Cardiaca matrice extracellulare (ECM) è una complessa rete di molecole che orchestrano processi chiave in tessuti e organi pur sopportando fisiologico rimodellamento per tutta la vita. Decellularizzazione standardizzata dei cuori fetali ed adulti permette studi comparativi sperimentali di entrambi i tessuti in un contesto 3D mediante l’acquisizione di architettura nativa e proprietà biomeccaniche.
Conoscenze attuali della matrice extracellulare (ECM)-comunicazione cellulare si traduce in studi di grande bidimensionale (2D) coltura in vitro dove componenti dell’ECM sono presentati come un rivestimento superficiale. Questi sistemi di cultura costituiscano una semplificazione della natura complessa del tessuto ECM che racchiude la composizione biochimica, struttura e proprietà meccaniche. Per meglio emulare la comunicazione ECM-cellula che modella il microambiente cardiaco, abbiamo sviluppato un protocollo che consente di decellularizzazione del cuore intero fetale e tessuto adulto ventricolo sinistro espianti simultaneamente per studi comparativi. Il protocollo combina l’uso di un buffer ipotonico, un detergente di proprietà di tensioattivo anionico e trattamento della dnasi senza alcun requisito per competenze specialistiche o attrezzature. L’applicazione della stessa strategia di decellularizzazione attraverso campioni di tessuto da soggetti di età diverse è un approccio alternativo per eseguire studi comparativi. Il presente protocollo permette l’identificazione delle differenze strutturali uniche attraverso fetali ed adulte cardiaco ECM mesh e biologico delle risposte cellulari. Inoltre, la presente metodologia viene illustrata un’applicazione più ampia essere applicata con successo in altri tessuti e specie con piccoli aggiustamenti, come ad esempio nelle biopsie dell’intestino umane e polmone del topo.
La matrice extracellulare (ECM) è una rete dinamica di molecole che regolano importanti processi cellulari, vale a dire destino-decisione, proliferazione e differenziazione di1,2. L’indagine sulle interazioni cellula-ECM è stata eseguita principalmente in bidimensionale (2D) in vitro culture rivestito con componenti della MEC, che costituiscono una semplificazione di nativo ECM oggetti trovati in vivo. Decellularizzazione genera acellulare 3D-come ECM bioscaffolds che conservano in gran parte l’architettura extracellulare e la composizione dei tessuti e organi3,4. Oltre a servire come scaffold bioattivi per ingegneria tissutale, decellularizzati biomateriali di ECM 3D stanno emergendo come romanzo piattaforme per valutare la biologia delle cellule-ECM quello parallelo dell’ambiente in vivo.
Valutazione del ruolo del differenziale dei componenti ECM di diversi tessuti, organi ed età potranno beneficiare con l’uso di protocolli simili di generare bioscaffolds nativo. Nel cuore, abbiamo sviluppato un protocollo versatile per decellularizzazione di campioni fetali e adulto-derivati, come metodo alternativo per eseguire studi comparativi del microambiente dell’organo. Utilizzando questa metodologia, abbiamo catturato il microambiente cardiaco nativo e ha mostrato che l’ECM fetale promuove rendimenti più elevati di ripopolazione di cellule cardiache5. Decellularizzazione fornito ulteriormente l’identificazione delle differenze strutturali residente tra ECM fetali ed adulti al livello del seminterrato lamina e pericellulari arrangiamento di maglia matrice e fibra composizione5. Prima di iniziare questo lavoro, confronto testa a testa dei tessuti nelle diverse fasi ontogenic utilizzando lo stesso approccio di decellularizzazione è stata segnalata solo per roditori cuori e reni di scimmia rhesus. Inoltre, un numero limitato di studi segnala tessuto/organo fetale decellularizzazione per sé5,6,7. Questo è stato realizzato usando SDS come agente unico decellularizzati; Tuttavia, le concentrazioni di SDS distinte sono state utilizzate per decellularizzazione di tessuto cardiaco fetali ed adulti7,8. SDS è uno dei più efficaci detergenti ionici per lo sdoganamento di citoplasmatici e nucleari e ampiamente usato in decellularizzazione di diversi tessuti e campioni9,10. Soluzioni contenenti alte concentrazioni di SDS e lunghi periodi di esposizione sono stati correlati con denaturazione proteica, perdita di glicosaminoglicani (gag) e la rottura del collagene fibrille10,11e quindi un equilibrio tra rimozione di conservazione e delle cellule di ECM è necessario. Per applicare la stessa procedura al tessuto del cuore fetale e adulto, il protocollo descritto nel presente documento è diviso in tre fasi sequenziali: lisi della cellula da shock osmotico (tampone ipotonico); solubilizzazione delle interazioni lipido-proteina, DNA-proteina e proteina-proteina (0,2% SDS); e rimozione di materiale nucleare (trattamento della dnasi).
Nostro protocollo presenta diversi vantaggi: i) la possibilità di decellularizzazione equivalente di età-specifici tessuti cardiaci applicando la stessa strategia di decellularizzazione; II) nessun requisito per metodi specializzati o attrezzature; III) pronto adattamento ad altri tessuti e specie come è stato applicato con successo con alterazioni minori in biopsie dell’intestino umano12 e mouse polmone13; e, soprattutto, iv) può indirizzare le proprietà biomeccaniche ECM consentendo il montaggio di colture organotipiche di tipo 3D che più strettamente imitare le caratteristiche molecolari del microambiente tissutale nativa.
La matrice extracellulare (ECM) è un reticolo altamente dinamico e complesso delle glicoproteine fibrose e adesivi, costituito da un serbatoio di numerosi peptidi bioattivi e fattori di crescita intrappolati. Come il modulatore principale di adesione delle cellule, dinamica del citoscheletro, motilità/migrazione, proliferazione, differenziazione e apoptosi, ECM regola attivamente comportamento e funzione cellulare. Sapendo che il comportamento cellulare è diverso nelle culture 2D e 3D, ci sono stati gli sforzi per svi…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori sono in debito con tutti i membri del laboratorio di Pinto–Ó per discussione critica pertinente. Questo lavoro è stato supportato da MIT-Fundação Programa para Ciência e Tecnologia (FCT) nell’ambito del progetto “CARDIOSTEM-Engineered tessuti cardiaci e terapie basate sulle cellule staminali per applicazioni cardiovascolari” (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.c.s. è un destinatario di una borsa di studio FCT [SFRH/BD/88780/2012] e M.J.O. è un collega di FCT (FCT-investigatore 2012).
Equipment | |||
Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
Fluorimeter | – | – | Equipment available |
Digital weight scale | – | – | Equipment available |
Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
Microtome | – | – | Equipment available |
Cirurgical Instruments | |||
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
Materials | |||
24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
Eppendorff | – | – | Material available |
15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
Tissue cryopreservation | |||
Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
Dry ice | – | – | – |
Decellularization | |||
NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
Deionized water (DI water) | – | – | – |
Histology | |||
10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
Deionized water (DI water) | – | – | – |
Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
Kits | |||
PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
Cell culture | |||
DPBS | VWR | 45000-434 | – |
Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |