Complessità dei sistemi in vivo rende difficile distinguere tra l'attivazione e l'inibizione del recettore Notch di trans- e cis-ligandi, rispettivamente. Qui, presentiamo un protocollo basato su in vitro saggi l'aggregazione delle cellule per la valutazione qualitativa e semiquantitativa del legame di Drosophila tacca alla trans-ligandi vs cis-ligandi.
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Articolo metodologico
Cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tacca di segnalazione è un sistema di comunicazione cellula-cellula evolutivamente conservati utilizzato largamente in sviluppo degli animali e manutenzione dell'adulto. Interazione del recettore Notch con ligandi da cellule vicine induce l'attivazione del pathway di segnalazione (trans-attivazione), mentre l'interazione con ligandi dalla stessa cellula inibisce la segnalazione (cis-inibizione). Giusto equilibrio tra trans-attivazione e cis-inibizione aiuta a stabilire i livelli ottimali di tacca di segnalazione in alcuni contesti durante lo sviluppo degli animali. A causa dei domini di espressione sovrapposti di tacca ed i suoi ligandi in molti tipi cellulari e l'esistenza di meccanismi di feedback, studiando gli effetti di una determinata modifica alberino-translational su trans- versus cis-interazioni della tacca e suoi ligandi in vivo è difficile. Qui, descriviamo un protocollo per l'utilizzo della drosofila S2 cellule nelle analisi di aggregazione cellulare per valutare gli effetti di abbattere un modificatore di pathway di Notch nell'associazione della tacca ogni legante in trans e cis. S2 cellule stabilmente o transitoriamente trasfettate con un vettore che esprimono Notch sono mescolate con le cellule che esprimono ogni ligando Notch (S2-Delta o S2-dentellato). Trans-associazione tra i recettori e ligandi provoca la formazione di aggregati cellulari eterotipiche e viene misurata in termini di numero di aggregati / mL composto > 6 celle. Per esaminare l'effetto inibitorio di cis-ligandi, S2 cellule cheesprimono tacca e ogni ligando sono mescolate con le cellule S2-Delta o S2-dentellato e il numero degli aggregati è quantificato come descritto sopra. La relativa diminuzione del numero degli aggregati per la presenza di cis-ligandi fornisce una misura della cis-ligando-mediato l'inibizione di trans-associazione. Queste analisi semplice sugli effetti delle manipolazioni genetiche o farmacologici sull'associazione della tacca per suoi ligandi in grado di fornire dati semi-quantitativi e possono aiutare a decifrare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di tali manipolazioni sulla tacca di segnalazione.
Introduzione
Canonico tacca di segnalazione è un meccanismo di comunicazione tra cellule a corto raggio che richiede il contatto fisico delle cellule per facilitare l'interazione tra recettori Notch e loro ligandi1vicine. Interazione del recettore Notch (presente sulla superficie delle cellule di segnale di ricezione) con ligandi (presenti sulla superficie di invio di segnale celle) avvia la tacca di segnalazione ed è conosciuta come trans-attivazione2. D'altra parte, l'interazione tra tacca ed i suoi ligandi nella stessa cella conduce all'inibizione del pathway Notch ed è conosciuta come cis-inibizione
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Protocollo
1. preparazione del doppio incagliato RNA (dsRNA) per atterramento di Shams
- Amplificazione di PCR dei prodotti
- È possibile utilizzare il DNA genomico di selvaggio-tipo bianco giallo (y w) e pAc5.1-EGFP come modello e le seguenti coppie di primer per amplificare i frammenti di DNA utilizzati nella sintesi di dsRNA. Utilizzare il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 30 s), ricottura (58 ° C, 30 s) ed estensione (72 ° C, 1 min).
Migliorata la proteina fluorescente verde (EGFP) dsRNA primer (5' - 3')-
Forward primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAG....
- È possibile utilizzare il DNA genomico di selvaggio-tipo bianco giallo (y w) e pAc5.1-EGFP come modello e le seguenti coppie di primer per amplificare i frammenti di DNA utilizzati nella sintesi di dsRNA. Utilizzare il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 30 s), ricottura (58 ° C, 30 s) ed estensione (72 ° C, 1 min).
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Risultati
Le nostre osservazioni in vivo hanno suggerito che la perdita dei risultati di shams xylosyltransferase gene in guadagno di tacca di segnalazione causa di aumentata Delta-mediata trans-attivazione di tacca senza intaccare il cis-inibizione di Tacca di ligandi8. Per testare questo concetto, sono state eseguite analisi di aggregazione in vitro delle cellule. In primo luogo, shams espressione in cellule S2 è stato .......
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Discussione
Canonico tacca di segnalazione dipende le interazioni tra il recettore Notch e i suoi ligandi5. Anche se la maggior parte degli studi sul pathway di Notch considera principalmente l'associazione della tacca e ligandi in cellule vicine (trans), Notch e leganti delle stesse cellule interagiscono e questi cosiddetti cis-interazioni possono giocare un ruolo inibitorio nella tacca segnalazione di3,4. Di conseguenza, a decifrar.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono supporto da NIH/NIGMS (R01GM084135 a HJN) e Mizutani Foundation per Glycoscience (grant #110071 a HJN) e sono grato a Tom V. Lee per discussioni e suggerimenti sui saggi e Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine e la Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) per plasmidi e linee cellulari.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BioWhittaker Schneider' s Drosophila medium, | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillina-Streptomicina 100X soluzione | GE Healthcare lifescience | ||
| CELLSTAR piastra a 6 pozzetti | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR piastra a 24 pozzetti | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Emocitometro | Fisher Sceintific | 267110 | |
| Reagente di trasfezione FuGENE HD | Promega | E2311 | |
| Kit di trascrizione MEGAscrip T7 | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (kit di purificazione dell'RNA) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Microscopio invertito | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Fotocamera digitale + Software avanzato | AmScope | MU-900 | Acquisizione delle immagini utilizzando il software ToupView |
| Kit di estrazione rapida del gel PureLink | Invitrogen | K210012 | |
| Siero fetale bovino | GenDepot | F0600-050 | |
| Metotrexato | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Igromicina B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Solfato di rame | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| Cellule S2 | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cellule | Regalo di R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| Cellule S2-Delta | DGRC | 152 | |
| Celle S2-Notch | DGRC | 154 | |
| vettore pMT-Delta | DGRC | 1021 | Dono di S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrato vettoriale | Regalo di Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vettoriale | DGRC | 1022 | Dono di S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Dono di Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Biosistema applicato | 1611091 | |
| TaqMan Saggio di espressione genica per CG9996 (Shams) | Biosistema applicato | Dm02144576_g1 | con colorante FAM-MGB |
| Saggio di espressione genica TaqMan per CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | con colorante FAM-MGB |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | 4351405 | Modulo a blocchi a 96 pozzetti |
Riferimenti
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E.
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Ristampe e permessi
