siringa o sonicazione. Non c'è quasi completa rimozione del DNA genomico utilizzando il filtro di BlastR, che non è il caso utilizzando un ago di siringa convenzionale o sonicazione. Contaminazione di DNA genomico influisce in modo significativo la migrazione della proteina attraverso un gel di acrilammide SDS; Tuttavia, il trattamento con il filtro BlastR rimuove il DNA genomico, con conseguente migrazione corretta della proteina (Figura 3B). Alterata migrazione causata da contaminazione di DNA genomico può influenzare significativamente la interpretazione dei western blot; ad esempio, lo spalmato EGFR modello visto nella non filtrato lisato può essere erroneamente interpretato come espressione aumentata rispetto al campione filtrato (Figura 3).

Utilizzando questo sistema di rilevamento e di arricchimento PTM ottimizzato, si può rapidamente determinare se una proteina bersaglio viene modificata da uno o più PTMs. ricerca del profilo PTM PD-L1 è stata recentemente realizzata utilizzando questa tecnica, e i risultati hanno mostrato che il PD-L1 è stata ubiquitinate, acetilato e tirosina fosforilata in risposta a EGF (Figura 4). D'importanza, questi dati riportavano endogeno PD-L1 PTM variazioni, che ha rappresentato una piccola percentuale del totale PD-L1 identificato.

Figura 1: filtro DNA genomico da lysate delle cellule con filtro BlastR. (A) immagine di BlastR filtro. (B) Lysate viene caricato nel filtro che è stato messo in una provetta da 15 mL. (C) il pistone viene inserito nella siringa e lisato viene passato attraverso il filtro di compressione. (D) raccogliere lisato, compresi eventuali bolle attraverso compressione completa. (E) filtrato lisato.

Figura 2: confronto tra buffer di lisi BlastR ai buffer di lisi alternativi. Figura 2A adattato da Horita et al. 2017. Biosci . Rep. ³¹ (A) le cellule A431 sono state lisate con BlastR, RIPA, mPER, Lisi IP, denaturazione (1% SDS) e Laemmli buffer di lisi. Tutti i lysates denaturante aveva rimosso utilizzando filtro BlastR il DNA di genomic. Isolamento delle proteine dalla membrana citoplasmatica, mitocondriale e marcatori nucleari sono state determinate usando gli anticorpi contro le proteine marker rispettivo vano. (B) le cellule A431 sono state lisate con BlastR, RIPA e 1% SDS buffer denaturante. Lisati sono stati immunoprecipitati con SUMO 2/3 o controllo IgG affinità perline. Campioni sono stati separati da SDS-PAGE e analizzati mediante western blot usando un anticorpo di 2/3-perossidasi (HRP) SUMO. Rappresentante delle macchie da N≥3 esperimenti indipendenti sono mostrati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: BlastR Lisi filtro è efficace nella rimozione del DNA di genomic. (A) le cellule A431 sono state lisate con un buffer di lisi di denaturazione. Il DNA genomico è stato rimosso o tosato con filtro BlastR, siringa o sonicazione per 5, 10, 20 o 30 secondi. 2% del lisato è stato analizzato il bromuro di etidio, elettroforesi del gel dell'agarosi. (B) Lysate dalle cellule A431 lisate con un tampone di denaturazione o era non filtrato o filtrare con il filtro BlastR. I campioni sono stati separati con SDS-PAGE e visualizzati usando Coomassie macchia. (C) duplicato campioni da B sono stati separati da SDS-PAGE, trasferito al PVDF, e della proteina EGFR è stata esaminata usando un anticorpo EGFR. Rappresentante macchie da esperimenti indipendenti di N ≥ 3 sono mostrate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: rilevamento di modifiche post-traduzionali EGF-indotta per PD-L1. Figura adattata da Horita et al. 2017. neoplasia³⁰(A). Siero-limitata cellule A431 erano entrambi non stimolate (UT) o stimolati con EGF per un'ora prima della lisi con buffer di lisi BlastR. WCL è stato analizzato per livelli di PD-L1 (corsie 1,2). Ubiquitin associazione sfere (UBA01) sono stati utilizzati per proteine ubiquitinate IP (corsie 3,4). Perle di phosphotyrosine binding (APY03) sono stati utilizzati per proteine tirosina-fosforilate IP (corsie 5,6). Perle di 2/3 Associazione di SUMO (ASM24) sono stati utilizzati per proteine SUMOilate IP 2/3 (corsie 7,8). Perle di acetile lisina associazione (AAC01) sono stati utilizzati per proteine IP acetilato (corsie 9,10). Microsfere di controllo associazione di igG sono stati utilizzati per proteine di legame non specifico IP (corsie 11,12). Campioni sono stati separati da SDS-PAGE e analizzati mediante western blot usando un anticorpo di PD-L1. Viene mostrata una rappresentante della macchia da esperimenti indipendenti di N ≥ 3. Asterischi bianchi sono stati usati per evidenziare PD-L1 pY e fasce della proteina Ac. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Calcoli per il buffer di lisi BlastR
	1,0 mL	2.0 mL	5,0 mL	10,0 mL
Buffer di lisi BlastR	965 Μ l	Μ L 1930	4,825 mL	9,650 mL
Fosfatasi della tirosina inibitore	5 Μ l	10 Μ l	25 Μ l	50 Μ l
inibitore di de-ubiquitinase/de-sumoylase	10 Μ l	20 Μ l	50 Μ l	100 Μ l
Inibitore HDAC	10 Μ l	20 Μ l	50 Μ l	100 Μ l
Inibitore della proteasi cocktail	10 Μ l	20 Μ l	50 Μ l	100 Μ l
Calcoli per tampone di diluizione BlastR
	4,0 mL	8,0 mL	20,0 mL	40,0 mL
Buffer di lisi BlastR	3,86 mL	7,72 mL	19,3 mL	38,6 mL
Fosfatasi della tirosina inibitore	20 Μ l	40 Μ l	100 Μ l	200 Μ l
inibitore di de-ubiquitinase/de-sumoylase	40 Μ l	80 Μ l	200 Μ l	400 Μ l
Inibitore HDAC	40 Μ l	80 Μ l	200 Μ l	400 Μ l
Inibitore della proteasi cocktail	40 Μ l	80 Μ l	200 Μ l	400 Μ l

Tabella 1: Preparazione grafico del Buffer di lisi e diluizione. Grafico che fornisce le concentrazioni degli inibitori di aggiungere per un volume determinato di accumulo Lisi e diluizione durante la preparazione tamponi per lisi cellulare.

Contenuto proteico del piatto	Volume di tampone di lisi BlastR consigliato	Volume di tampone di diluizione BlastR consigliato
< 1 mg	Combinare le proteine dalle piastre multiple	Per rendere 1,5 mL di volume finale
1-2 mg	300 Μ l	Per rendere 1,5 mL di volume finale
2-4 mg	600 Μ l	Fare 3 mL di volume finale
4-6 mg	900 Μ l	Per rendere 4,5 mL di volume finale

Tabella 2: BlastR Lisi/diluizione Buffer grafico. Grafico che fornisce consigliato volumi di tampone di lisi e diluizione quando si ottengono lisato.

Volume di lisato cellulare aggiunto a 1 ml di reagente di analisi della proteina di precisione rosso (µ l)	Moltiplicatore da utilizzare con il campione di lettura OD600
10	10
20	5
30	3.3
40	2.5
50	2

Tabella 3: Moltiplicatori per convertire letture spettrofotometro in mg/mL lisato. Grafico di fornire numero di conversioni di aiutante con concentrazione nella proteina di calcolo.

branelli di affinità	volume del branello liquami/IP (mL)
Ubiquitinazione	20
Phosphotyrosine	30
Sumoilazione 2/3	40
Acetilazione	50
microsfere di controllo	volume del branello liquami/IP (mL)
Microsfere di controllo ubiquitinazione	20
Microsfere di controllo Phosphotyrsoine	30
Microsfere di controllo di 2/3 di SUMOilazione	40
Microsfere di controllo acetilazione	50

Tabella 4: Volume di perline/IP grafico raccomandato. Grafico che fornisce quantità raccomandate di branelli di affinità da utilizzare per ogni reazione di IP.

Discussion

Approcci iniziali utilizzati per determinare se una proteina bersaglio viene modificata da un PTM possono essere eseguiti utilizzando l'anticorpo specifico di proteine bersaglio per IP, seguita da western blot con un anticorpo PTM (ad es., anti-acetil lisina), o utilizzando un anticorpo PTM per IP, seguita da western blot con l'obiettivo della proteina anticorpo specifico^30,31,33. Mentre in teoria funzionano entrambi gli approcci, utilizzando un anticorpo proteina-specifico della destinazione ha più potenziali insidie, come l'anticorpo potrebbe non essere IP compatibile, o grandi modifiche PTM possono bloccare il sito di riconoscimento dell'anticorpo in proteina bersaglio^{34 ,35}. Il vantaggio dei branelli di affinità PTM è che i domini dell'anticorpo o associazione riconoscano specificamente la PTM di interesse; così, modifiche alla proteina bersaglio non dovrebbero alterare il riconoscimento dai branelli di affinità. Ad esempio, Ub PD-L1 è stata identificata con la tecnica qui descritta, ed entrambi endogena mono - e poli-Ub è stato osservato (Figura 4). Una recente pubblicazione di Lim et al. utilizzate tecniche di Ub in vitro per studiare PD-L1 Ub, e il risultato è stato molto simile ai risultati mostrati nella Figura 4³⁶. È interessante notare che, si sono esibiti anche IP con un anticorpo di PD-L1 per arricchire PD-L1 dalla cella lysata, dove Ub overexpressed e MG-132 è stato aggiunto per migliorare il segnale. Il modello di Ub non era robusto e molto distinto dal modello Ub in vitro . Indagine di endogeno PD-L1 Ub in modelli di coltura cellulare non è stata eseguita nella Lim et al. report per chiarire la differenza tra i dati di cella cultura e in vitro .

Indagando se una proteina è stata modificata da un PTM può essere difficile, grazie alla sua abbondanza bassa e la natura transitoria^37,38e spesso richiede l'arricchimento tramite IP. IP di PTMs efficace richiede l'ottimizzazione di diversi passaggi chiave e reagenti, come buffer di lisi e reagenti di affinità. L'istruttoria PTMs multiple di una proteina dell'obiettivo, l'ottimizzazione necessaria probabilmente aumenta. Utilizzando il sistema di lisi blastR è un passo fondamentale in questo protocollo, in quanto mantiene robusta funzionalità IP, consentendo la rilevazione di PTM del pY, SUMO 2/3, Ub e Ac PTMs in un unico sistema. Questa tecnica consente di ottimizzare il tempo e le risorse necessarie per determinare se una proteina target specifico viene modificata da questi quattro PTMs e potenzialmente fornisce un quadro migliore della diafonia PTM relativo confrontando i risultati PTM eseguite utilizzando sistemi multipli di lisi. Ricerca della compatibilità del sistema blastR lisi con PTMs alternativi, come la glicosilazione, è stata realizzata; Tuttavia, esso non è stato esaminato esaurientemente per tutti i tipi di PTMs.

Copioso DNA genomico può interferire con misure di proteina utilizzando uno colorimetrico o metodi nanodrop, influenzano la migrazione delle proteine in un gel di acrilammide SDS e impedire l'interazione di matrice proteica e affinità durante le analisi IP. Il metodo qui descritto utilizza un filtro specializzato per rimuovere efficacemente la contaminazione di DNA genomico, che è un altro passaggio fondamentale del presente protocollo. Per evidenziare questo punto, viscosità prove sono state eseguite prima e dopo trattamento di filtro blastR, e i risultati hanno mostrato una riduzione da un'alta viscosità alla viscosità dell'acqua (dati non mostrati). Questo cambiamento di viscosità è stato sostenuto tramite i risultati in Figura 3, che mostra che quasi tutto il DNA genomico era stato rimosso. D'importanza, DNA non è tosato con questo metodo, come qualsiasi DNA tranciata non verrà acquisito dal filtro (dati non mostrati). Questo strumento è superiore ai metodi tradizionali, come la sonicazione o siringa-DNA-tosatura, perché non richiede nessuna attrezzatura specializzata, è altamente riproducibile e rimuove il DNA invece tosandolo. Inoltre, non si degradano proteina nel lisato, che può verificarsi utilizzando i metodi convenzionali²⁹. Utilizzando il filtro prende 5-30 secondi per campione rispetto ai metodi alternativi dove efficace ripartizione del DNA potrebbe richiedere alcuni minuti (cioè, siringa tosatura) e può provocare la eterogeneità del campione come contaminanti DNA rimangono nel lisato. È stata eseguita un'analisi approfondita del lisato blastR pre- e post-filtraggio, e nessuna differenza osservabile nel profilo della proteina è stata osservata di Coomassie, analisi PTM occidentale, o totale e specifica della destinazione specifica della destinazione; così, l'integrità del profilo proteico non falsato filtrando il DNA genomic. In definitiva, questo sistema di filtro è utile per qualsiasi occidentale o applicazione IP dove il DNA di genomic è presente e può influenzare l'interpretazione dell'analisi della proteina.

È importante notare che non c'è potenziale per il rilevamento del falso negativo che utilizzano questa tecnica, che può essere dovuta in parte alla saturazione del branello di affinità, associazione sito interferenze o mascheramento PTM. Per esempio, una proteina particolare destinazione potrebbe essere modificata da Ac a livelli molto bassi; così, può non essere isolato dai branelli di affinità di lisina pan-acetile che hanno stati saturati di proteine più abbondanti di destinazione Ac-modificato. Essendo in corso studi per valutare i limiti di rilevazione dei reagenti affinità utilizzati nel presente protocollo, ma una recente pubblicazione suggerisce un limite di rilevazione molto robusto. I dati hanno mostrato che questa tecnica potrebbe identificare come pochi come 17 molecole di proteina bersaglio acetilato per cella³¹. Ancora, circostanze specifiche, ad esempio una cella digitare specificità, transitoria PTMs in risposta a stimoli specifici, o mascheramento di PTMs a causa di interazione della proteina può generare tutti i risultati falsi negativi. Queste sono le potenziali insidie di questa tecnica, come pure la maggior parte dei metodi PTM IP. Pertanto, si consiglia di confermare i risultati utilizzando diversi approcci.

Modifiche come fosforilazione e glicosilazione sono state indicate per competere per simili aminoacidi^39,40e altri PTMs come ubiquitinazione e fosforilazione hanno dimostrati di lavorare in sequenza per regolare una proteina funzione^17,41. Recenti lavori sulla proteina Tau neuropathological ha evidenziato l'importanza di crosstalk PTM, qualora Tau iper-fosforilazione e sumoilazione Tau una vicenda⁴². Inoltre, questo gruppo ha indicato che sumoilazione di Tau ha impedito poli-Ub e successiva degradazione Tau, possibilmente conducendo all'aggregazione. Questo è solo uno dei tanti esempi di regolamentazione area interattiva PTM, e l'utilità di questa tecnica vi aiuterà ad per illuminare l'importanza di PTMs e loro area interattiva nella regolazione di proteine chiave nella salute e nella malattia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lisi cellulare/Rimozione e analisi del DNA genomico
1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	tampone comune		Ricetta: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
BlastR tampone di lisi	Cytoskeleton Inc.	BLST01	Miscela brevettata di detergenti, sali e altri additivi tampone Tampone
saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA)	comune		Ricetta: Tris-HCl, NaCl, SDS, desossicolato di sodio, Igepal
Reagente per l'estrazione di proteine di mammifero (mPER)	Thermofisher	78503	Miscela brevettata di detergenti, sali e altri additivi tampone
Immunoprecipitazione (IP) Lisi Pierce		87787	Miscela brevettata di detergenti, sali e altri additivi tampone
tampone denaturante 1% sodio dodecil solfato (SDS) tampone	comune		Ricetta: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Tampone		Laemmli	Ricetta: Tris-HCl, SDS, glicerolo, blu di bromofenolo
Tampone di diluizione BlastR	Cytoskeleton Inc.	BDB01	Miscela brevettata di detergenti, sali e altri additivi tampone
Cocktail di inibitori della proteasi Cytoskeleton	Inc.	PIC02
N-etilmaleimmide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-piridilmetil)etilendiammina (TPEN)	Citoscheletro Inc.
Tricostastatina A (TSA) & Citoscheletro di nicotinammide	Inc.	TSA01
Ortovanadato di sodio attivato (Na3VO4)	Cytoskeleton Inc.	Raschietti cellulari PYI01
	Costar	3008
BlastR Filter	Cytoskeleton Inc.	BLR02
BD Ago per siringa da insulina	BD	08290-3284-11
sonicatore (sonificatore Branson)	Sonificatore Branson	450
reagente proteico avanzato rosso di precisione	citoscheletro Inc.	ADV02
Cuvette da 1 mL
Spettrofotometro (Genesys20)	Thermofisher	4001	Altri spettrofotomeri possono essere utilizzati per misurare la concentrazione di proteine
Agarosio	Fisher	BP1356-500
1kb Scala dell'acido desossiribonucleico (DNA)	NEB	N3232L
Scatola di gel DNA	Thermofisher	7312 B1A
Tris/Borato/EDTA (TBE) tampone	comune		Ricetta: Tris-HCl, acido borico, EDTA
PTM Immunoprecipitazione
Fosfotirosina perle	Citoscheletro Inc.	APY03-beads
ubiquitinazione	Cytoskeleton Inc.	UBA01-beads
SUMOilazione 2/3 perle Cytoskeleton	Inc.	ASM24-beads
acetilazione	Cytoskeleton Inc.	AAC04-beads Perle di
controllo della fosfotirosina	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads Perle per
	Cytoskeleton Inc.	CUB02-beads
SUMOilazione 2/3 perle di controllo	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads
controllo dell'acetilazione	Cytoskeleton Inc.	CIG02-beads BlastR tampone
di lavaggio	Cytoskeleton Inc.	BWB02	Miscela brevettata di detergenti, sali e altri additivi tampone Tampone
eluizione per perline	Cytoskeleton Inc.	BEB01	Miscela proprietaria di detergenti, sali e altri additivi tampone
microcentrifuga	Eppendorf	5417	È possibile utilizzare altre microcentrifughe
rotatore per tubi	ATR	RKVSD	Possono essere utilizzati altri rotatori per tubi end-over-end
punte per il caricamento delle proteine	VWR	37001-150
colonne di spin	Cytoskeleton Inc.	Blocco termico SPN22
95 ° C	Benchmark	BSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis
5x sample buffer	common		buffer recipe: Blu di bromofenolo, ditiotreitolo (DTT), glicerolo, SDS, Tris-HCl
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels	Invitrogen	XP04200BOX	I grandi wedgewell sono eccellenti per caricare grandi volumi
tampone		tampone in esecuzione	: Tris-HCl, Glicina, SDS
seeblue scala proteica	Technologies	LC5625
cella per elettroforesi	Invitrogen	Xcell surelock cella per elettroforesi	Altre celle per elettroforesi possono essere utilizzate, tuttavia queste sono compatibili con i gel novex wedgewell
alimentazione elettrica	Biorad	PowerPac HC	È possibile utilizzare altri alimentatori
1x Ricetta tampone			: Tris-HCl, glicina, metanolo
Cella di trasferimento	Mini cella trans-blot	Biorad	possibile utilizzare altre celle di trasferimento
Membrane Immobilon-P (PVDF)	millipore	IPVH 304F0
scremato	prosperare	813503015095
soluzione salina tamponata Tris con tween (TBST)	ricetta tampone		: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Reagente di rilevamento chemiluminescente	Citoscheletro Inc.	CLRA/CLRB
Crescita cellulare e trattamento
Dulbecco's Modified Eagle's medium	ATCC	30-2002
Siero fetale bovino	ATLAS	F-0500-A
Fattore di crescita epidermico	Cytoskeleton Inc.	CN02-A
Piastre per colture cellulari da 150 mm	Corning	430599