Articolo metodologico

Cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi

DOI:

10.3791/56919

⸱

2 gennaio 2018

 , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Complessità dei sistemi in vivo rende difficile distinguere tra l'attivazione e l'inibizione del recettore Notch di trans- e cis-ligandi, rispettivamente. Qui, presentiamo un protocollo basato su in vitro saggi l'aggregazione delle cellule per la valutazione qualitativa e semiquantitativa del legame di Drosophila tacca alla trans-ligandi vs cis-ligandi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tacca di segnalazione è un sistema di comunicazione cellula-cellula evolutivamente conservati utilizzato largamente in sviluppo degli animali e manutenzione dell'adulto. Interazione del recettore Notch con ligandi da cellule vicine induce l'attivazione del pathway di segnalazione (trans-attivazione), mentre l'interazione con ligandi dalla stessa cellula inibisce la segnalazione (cis-inibizione). Giusto equilibrio tra trans-attivazione e cis-inibizione aiuta a stabilire i livelli ottimali di tacca di segnalazione in alcuni contesti durante lo sviluppo degli animali. A causa dei domini di espressione sovrapposti di tacca ed i suoi ligandi in molti tipi cellulari e l'esistenza di meccanismi di feedback, studiando gli effetti di una determinata modifica alberino-translational su trans- versus cis-interazioni della tacca e suoi ligandi in vivo è difficile. Qui, descriviamo un protocollo per l'utilizzo della drosofila S2 cellule nelle analisi di aggregazione cellulare per valutare gli effetti di abbattere un modificatore di pathway di Notch nell'associazione della tacca ogni legante in trans e cis. S2 cellule stabilmente o transitoriamente trasfettate con un vettore che esprimono Notch sono mescolate con le cellule che esprimono ogni ligando Notch (S2-Delta o S2-dentellato). Trans-associazione tra i recettori e ligandi provoca la formazione di aggregati cellulari eterotipiche e viene misurata in termini di numero di aggregati / mL composto > 6 celle. Per esaminare l'effetto inibitorio di cis-ligandi, S2 cellule cheesprimono tacca e ogni ligando sono mescolate con le cellule S2-Delta o S2-dentellato e il numero degli aggregati è quantificato come descritto sopra. La relativa diminuzione del numero degli aggregati per la presenza di cis-ligandi fornisce una misura della cis-ligando-mediato l'inibizione di trans-associazione. Queste analisi semplice sugli effetti delle manipolazioni genetiche o farmacologici sull'associazione della tacca per suoi ligandi in grado di fornire dati semi-quantitativi e possono aiutare a decifrare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di tali manipolazioni sulla tacca di segnalazione.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canonico tacca di segnalazione è un meccanismo di comunicazione tra cellule a corto raggio che richiede il contatto fisico delle cellule per facilitare l'interazione tra recettori Notch e loro ligandi1vicine. Interazione del recettore Notch (presente sulla superficie delle cellule di segnale di ricezione) con ligandi (presenti sulla superficie di invio di segnale celle) avvia la tacca di segnalazione ed è conosciuta come trans-attivazione2. D'altra parte, l'interazione tra tacca ed i suoi ligandi nella stessa cella conduce all'inibizione del pathway Notch ed è conosciuta come cis-inibizione3. L'equilibrio tra trans- e cis-interazioni è necessaria per garantire l'ottima tacca di ligando-dipendenti di segnalazione4. Drosophila ha un recettore Notch e due ligandi (Delta e dentellato) al contrario di mammiferi, che hanno quattro tacca recettori e cinque ligandi [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-simile 1 (DLL1), DLL3 e DLL4]5. Avendo questa semplicità, il modello di Drosophila offre la facilità per sezionare/studio gli effetti dei modificatori di percorso su interazioni ligando Notch e successivamente su tacca di segnalazione. In determinati contesti durante lo sviluppo degli animali (tra cui lo sviluppo dell'ala in Drosophila), entrambi cis- e trans-interazioni sono coinvolti per ottenere adeguata tacca di segnalazione e delle cellule a destino1,6 . È importante distinguere gli effetti dei modificatori di pathway di Notch in questi contesti il cis- e trans-interazioni della tacca con suoi ligandi.

Il nostro gruppo ha precedentemente segnalato che l'aggiunta di un residuo di carboidrato chiamato xilosio di Drosophila tacca negativamente regola tacca di segnalazione in determinati contesti, tra cui ala sviluppo7. Perdita di shams (l'enzima che xylosylates tacca) conduce ad un fenotipo di "perdita della vena di ala"7. Più recentemente, gli esperimenti di dosaggio del gene e l'analisi clonale sono stati utilizzati per mostrare che la perdita di shams migliora tacca Delta-mediata individuazione. Distinguere se la tacca di segnalazione avanzata nei mutanti di shams è il risultato di una riduzione cis-inibizione o aumentata trans-attivazione, studi di sovraespressione ectopica di ligandi di Notch in dischi immaginali larvale ala sono state effettuate utilizzando il driver di dpp-GAL4 . Questi esperimenti fornito prova che suggerisce che Shams regola trans-attivazione di tacca da Delta senza intaccare la tacca cis-inibizione di ligandi8. Tuttavia, feed-back regolamenti e gli effetti dei ligandi endogeni potrebbero complicare l'interpretazione di sovraespressione ectopica studi1,6,9.

Per risolvere questo problema, drosofila S2 cellule10 sono stati utilizzati, che fornisce un sistema semplice in vitro per tacca-ligando interazione studi11,12. S2 cellule non esprimono endogeno del recettore Notch e Delta ligando11 ed esprimere un basso livello di dentellato13, che non influisce tacca-ligando aggregazione esperimenti8. Pertanto, le cellule S2 possono essere stabilmente o transitoriamente transfected di Notch e/o singoli ligandi (Delta o dentellato) per generare le cellule che esprimono esclusivamente il recettore Notch o uno dei suoi ligandi o una loro combinazione. Miscelazione delle cellule che esprimono Notch S2 con ligando-esprimendo risultati di cellule S2 nella formazione degli aggregati eterotipiche mediata da recettore-ligando associazione11,12,14. Quantificazione della formazione aggregata fornisce una misura della trans-associazione tra tacca e suoi ligandi15 (Figura 1). Allo stesso modo, le cellule S2 possono essere co-trasfettate con ligandi tacca e Delta o Serrate (cioè cis-ligandi). CIS-ligandi in queste cellule che esprimono Notch S2 abrogare l'associazione della tacca con trans-ligandi e risultato in diminuzione formazione aggregata8,12,14. Il relativo calo in formazione aggregata causata da cis-ligandi fornisce una misura dell'effetto inibitorio di cis-ligandi sull'associazione tra tacca e trans-ligandi (Figura 2). Di conseguenza, le analisi di aggregazione delle cellule sono state utilizzate per esaminare l'effetto di perdita di xylosylation trans- e cis-interazioni tra tacca ed i suoi ligandi.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per saggi di aggregazione cellulare finalizzata a valutare l'associazione della tacca con trans-ligandi e la sua inibizione di cis-ligandi usando le cellule della drosofila S2. Ad esempio, forniamo i dati che ci ha permesso di determinare l'effetto di xylosylation tacca sull'associazione tra tacca e trans-Delta8. Queste analisi semplice forniscono una valutazione semi-quantitativa del tacca-ligando interazioni in vitro e consentono a determinare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di modificatori del pathway di Notch.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparazione del doppio incagliato RNA (dsRNA) per atterramento di Shams

  1. Amplificazione di PCR dei prodotti
    1. È possibile utilizzare il DNA genomico di selvaggio-tipo bianco giallo (y w) e pAc5.1-EGFP come modello e le seguenti coppie di primer per amplificare i frammenti di DNA utilizzati nella sintesi di dsRNA. Utilizzare il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 30 s), ricottura (58 ° C, 30 s) ed estensione (72 ° C, 1 min).
      Migliorata la proteina fluorescente verde (EGFP) dsRNA primer (5' - 3')-
      Forward primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Reverse primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams dsRNA primer (5' - 3')-
      Forward primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Reverse primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Nota: EGFP dsRNA viene utilizzato come controllo negativo.
  2. Gel-purificare i prodotti di reazione a catena (PCR) polimerasi utilizzando un kit di purificazione del gel commerciale secondo il protocollo del produttore.
  3. Eseguire la trascrizione in vitro utilizzando un prodotto commerciale in grado di trascrivere da un promotore T7 secondo il protocollo del produttore.
  4. Purificare il dsRNA utilizzando un kit di purificazione di RNA secondo il protocollo del produttore e conservare a-80 ° C.
  5. Valutare l'efficienza di shams atterramento utilizzando la seguente procedura (1.5.1-1.5.5).
    1. Conteggio celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra 5x105 S2 cellule in ciascun pozzetto di un 6 anche piastra in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
    2. Aggiungere 7,5 µ g di EGFP- o dsRNA shams ad ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.
    3. Raccolto il controllo (EGFP dsRNA-Trattato) e shams dsRNA-Trattato S2 cellule pipettando dolce seguita da cubettatura giù mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min a 25 ° C e di processo per l'isolamento di RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA secondo protocollo del produttore.
    4. Quantificare il RNA usando un spettrofotometro e processo di 100 ng di RNA per passaggio 1 qRT-PCR utilizzando reagenti commerciali qPCR e primer/sonde e il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 15 s) e ricottura/estensione (60 ° C, 1 min).
      Nota: Vedere la Tabella materiali per informazioni sui set di primer/sonda e lo strumento utilizzato per esperimenti di qRT-PCR shams e controllo in questi studi.
    5. Calcolare i livelli di mRNA di relativo shams utilizzando 2–ΔΔCT metodo16.

2. valutazione dell'associazione tra il recettore Notch e Trans-ligandi

  1. Preparare il segnale di ricezione (cellule S2 che esprimono il recettore Notch).
    1. Contare le celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra 5x105 S2 e cellule S2-tacca stabili in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
      Nota: Per le cellule S2-Notch, che sono disponibili da Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), aggiungere 200 metotrexato nM nei media. Per preparare una soluzione stock di metotrexato 0,5 mM, in primo luogo preparare una soluzione di metotrexato 20 mM a 250 µ l di 1 M NaOH. Successivamente, diluire questa soluzione a 0,5 mM a 1 M fosfato tampone salino e conservare a-20 ° C. In cellule S2-tacca, espressione della proteina Notch è sotto il controllo del promotore della drosofila metallotioneina nel vettore di pMT .
    2. Aggiungere 7,5 µ g di dsRNA in ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.
    3. Aggiungere 0,7 mM CuSO4 inducono l'espressione di Notch e incubare a 25 ° C per 3 giorni.
      Nota: CuSO4 viene utilizzato per indurre l'espressione di proteine controllato dal promotore metallotioneina.
  2. Preparare l'invio segnale celle (cella di S2 esprimendo ligandi Delta o dentellato).
    1. Contare le celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra ~ 5 x 106 S2-Delta o S2-dentellatoTom cellule stabili in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1 mL/pozzetto di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
      Nota: Aggiungere 200 nM methotrexate per cellule S2-Delta e 100 µ g/mL igromicina per S2-dentellatoTom cellule nei media. Espressione di Delta e dentellatoTom— una versione funzionante di dentellato12pomodoro-etichetta — è in Drosophila metallotioneina promotore nel vettore di pMT .
    2. Aggiungere 0,7 mM CuSO4 inducono l'espressione di ligandi e incubare a 25 ° C per 3 h.
  3. Eseguire l'aggregazione tra le celle di segnale-invio e ricezione di segnale.
    1. Raccogliere la S2 dsRNA-Trattato (controllo) e cellule S2-tacca di pipettaggio delicato e piastra di 2.5 x 105 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti dopo il conteggio manuale di un emocitometro.
    2. Aggiungere cellule stabili 5x105 S2-Delta o S2-dentellatoTom in un volume totale di 200 µ l di terreno di Schneider (supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina).
      Nota: Tutte le cellule S2 gestione (compreso il trattamento di cromatura, induzione e dsRNA) è stato fatto sotto una cappa di biosicurezza.
    3. Collocare la piastra su un agitatore orbitale a 150 giri/min (rad 942,48/min).
    4. Dopo 1 min, mescolare il contenuto di ogni pozzetto e prendere 20 µ l per conteggiare il numero degli aggregati.
      1. Allo stesso tempo prendere un'immagine rappresentativa sotto microscopio composto invertito con ingrandimento 10x (obiettivo PLL 10/0.25).
      2. Contare manualmente le aggregazioni (> 6 celle) utilizzando un emocitometro.
    5. Posizionare la piastra su un agitatore.
    6. Ripetere l'acquisizione dell'immagine e il conteggio dopo 5 min e 15 min di aggregazione.
  4. Eseguire la quantificazione di trans-associazione.
    1. Calcolare il numero di aggregazioni / mL tra cellule S2 e S2-Delta o S2-dentellatoTom come un controllo di sfondo.
    2. Calcolare il numero di aggregazioni / mL tra S2-Notch e cellule S2-Delta o S2-dentellatoTom (magnitudo di trans-associazione).

3.Valutazione dell'inibizione del legame tra tacca e Trans-ligandi di Cis-ligandi

  1. Preparare cellule di segnale di ricezione.
    1. Le cellule di piastra 5x105 S2 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
    2. Aggiungere 7,5 µ g di dsRNA in ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.
    3. Co-transfect le cellule dsRNA-trattate con pBluescript e PMT-tacca11 (DGRC) da solo o con pMT-Notch e pMT-Delta11 (DGRC) o PMT-dentellato17 per un totale Concentrazione di DNA di 2 µ g/Beh utilizza un reagente di transfezione commerciale secondo il protocollo del produttore.
      Nota: pBluescript viene utilizzato come un controllo. Le cellule co-trasfettate saranno chiamate S2-tacca & Deltatransitoria o S2-tacca & dentellato celluletransitoria in seguito.
    4. Incubare le cellule S2 transfected transitoriamente a 25 ° C per 24 h.
    5. Aggiungere 0,7 mM CuSO4 inducono l'espressione di Notch e i ligandi e incubare a 25 ° C per 3 giorni.
  2. Preparare l'invio segnale celle come descritto al punto 2.2.
  3. Eseguire l'aggregazione tra le celle di segnale-invio e ricezione segnale come descritto nella sezione 2.3.
  4. Quantificare l'inibizione di trans-associazione di cis-ligandi.
    1. Calcolare il numero di aggregazioni / mL fra le cellule S2 e S2-Delta o S2-dentellato celle come un controllo di sfondo.
    2. Quantificare la grandezza di inibizione di cis-ligandi come segue.
      1. Definire A come numero di aggregazioni tra S2-taccatransitoria e cellule S2-Delta.
      2. Definire B come numero di aggregazioni tra S2 cellule transitoriamente co-trasfettate con tacca e Delta (S2-tacca & Deltatransitoria) e cellule S2-Delta.
      3. Calcolare la relativa aggregazione C = (B x 100) /A
      4. Calcolare la grandezza di inibizione di cis- ligando (Delta o dentellato) come 100 – C.
        Nota: ad esempio, se la relativa aggregazione è 45%, cis-ligandi sono considerati per inibire la trans-associazione del 55%.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le nostre osservazioni in vivo hanno suggerito che la perdita dei risultati di shams xylosyltransferase gene in guadagno di tacca di segnalazione causa di aumentata Delta-mediata trans-attivazione di tacca senza intaccare il cis-inibizione di Tacca di ligandi8. Per testare questo concetto, sono state eseguite analisi di aggregazione in vitro delle cellule. In primo luogo, shams espressione in cellule S2 è stato ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canonico tacca di segnalazione dipende le interazioni tra il recettore Notch e i suoi ligandi5. Anche se la maggior parte degli studi sul pathway di Notch considera principalmente l'associazione della tacca e ligandi in cellule vicine (trans), Notch e leganti delle stesse cellule interagiscono e questi cosiddetti cis-interazioni possono giocare un ruolo inibitorio nella tacca segnalazione di3,4. Di conseguenza, a decifrar...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori riconoscono supporto da NIH/NIGMS (R01GM084135 a HJN) e Mizutani Foundation per Glycoscience (grant #110071 a HJN) e sono grato a Tom V. Lee per discussioni e suggerimenti sui saggi e Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine e la Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) per plasmidi e linee cellulari.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BioWhittaker Schneider' s Drosophila medium,Lonza04-351Q
HyClone Penicillina-Streptomicina 100X soluzioneGE Healthcare lifescience 
CELLSTAR piastra a 6 pozzettiGreiner Bio-One657 160
CELLSTAR piastra a 24 pozzettiGreiner Bio-One662160
VWR mini shakerMarshell Sceintific12520-956
EmocitometroFisher Sceintific 267110
Reagente di trasfezione FuGENE HDPromegaE2311
Kit di trascrizione MEGAscrip T7AmbionAM1334
Quick-RNA MiniPrep (kit di purificazione dell'RNA)Zymo ResearchR1054
VistaVision Microscopio invertitoVWR
9MP USB2.0 Fotocamera digitale + Software avanzatoAmScopeMU-900Acquisizione delle immagini utilizzando il software ToupView
Kit di estrazione rapida del gel PureLinkInvitrogenK210012
Siero fetale bovinoGenDepotF0600-050
MetotrexatoSigma-AldrichA6770-10
Igromicina BInvitrogenHY068-L6
Solfato di rameMacron Fine Chemicals4448-02
Cellule S2InvitrogenR69007
S2-SerrateTom celluleRegalo di R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
Cellule S2-DeltaDGRC152
Celle S2-NotchDGRC154
vettore pMT-DeltaDGRC1021Dono di S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrato vettorialeRegalo di Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vettorialeDGRC1022Dono di S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFPDono di Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step KitBiosistema applicato1611091
TaqMan Saggio di espressione genica per CG9996 (Shams)Biosistema applicatoDm02144576_g1 con colorante FAM-MGB
Saggio di espressione genica TaqMan per CG7939 (RpL32)Applied BiosystemDm02151827_g1con colorante FAM-MGB
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR SystemApplied Biosystem4351405Modulo a blocchi a 96 pozzetti
modificata SV30010

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547(2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723(2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Segnalazione di NotchSaggio di aggregazione cellulareTrans attivazioneCis inibizioneCellule S2 di DrosophilaConteggio con emocitometroAgitatore orbitaleMicroscopio composto invertitoRNA a doppio filamentoInduzione con solfato di rame

Articoli correlati