Articolo metodologico

Un modello murino preclinico di Osteosarcoma per definire la comunicazione mediata della vescicola extracellulare tra tumore e cellule staminali mesenchimali

DOI:

10.3791/56932

⸱

6 maggio 2018

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Iniezione diretta di cancro-derivato di vescicole extracellulari (SVE) conduce alla riprogrammazione del midollo osseo, sostenendo la progressione del tumore; Tuttavia, le celle che mediano questo effetto è poco chiaro. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare EV-mediata di cellule staminali tumorali mesenchimali (MSC) interazioni in vivo, rivelando un ruolo cruciale per MSCs EV-educato in metastasi.

Abstract

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All'interno del microambiente tumorale, residente o reclutate cellule staminali mesenchimali (MSCs) contribuire alla progressione maligna in diversi tipi di cancro. Sotto l'influenza di specifici segnali ambientali, queste cellule staminali adulte possono rilasciare mediatori paracrini che conduce alla crescita accelerata del tumore e metastasi. Definire il crosstalk tra tumore e MSCs è di primaria importanza per comprendere i meccanismi alla base di progressione del cancro e identificare nuovi bersagli per interventi terapeutici.

Le cellule tumorali producono elevate quantità di vescicole extracellulari (EVs), che possono influire profondamente sul comportamento delle cellule bersaglio nel microambiente tumorale o ai luoghi distanti. Tumore EVs racchiudere biomolecole funzionali, tra cui infiammatoria RNA e proteine (onco), che possono educare le cellule stromal per migliorare il comportamento metastatico delle cellule tumorali o per partecipare alla formazione di nicchia pre-metastatico. In questo articolo, descriviamo lo sviluppo di un modello murino di cancro preclinica che consente la valutazione specifica del crosstalk EV-mediata tra tumore e cellule staminali mesenchimali. In primo luogo, descriviamo la purificazione e la caratterizzazione del tumore-secreto SVE e alla valutazione di interiorizzazione EV di MSCs. Quindi facciamo uso di un immunodosaggio basato su perlina multiplex per valutare l'alterazione del profilo di espressione di citochina MSC indotta da cancro EVs. Infine, ci illustrano la generazione di un modello murino di xenotrapianto bioluminescenti ortotopico di osteosarcoma che ricapitola l'interazione tumore-MSC e mostrare il contributo delle MSC EV-educato a formazione di crescita e la metastasi del tumore.

Il nostro modello offre l'opportunità di definire come cancro EVs forma un ambiente di supporto di tumore e per valutare se il blocco della comunicazione fra il tumore e MSCs EV-mediato previene la progressione del cancro.

Introduzione

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Il microambiente tumorale partecipa attivamente in maggior parte, se non tutti, gli aspetti della progressione nella tumorigenesi e cancro, tra cui la formazione di metastasi e lo sviluppo della resistenza alla terapia1. Questo sottolinea la necessità di modelli murini di cancro preclinica orthotopic che consentono la dissezione delle interazioni tumore-stroma complesse che si verificano nella nicchia del tumore.

Tra i molti componenti cellulari del microambiente tumorale, cellule staminali mesenchimali (MSCs) contribuiscono fortemente alla progressione tumorale in diversi tipi di cancro come cancro al seno, cancro della prostata, i tumori cerebrali, mieloma multiplo e l'osteosarcoma2 ,3,4,5,6,7. MSCs sono cellule staminali multipotenti che si trovano in vari tessuti adulti e fetali, compreso il midollo osseo, il tessuto adiposo, placenta, sangue del cordone ombelicale e gli altri8,9. In risposta a segnali infiammatori generati dal cancro, MSCs migrare verso siti tumorali, incorporare nel microambiente tumorale e, in definitiva, differenziarsi in supporto di cancro cellule10. Questi MSCs cancro-collegati forniscono fattori essenziali (cioè, i fattori di crescita, chemochine, citochine e mediatori immunosoppressivi) per la progressione del tumore, che agiscono sia sulle cellule del tumore e lo stroma circostante2, 3 , 11 , 12 , 13. mentre gli effetti dipromozione di MSCs cancro-collegati sono stati studiati nei numerosi modelli di cancro, i meccanismi da cui le cellule del tumore riprogrammare MSCs per modellare una nicchia dipromozione sono capiti male. Qui descriviamo la generazione di un modello di xenotrapianto ortotopico che consente in particolare lo studio dell'interazione pro-cancerogeno tra cellule tumorali dell'osso e MSCs tramite vescicole extracellulari (EVs).

SVE sono mediatori cruciali della comunicazione intercellulare tra tumore e cellule stromali14. SVE trasportano biomolecole funzionale della cellula di origine, tra cui proteine, lipidi e RNA regolatori. Una volta rilasciato nello spazio extracellulare, queste vescicole possono essere preso dalle cellule circostanti o trasportato ai luoghi distanti tramite il sangue o la circolazione linfatica e possono influenzare profondamente il comportamento della cella di destinazione. 15 , 16 , 17 per esempio, l'assorbimento di cancro EVs dai fibroblasti stromal può provocare nella differenziazione dei miofibroblasti sostenendo l'angiogenesi e accelerando tumore crescita in vivo18,19, interiorizzazione di endoteliale cellule in grado di stimolare l'angiogenesi del tumore e aumentare la permeabilità vascolare16,20, e l'interazione con le cellule immunitarie potrebbe portare alla soppressione della risposta immunitaria antitumorale21.

Recentemente abbiamo dimostrato, utilizzando un modello murino di xenotrapianto bioluminescenti ortotopico di osteosarcoma, che le cellule del tumore rilasciano elevate quantità di EVs che richiedono MSCs per acquisire un fenotipo pro-cancerogena e pro-metastatico. Questo effetto è dovuto ad un drammatico cambiamento nel profilo di espressione di citochina MSC (denominato "Formazione MSC") e può essere prevenuto con la somministrazione di un anticorpo di terapeutico del ricevitore interleukin-6 (IL-6R)7. Nostro lavoro ha dimostrato che il cancro SVE sono cruciali nella modulazione del comportamento MSC, così fornendo una spiegazione razionale per approcci mirati microambiente per fermare la progressione di osteosarcoma. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare l'interazione tumore-MSC EV-mediata in vivo. Questo modello è destinato a: 1) in particolare definire le alterazioni di EV-indotta di cancro di comportamento MSC nel microambiente tumorale, 2) valutare come questa interazione contribuisce alla crescita del tumore dell'osso e la formazione di metastasi e 3) Studio se interferiscono con la diafonia EV-mediata in vivo impedisce la progressione del cancro.

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Protocollo

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Adiposo umano per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali sono state ottenute dal reparto di chirurgia plastica dell'ospedale Tergooi (Hilversum, Paesi Bassi) dopo l'approvazione dal comitato etico istituzionale e consenso informato scritto. MSCs adiposa GFP-positivi sono stati ottenuti dal dipartimento di scienze mediche e chirurgiche per bambini e adulti (Università di Modena e Reggio Emilia).

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legge olandese sulla sperimentazione animale, e il protocollo è stato approvato dal Comitato sulla sperimentazione animale del centro medico Vrije Universiteit, Amsterdam, Paesi Bassi.

1. isolamento delle vescicole extracellulari secrete del tumore.

  1. Preparare EV-vuotati fetale del siero bovino (FBS) mediante centrifugazione FBS a 70.000 x g durante la notte (16 ore), nessun freno, a 4 ° C, utilizzando un rotore ultra-oscillante (si aspettano 1 h per decelerazione). Con attenzione e raccogliere il surnatante (EV-vuotati FBS) senza disturbare il pellet. Filtrare la FBS EV-vuotati con un filtro da 0,22 µm.
  2. Preparare EV-vuotati colturale completando Medium (IMDM per volta Dulbecco di Iscove) con 100 U/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, glutammina 2 mM (1 x P/S/G) e 5% FBS EV-vuotati.
  3. 3 x 106 143B cellule in boccette di 175 cm2 di semi e li della coltura in terreno di coltura EV-vuotati in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Quando le cellule sono 80-90% confluenti (in genere dopo 36 h a 48 h), è possibile raccogliere il surnatante da 8 x 175 cm2 boccette (28 mL/boccetta) per EV-isolamento.
  4. Pre-cancellare il surnatante delle cellule per rimuovere le cellule e detriti cellulari tramite centrifugazione differenziale (centrifugazione il surnatante dello spin precedente ogni volta) secondo il seguente protocollo:
    1. Centrifugare il surnatante due volte a 500 x g per 10 min.
    2. Centrifugare il supernatante due volte a 2000 x g per 15 min.
    3. Centrifugare il surnatante due volte a 10.000 x g per 30 min.
    4. Eseguire tutte le centrifugazioni a 4 ° C con massima accelerazione e decelerazione velocità impostazioni. Dopo ogni passaggio, è necessario raccogliere con cura il supernatante contenente EV, lasciando circa 1 mL. Procedere immediatamente per passo 1.5 o negozio pre-sgomberati condizionata medio a-80 ° C fino a EV isolamento.
  5. Isolare il server virtuale di Exchange mediante centrifugazione il medium condizionato pre-cancellato una volta a 70.000 x g per 1 h, lento freno, a 4 ° C in provette da ultra-centrifuga (volume finale 38,5 mL/tubo) utilizzando un rotore ultra oscillante.
  6. Eliminare il surnatante, lasciando circa 1 mL dietro, risospendere il pellet contenente EV nel volume restante attentamente, piscina li tutti in una provetta di ultracentrifuga e aggiungere tampone fosfato salino (PBS) fino al riempimento completo tubo (volume finale mL 38,5).
  7. Centrifugare nuovamente a 70.000 x g per 1 h a 4 ° C, senza freno (si aspettano 1 h per decelerazione). Con attenzione, rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet e dimentichi di 100-200 µ l.
  8. Risospendere il pellet di EV e regolare il volume finale a 200 µ l con PBS (standardizzato per tutti i EV-isolamenti). Utilizzare la preparazione EV immediatamente o conservare a-80 ° C fino a uso22.
    Nota: EVs possono essere conservati fino a 6 mesi a-80 ° C.

2. EV caratterizzazione.

Purificata EVs possono essere visualizzate da trasmissione microscopia elettronica (TEM)23.

  1. Preps mix EV con un volume uguale di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato.
  2. Cappotto 200 mesh griglie TEM di nichel rivestita di carbonio Formvar con 5 µ l di sospensione di EV per 20 min a temperatura ambiente.
  3. Fissare i campioni EV su griglie TEM con 1% di glutaraldeide in 0.1 M tampone fosfato (pH 7.0), contrasto con ossalato di uranile (pH 7.0) e incorporare in una miscela di 4% uranile acetato e 2% metil cellulosa in un rapporto di 1:9 su ghiaccio.
  4. Rimuovere le griglie con passanti in acciaio inox e asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro per garantire un adeguato spessore di pellicola di cellulosa di metile.
  5. Dopo l'essiccazione, esaminare le griglie con un microscopio elettronico a trasmissione e catturare immagini con una fotocamera digitale accoppiata al software di immagine corrispondente.

3. formazione delle MSC di tumore-derivato EVs.

  1. Preparare il terreno di coltura MSC completando alfa-minimo mezzo essenziale (alfa-MEM) con 4% EV-vuotati umana della piastrina Lysate (hPL)24, eparina (10 U/mL) e 1 x P/S/G.
    Nota: EV-vuotati hPL è ottenuta seguendo la procedura descritta nella sezione 1.1.
  2. Seme 1.4 x 106 adiposo-derivate MSCs per fiaschetta di 75 cm2 e loro la cultura a EV-vuotati MSC-coltura in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
  3. Quando cellule raggiungono 70% confluenza, aggiungere 143B osteosarcoma - o controllare i fibroblasti umani (hf)-SVE, 10 µ l EV preparazione/cm2 di matraccio di cultura. Incubare per 24 ore e aggiungere la stessa quantità di EVs per ulteriori 6 ore. Nota: I fibroblasti umani sono coltivati in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) 10% FBS e SVE sono isolati come descritto nella sezione 1.
  4. Raccogliere il surnatante MSC, centrifugare 1x a 500 x g per 5 min a 4 ° C (con massima accelerazione e decelerazione velocità impostazioni), trasferire in una nuova provetta e conservare il supernatante eliminato a-80 ° C per attivare l'analisi del futuro citochina (sezione 5).
  5. Per in vivo esperimenti (sezione 6), educare GFP-positive MSCs25 come descritto nelle sezioni 3.1 a 3.3, raccogliere le cellule e loro risospendere in PBS ad una concentrazione finale di 106 cellule per 100 µ l. cellule di tenere il ghiaccio fino a iniezione.

4. EV interiorizzazione Assay.

Per visualizzare l'assorbimento EV di MSCs, etichetta SVE con un colorante fluorescente verde del linker (GFLD) (disponibile in commercio) seguendo il protocollo del produttore:

  1. Brevemente, aggiungere 180 µ l di diluente per la preparazione di EV 200 µ l. Diluire 1 µ l di colorante GFLD in 50 µ l di diluente e aggiungere 20 µ l di colorante diluito il prep EV diluito.
  2. Delicatamente mescolare pipettando e incubare per 3 min a temperatura ambiente al buio.
  3. Aggiungere 5 mL di 0,1% BSA in PBS, trasferimento a ultra-provette e riempire il tubo con PBS (volume finale 38,5 mL/tubo).
  4. Centrifugare 1 x a 70.000 x g per 1 h a 4 ° C, senza freno (si aspettano 1 h per decelerazione). Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il EV-pellet con etichettato in un volume finale di 200 µ l (regolazione del volume con PBS).
  5. Aggiungere il servizio volontario europeo con etichettato alla cultura MSC, e conservare a-80 ° C. Dopo l'incubazione overnight, valutare interiorizzazione della vescicola mediante microscopia a fluorescenza e flusso cytometry7.

5. valutazione del profilo di espressione di citochina MSC.

  1. Per la quantificazione multisala di interleukin-8 (IL-8), interleuchina-1 β (IL-1 β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), fattore di necrosi tumorale (TNF) e interleukin - 12p 70 (IL - 12p70) livelli della proteina in MSC condizionata medio (Vedi punto 3.4), utilizzare un matrice di perlina cytometric commercialmente disponibile (CBA) per citochine infiammatorie umane seguendo le istruzioni del produttore.
  2. Brevemente, mescolare le perle cattura anticorpo coniugato e aggiungerli a tutte le provette. Aggiungere le diluizioni standard di citochine o i campioni medi condizionati ai tubi.
  3. Aggiungere il reagente di rivelazione e incubare per 3 ore a TA.
  4. Lavare le perle con la soluzione di lavaggio fornita. Misurare i campioni utilizzando un citometro a flusso e analizzare i dati secondo le istruzioni del produttore.

6. generazione di un modello di topo Orthotopic dello xenotrapianto di Osteosarcoma.

  1. Consentire sei-settimana-vecchio, donna, topi Athymic Nude-Foxn1nu acclimatare per almeno una settimana prima di iniziare le procedure sperimentali.
  2. Un giorno prima dell'intervento chirurgico e come analgesia peri-operatorio aggiungere paracetamolo per l'acqua potabile. Diluire "paracetamolo soluzione per bambini" (Vedi Tabella materiali) con acqua per ottenere una concentrazione finale di 2 mg/mL. Basato su un'assunzione media dell'acqua di 150 mL/kg/giorno, e un peso medio di 20 g, questa dose è sufficiente per raggiungere un dosaggio di 6 mg/mouse/giorno (300 mg/kg/giorno).
  3. Continuare il trattamento analgesico fino a 24 ore dopo l'operazione, o più se gli animali mostrano segni di dolore.
  4. Il giorno della procedura chirurgica, raccogliere cellule coltivate di luciferasi-positivi (Fluc) 143 ter (precedentemente generate attraverso la trasduzione lentivirale) mediante centrifugazione a 300 x g per 10 min e risospendere le cellule ad una concentrazione di 2 x 105 cellule / µ l di PBS. Tenere la sospensione cellulare su ghiaccio fino a 6 ore.
  5. Apparecchiature chirurgiche di autoclave. Preparare e pulire l'area di lavoro e inserire le forbici sterilizzate e pinzette sterili fogli. Venti minuti prima che la procedura chirurgica (passo 6,8), iniettare gli animali per via sottocutanea con buprenorfina (0,05 mg/kg, diluito in soluzione fisiologica allo 0,9%) come analgesico utilizzando siringhe da insulina 0,5 mL (ago 29-gauge).
  6. Poco prima anestetizzando ogni animale, riempire una siringa 10 µ l con almeno 1 µ l della sospensione delle cellule (Fluc) 143B concentrata (Vedi punto 6.4).
  7. Anestetizzare l'animale con anestesia inalazione isoflurane (2-3% di ossigeno). Controllare il livello dell'anestesia di punta-pizzicare l'animale. Quando l'animale non reagisce ad i pizzicotti, cioè, che esso è profondamente anestetizzato, applicare unguento per gli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  8. Posizionare l'animale sul dorso con la testa in una mascherina dell'anestesia e con le gambe verso l'operatore. Flettere il ginocchio sinistro. Pulire la pelle con etanolo al 70% e applicare lidocaina (2%) con una punta di cotone 3 volte come analgesico locale.
  9. Utilizzare un coltello chirurgico sterile per praticare una piccola incisione (circa 5 mm) sulla pelle appena sotto il ginocchio per esporre la tibia. Praticare un foro nella tibia, circa 2 mm sotto il ginocchio con un trapano di torsione micro 0.8 mm. Fare attenzione a non forare entrambi cortecce di tibia.
  10. Iniettare il foro con un ago da 26-gauge sospensione di 1 µ l delle cellule (circa 2 x 105 cellule) lentamente (in circa 5 secondi). Chiudere il foro con una goccia di colla del tessuto per evitare il riflusso della sospensione.
  11. Chiudere la pelle con suture monofilamento e una goccia di colla del tessuto. Lasciate che il recupero degli animali in un ambiente ben riscaldato (uso una lampada di calore). Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Solo dopo che gli animali sono pienamente recuperati dall'anestesia, restituirli alle loro gabbie.
  12. Due giorni dopo l'inoculazione del tumore, iniettare EV educato o MSCs ingenuo GFP-positive (106 cellule in 100 µ l di PBS, vedi punto 3.5) per via endovenosa con una siringa da insulina 0,5 mL nella vena caudale dei topi.
  13. Seguire la crescita del tumore di bioluminescenza imaging26 due volte a settimana. A tal fine, iniettare il i.p. di topi con 150 µ l D-luciferina (30 mg/mL) con una siringa da insulina. Dieci minuti dopo l'iniezione, posizionare gli animali nella bioluminescenza sistema di imaging e misurare il flusso di fotoni generato dalle cellule del tumore.
  14. Inoltre, misurare il diametro del osso-tumore primario con una pinza. Il volume del tumore (in mm3) stima di larghezza x di lunghezza2 x 0,5.
  15. Nota: Humane endpoint sono definiti come il diametro del tumore > 15mm o perdita di peso > 15%.

7. la valutazione del numero di nodulo polmonare

  1. Quando uno degli animali raggiunge l'endpoint umano definito nel passaggio 6.14 (in circa 3-4 settimane), terminare l'esperimento e raccogliere e analizzare tutti i tessuti interessati.
  2. Dieci minuti prima euthanization, iniettare 150 µ l D-luciferina (30 mg/mL) con una siringa da insulina 0,5 mL.
  3. Anestetizzare gli animali con anestesia inalazione isoflurane (Vedi punto 6.7). Confermare la profondità dell'anestesia per l'assenza di reazioni del mouse a punta-pizzicare. Eutanasia i topi da dislocazione cervicale27.
  4. Raccogliere i polmoni, fegato, milza e reni, con pinzette e forbici sterilizzate. Lavare gli organi in PBS per rimuovere le tracce di sangue e metterli su una piastra di Petri.
  5. Posizionare la piastra di Petri con gli organi nella bioluminescenza sistema di imaging. Misurare il segnale di bioluminescenza su entrambi i lati degli organi. Immediatamente dopo la misurazione, immergere gli organi in formalina 4% di loro fissarsi (24-72 ore, a temperatura ambiente) per future analisi istologica.
  6. Elaborare le immagini ottenute con appropriato software di imaging di soglia manuale. Contare il numero di noduli polmonari su ogni immagine. Contare il numero totale dei noduli polmonari su entrambi i lati dei polmoni.

8. istologici

  1. Per l'analisi istologica del tessuto polmonare:
    1. Incorporare gli organi in formalina in paraffina e preparare i vetrini di tessuto 6 µm.
    2. Deparaffinate il tessuto polmonare diapositive ed effettuare ricupero dell'antigene, facendoli bollire per 15 minuti in tampone citrato 0.01 M (pH 6).
    3. Incubare i vetrini in posizione orizzontale a temperatura ambiente con il vimentin anti-umano dell'anticorpo (200 µ g/mL) diluito 1: 150 in anticorpo-diluente (disponibile in commercio) e successivamente con l'anticorpo secondario, HRP-etichettato (0,5 mg/mL, diluizione 1: 500). Macchiare i tessuti con 3'-diaminobenzidina (DAB) e contatore di ematossilina.
    4. Osservare i vetrini di tessuto macchiato con un microscopio ottico accoppiato alla telecamera corrispondente e immagine software.
  2. Per valutare la presenza di GFP-positive MSCs in tibie del mouse:
    1. Decalcificare le tibie in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 0,24 M, pH 7,2-7,4. Aggiornare la soluzione tampone dell'EDTA ogni giorno fino alle ossa diventano flessibili (circa 1 settimana).
    2. Disidratare tibie e infiltrarsi loro con paraffina. Incorporare le tibie (compreso osteosarcoma tessuto) in blocchi di paraffina.
    3. Utilizzare un microtomo per preparare 6 sezioni di paraffina µm. Inserire le sezioni di paraffina su vetrini. Dopo l'essiccazione, memorizzare diapositive durante la notte a temperatura ambiente.
    4. Eseguire il recupero di calore-mediata antigene utilizzando tampone citrato (Vedi 8.1.2) e macchia i tessuti con l'anticorpo anti-GFP (intero antisiero) in una diluizione di 1:900 in anticorpo-diluente. Colorante di contrasto dei tessuti con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    5. Osservare i vetrini di tessuto con un microscopio a fluorescenza accoppiato per il corrispondente software di imaging.

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Risultati

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In questo studio, abbiamo esplorato la possibilità di sve osteosarcoma-secreto di educare MSCs verso un fenotipo pro-cancerogena e pro-metastatico. Mostriamo che cellule di osteosarcoma rilasciano EVs esosomi-like che sono interiorizzati da MSCs. Abbiamo misurato l'alterazione del profilo di espressione di citochina MSC indotto da cancro EVs ed abbiamo valutato l'effetto di MSCs EV-istruiti sulla crescita del tumore e la formazione di metastasi. La rappresentazione generale del disegno de...

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Discussione

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Tumore-secreto di vescicole extracellulari (SVE) possono alterare la fisiologia delle cellule mesenchimali locali e distanti per generare un ambiente favorevole del tumore. Qui descriviamo la generazione di un modello murino preclinico di osteosarcoma che consente una dissezione delle interazioni EV-mediata tra cellule tumorali e cellule staminali mesenchimali (MSCs) in vivo. Mostriamo che iniezione sistemica del tumore umano MSCs EV-educato in topi che sopportano gli xenotrapianti osteosarcoma fortemente promuo...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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S.R. Baglio è stato sostenuto da una borsa di studio di Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) co-finanziato dall'Unione europea. Inoltre, questo progetto ha ricevuto non finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Sklodowska-Curie 660200 (al S.R. Baglio).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipment
Ultra CentrifugaBeckmanOptima L-90K
Rotore SW32TiBeckman369650Indicato nel manoscritto come rotore a secchio ultra-oscillante
Microscopio elettronico a trasmissioneZeissEM109O simile TEM
Fotocamera digitaleNikonDMX 1200FO fotocamera simile
Software di imaging TEM NikonACT-1
Microscopio a fluorescenzaZeissImager.D2O simile Microscopio a fluorescenza
Software di imaging FMZeissZEN Blue
IncubatorNuaire4750E
CentrifugaHettickROTANTA 460R-80
CongelatoreThermo electro corporationn.a.
FACSBDBD FACScaliburO citometro a flusso simile
DrillFermFCT-300Con trapano da 0,8 mm
Micro punte elicoidali HSS, 0,8 mmProxxon28 852Trapano da 0,8 mm
Telecamera IVISXenogenIvis LuminaIndicato nel manoscritto come telecamera a bioluminescenza. Xenogen fa ora parte del software di immagine Perkin Elmer
Living2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen fa ora parte di Perkin Elmer
10 µ L SiringaHamiltonNeuros Modello 1701 RN
Ago: Hamilton RN Ago per siringa, calibro 26, Pointstyle AS, lunghezza personalizzata 2 cmHamiltonn.a.Pinza
MitutoyoG08004463
AutoclaveAstelln.a.Lampada
termicaPhilipsn.a.
Culture media
Fetale Siero BovinoHycloneRYG35912
Platelet Lysaten.a.n.a.IMDM
mediumLonzaBE12-722F
alpha-MEM mediumLonzaBE02-002F
DMEM mediumLonzaBE12-614F
pen/streptococco/glutamminaGIBCO10378-016
eparinaLEO012866-08
Tripsina/EDTA (10x)GIBCO15400-054
Cellule
adiposa deriverd MSCs
MSCs
umanin.a.n.a.
Celle 143BATCCCRL-8303
Celle FLUC-143BATCCCRL-8303Trasdotte
Monouso
Staffe di coltura 175 cm2CELLSTAR660175
Provette da 50 mLGreiner bio-one210261
Provette per congelamento377224 termoscientifico
Provette ultratrasparentiBeckman344058Indicato nel manoscritto come provette ultra-centrifughe
0,22 µ m filtroMillex SLGV033RS
200 mesh Formvar-carbon-coated nickel griglieEMS (Electron Microscopy Sciences)
Siringhe da insulina da 0,5 mL con ago da 29GTerumoU-100 
Piastra PetriSigma - AldrichP7612
Carta da filtroThermo fisher Scientific50363215
Reagenti / kit
paraformaldeideAlfa Aeser43368.9M
PBSBraun220/12257974/110
glutaraldeideEMS (Scienze della microscopia elettronica)16300
ossalato di uranileEMS (Microscopia elettronica Scienze)22510
acetato di uranioEMS (Scienze della microscopia elettronica)22400
metilcellulosaEMS (Scienze della microscopia elettronica)1560
PKH67Sigmamini67-1ktIndicato nel manoscritto come GFLD
BSASigmaA8412
CBA - kit di citochine infiammatorie umaneBD551811
Formaldeide 37%VWR104003100
Lame chirurgiche in acciaio al carbonioSwann-Morton206Indicato nel manoscritto come coltello chirurgico
anticorpo anti-vimentina umanaSanta Cruzsc-6260Clone V9
Diluente anticorpaleDAKOS0809
Anticorpo IgG di topo marcato con HRPTecnologie per la vita32230
DAB-kit DAKOK500711
ematossillinaSigmaGHS232
EDTA-buffern.a.n.a.Tampone
citraton.a.n.a.rabbit
policlonale anticorpo anti-GFPAbcamn.a.Ab290
DAPI Life TechnologiesD1306
Paracetamolo, 120 mg / 5 ml sciroppoBayern.a.Sinaspril, soluzione di paracetamolo per bambini
Isoflurano 1000 mg/gVumc farmacian.a.buprenofina
cloridrato, 0,3 mg/mlIndivior UK Limited
2%Vumc farmacian.a.70
% etanoloVWR93003.1006
Colla tissutaleDerma+Flex, formulata cianoacrilato medicoVygonLB604060
Collirio: Vidisec Carbogel, 2 mg/mlBausch+Lombn.a.D-luciferina
, sale di potassioGold BiotechnologyLUCK-1
VetriniThermo scientific630-0954
Anelli in acciaio inossidabile n.a.n.a.
Esperimenti sui topi
Topi, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,  femmina, 6 settimane all'arrivo, stato batterico conforme FELASAENVIGOn.a.Paper-pulp
smart home (arricchimento della gabbia)Bio Servicesn.a.Alpha-dri
materiale da lettieraShepperd Speciality Papersn.a.
Cibo per topi: Teklad global 18% protein dieta per roditoriENVIGO2918-11416M
SutureEthiconV926H
ForbiciSigma-AldrichS3146-1EA(o simile)
PinzettaSigma-AldrichF4142-1EA(o simile)
n.a.n.a.GFP-positive n.a.n.a.fiblasti n.a.lidocaina-HCL

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
  3. Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795(2013).
  4. Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
  5. Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
  6. Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
  7. Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
  8. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  9. Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
  10. Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31(2017).
  11. Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
  12. Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
  13. Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
  14. Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  15. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  16. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  17. Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
  18. Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
  19. Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
  20. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
  21. Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
  22. Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
  23. Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127(2015).
  24. Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
  25. Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
  26. Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
  27. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  28. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  29. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  30. Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
  31. Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
  32. Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
  33. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  34. Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).

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