Caratterizzazione delle cellule del tumore usando un filo medico per l'acquisizione di cellule tumorali circolanti: un approccio 3D basato sul DNA pesce e immunofluorescenza

CTCs rappresentano un passo fondamentale della diffusione di cancro delle cellule¹. La loro presenza nel sangue periferico dei pazienti è associato (metastatico) ricaduta e malattia progressione^2,3. CTC isolamento e caratterizzazione dal sangue dei malati di cancro è un tipo di biopsia liquida non invasivo. Negli ultimi anni, è diventato sempre più evidente che il monitoraggio la progressione e la risposta dei tumori ai diversi trattamenti utilizzando questo tipo di analisi fornisce importanti informazioni cliniche^4,5. Biopsia liquida è ancora più utile quando la chirurgia non è fattibile o quando il tessuto del tumore primario non è disponibile, ovvero, per le lesioni non-biopsiable. Quindi, questo approccio è promettente in ambienti specifici del cancro come NSCLC metastatico, dove la presenza di CTCs ha dimostrata di avere un ruolo prognostico negativo⁶. NSCLC è un tumore che beneficia soprattutto di approcci terapeutici mirati^7,8,9 progettato per agire su molecole specifiche (bersagli molecolari), note per essere coinvolti nella crescita, progressione, e diffusione della malattia. Quindi, è necessaria l'individuazione di obiettivi specifici durante la progressione di malattia. Indagine di CTC è un approccio diagnostico estremamente interessante per rilevare e monitorare gli obiettivi della droga senza la necessità di tessuti primari o metastatici. Ad esempio, la rilevazione degli spostamenti di gene ALK in cellule di NSCLC è associata con la sensibilità a crizotinib, una terapia mirata specifica¹⁰. Tuttavia, allo stato attuale, il rilevamento degli spostamenti di ALK è eseguito solo su fine-ago aspira o piccole biopsie; di conseguenza, senza un tumore tessuto analisi ALK non è possibile. CTCs sono un'alternativa potenziale al tumore indagini tissutali e rappresentano un promettente approccio diagnostico compagno.

Nonostante la loro importanza potenziale, CTCs è ancora un argomento di grande dibattito tra ricerca, principalmente a causa della loro rarità (1-10 cellule/mL di sangue periferico¹¹). Attuali metodi di biopsia liquida utilizzano una quantità limitata di sangue (cioè, 1-30 mL)^12,13, ma questo crea una situazione di sensibilità non ottimale per la rilevazione di CTCs. da qui, interrelati all'individuazione approcci e sviluppando dispositivi per eseguire biopsie liquide CTC-mirati su un volume maggiore di sangue periferico.

Un dispositivo alternativo, un filo medico funzionalizzato (Vedi Tabella materiali), è stato sviluppato per superare i limiti di prelievo di sangue e ottenere un'analisi più rappresentativa di CTCs. Questo filo funzionalizzato è un dispositivo medico CE-approvato che cattura CTCs direttamente dal flusso sanguigno di cancro pazienti¹. Esso è composto da un filo d'acciaio di 16 cm di lunghezza (Figura 1a) con una punta di 2 cm lungo funzionalizzata rivestita con uno strato di 0,2 µm-spessore d'oro. Lo strato è a sua volta coperte da uno strato di idrogel di 1 a 5 µm di spessore policarbossilato covalentemente accoppiato con anticorpi diretti contro il EpCAM, uno degli antigeni più ampiamente espressi sulla superficie del CTCs¹⁴. Il funzionalizzati punta del filo viene introdotto in una vena del braccio del paziente e rimane in posizione per almeno 30 min. Questo approccio consente l'isolamento del CTCs in vivo direttamente nel sangue periferico e alla schermata circa 1.5-3.0 L di sangue (circa 300-fold più che il volume utilizzato per approcci alternativi)¹.

Pantel et al. dimostrato l'efficacia di questo approccio nell'isolare CTCs direttamente nelle vene braccio del polmone cancro pazienti¹⁵. Si sono esibiti filo immunofluorescenza che macchia per identificare CTCs utilizzando convenzionali anticorpi diretti contro EpCAM e vaschetta-cytokeratin e CD45 per il rilevamento del leucocita. Il filo è stato esaminato sotto un microscopio di fluorescenza ottica¹⁵. Gli autori hanno dimostrato che il dispositivo è stato in grado di isolare CTCs, ma essi non indagare tutti gli obiettivi della terapia-relativa, quali gli spostamenti di ALK.

Il metodo proposto mira a identificare putativi CTCs in linee cellulari di NSCLC in base a parametri fenotipici, ad es., EpCAM positività e la presenza di biomarcatori molecolari, per esempio lo stato ALK (Figura 1b). Questa procedura 3-giorno-lungo combina un filo funzionalizzato e immunofluorescenza che macchia con DNA di fluorescenzain situ-ibridazione (DNA FISH), denominato Immuno-DNA-FISH. Dato che CTCs sono entità rare, il vantaggio di questo protocollo è che possono essere caratterizzate CTCs sullo stesso filo in termini di caratteristiche immunophenotypic e riorganizzazioni del DNA.

1. Immuno-DNA pesce su un vetrino coprioggetti 2D

1. Vetrino coprioggetti semina cellulare preparazione e aderente
   Nota: Eseguire tutti i passaggi seguenti sotto una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
   1. Immergere il vetrino coprioggetto in etanolo 100% disinfettarli.
      Nota: Usiamo 12 mm × 12 mm supportata in silicone quadrato coprioggetti (tutti i reagenti sono elencati nella Tabella materiali).
   2. Posizionare i vetrini coprioggetti in una capsula Petri (diametro 100 mm). Utilizzando secco costretto flusso d'aria per 5 min.
   3. Lavare la capsula di Petri con fosfato di 15 mL sterile 1 × Dulbecco tampone salino (PBS).
   4. Lavare la capsula di Petri con 10 mL di terreno completo (Vedi tabella 1).
   5. Le cellule aderenti del seme (circa 1.650.000 celle in 10 mL di terreno, contate mediante analisi Citofluorimetrica) facendo cadere delicatamente la sospensione cellulare sul piatto Petri per ottenere placcatura cellulare uniforme (circa 30.000 cellule/cm²).
      Nota: Per ~ 70% confluenza, aderente, le cellule devono essere coltivate sulle lamelle per almeno 48 h.
2. Fissazione e permeabilizzazione
   Attenzione: L'Acetone è un infiammabile e irritante sostanza volatile. Utilizzare solo resistente all'acetone plastica o contenitori di vetro (senza PVC o PVDF).
   Nota: Eseguire questi passaggi sotto una cappa chimica.
   1. Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una pipetta monouso da aspirante.
   2. Lavare la capsula di Petri con 1 × PBS.
   3. Con una pinzetta, lavare i vetrini coprioggetti immergendoli in un becher di vetro contenente 5 mL di PBS di 1 ×.
   4. Asciugare i vetrini coprioggetti su carta assorbente.
   5. Fissare le cellule il coprivetrino immergendolo in una soluzione di acetone 100% per 10 min a temperatura ambiente (TA).
   6. Pinzette per rimuovere il vetrino coprioggetti. Asciugare il vetrino coprioggetto utilizzando un flusso di aria forzata per 5 min.
      Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto. Il coprioggetto deve essere conservato a-20 ° C.
3. 1 ° giorno di immunofluorescenza
   Nota: Questa fase comporta un'incubazione (O/N) durante la notte (~ 16 h).
   1. Lavare i vetrini coprioggetti in 1X PBS due volte.
   2. Goccia di 100 µ l di tampone di diluizione dell'anticorpo (Vedi tabella 1 per i dettagli) sul coprioggetto ed incubare per 30 minuti a TA.
      Nota: Il volume di soluzione deve essere regolata in base alla superficie del vetrino coprioggetto per coprire l'intero vetrino coprioggetti ed evitare il rischio di overflow.
   3. Preparare la miscela di anticorpo (tabella 1) utilizzando un 01:20 diluizione di anticorpo primario monoclonale coniugato con fluorocromo e anticorpo tampone di diluizione, come specificato nella scheda tecnica fornita dal produttore.
      Nota: Si consiglia vivamente di utilizzare anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromo termostabile. Se viene utilizzato un fluorocromo non termostabile, la temperatura utilizzata durante le fasi di DNA-FISH del protocollo può danneggiare il fluorocromo ed estinguere le emissioni fluorescenti. In questo protocollo, abbiamo optato per un anticorpo EpCAM-FITC (01:20 diluizione), che non ha mostrato problemi significativi con la temperatura utilizzata.
   4. Sciacquare i vetrini coprioggetti due volte in 1 × PBS.
   5. Posto in vetrini coprioggetti-lato della cellula su in un umido camera e goccia 100 µ l di anticorpo mix il coprivetrino.
      Nota: Il volume di soluzione dovrebbe essere regolato sulla base la superficie del vetrino coprioggetto per coprire l'intero vetrino coprioggetto e diminuire il rischio di overflow.
   6. Incubare O/N (~ 16 h) al buio a 4 ° C.
4. 2 ° giorno di immunofluorescenza
   1. Bloccare l'incubazione dell'anticorpo lavando i coprioggetti in 1X PBS due volte.
      Nota: Store a lamelle immerso in 100 µ l di 1 × PBS a 4 ° C in una camera con ambiente umido costante al buio fino a quando il saggio FISH è eseguito.
5. 2 ° giorno 2D DNA-FISH
   Attenzione: Devono prestare particolare attenzione alle temperature elevate degli strumenti e la camera umida.
   1. Impostare l'ibridazione forno e forno a calore secco (~ 3 h prima di iniziare il protocollo del DNA-FISH). Impostare il forno di ibridazione a 75 ° C, impostare il forno a calore secco a 37 ° C e raffreddare la soluzione SSC × 0,4 (pH = 7,0 ± 0,1) (per la ricetta SSC Vedi tabella 1) a 4 ° C.
      Nota: lo stato di pH di buffer di pesce è fondamentale: pH = 7,0 ± 0,1.
   2. Lavare tre volte il vetrino coprioggetto in soluzione di SSC × 0,4 ghiacciata.
   3. Asciugare il vetrino coprioggetto sotto una cappa chimica per 10 min al buio.
   4. Vortexare per 10 s ed eseguire un lancio rapido verso il basso (a velocità massima) della sonda dalla parete del tubo sonda.
   5. Posizionare il vetrino coprioggetto cella-lato su una goccia di 5 µ l di sonda di pesce su uno scivolo e un sigillo tutti i bordi del coprivetrino con mastice.
      Attenzione: I due passaggi successivi prevedono temperature elevate. Indossare guanti protettivi.
   6. Mettere il vetrino in una camera umida scura al forno di ibridazione per 8 min a 75 ° C per la completa denaturazione del DNA.
   7. Spostare la camera umida in forno a calore secco a 37 ° C O/N.
6. 3 ° giorno 2D DNA-FISH
   1. Impostare il bagno di acqua a 72 ° C e posto un vaso di diapositiva-macchiatura con buffer di SSC × 0,4 in esso (tabella 1). Dopo 30 min, controllare la temperatura del buffer 0.4 × SSC, che deve essere a 72 ± 1 ° C.
   2. Preparare due Coppe di vetro: uno con 2 × SSC + 0.05% Tween tampone (pH = 7,0 ± 0,1) (tabella 1) e una seconda con acqua distillata.
   3. Rimuovere la camera umida dal forno, con attenzione rimuovere il collante dal vetrino e staccare il coprioggetto con le pinzette.
   4. Lavare il vetrino coprioggetto mediante immersione in 0.4 × SSC per 2 min a 72 ° C.
   5. Lavare il vetrino coprioggetto mediante immersione in 2 × SSC + 0.05% Tween buffer per 30 s.
   6. Sciacquare il vetrino coprioggetto in acqua distillata.
   7. Asciugare i vetrini coprioggetti sotto una cappa chimica per 10 min al buio.
   8. Montare il vetrino coprioggetto in mezzo di montaggio liquido con 1,5 µ g/mL di 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) di colorante di contrasto DNA totale. Posizionare il vetrino coprioggetto cella-lato su una goccia di 5 µ l di liquido di montaggio su una diapositiva, premere le pinzette sul coprioggetto per ottenere l'aria fuori e sigillare con smalto.
      Nota: Volume medio di montaggio deve essere regolata in base alla dimensione della superficie del vetrino coprioggetti.
7. Analisi e osservazione del microscopio 2D
   Nota: Immagini possono essere acquisite con sistemi diversi di microscopio.

1. Acquisire immagini utilizzando una fotocamera digitale a 12 bit e 20 × / 0,50 NA e 40 × / 0.65 NA obiettivo con filtri appropriati per rosso (eccitazione: 599 nm, emissione: 588 nm), verde (eccitazione: 509, emissione: 524) e blu (eccitazione: 367 nm, emissione: 452 nm) sonde.
2. Analizzare le immagini utilizzando il tool software di scelta.
   Nota: Per valutare la colorazione di immunofluorescenza e la localizzazione di ALK-sonda, abbiamo usato ImageJ. I vetrini possono essere conservati a-20 ° C al buio per un massimo di 3 settimane. Per una conservazione prolungata, suggeriremmo usando il mezzo di montaggio specifico per l'archiviazione a lungo termine.

2. Immuno-DNA pesce sul filo

1. Spike-in cella linea sul filo (supporto 3D)
   Nota: Il set-up preliminare comporta un'accurata selezione di aderente celle righe basate su EpCAM-positività. Il filo è funzionalizzato con gli anticorpi anti-EpCAM affinché solo le celle EpCAM-positivi sono macchiate.
   Nota: Non toccare la parte funzionalizzata del filo per evitare eventuali danni.
   Nota: Tutti i passaggi devono essere effettuati sotto cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
   1. Risospendere l'intero contenuto di una boccetta di T75 (80% confluenza) in un flaconcino da 5 mL con 4 mL di terreno completo; per un singolo picco-in, circa 2.000.000 cellule sono raccomandate per massimizzare l'adesione di cellule al filo.
   2. Rimuovere il filo dalla sua confezione di vetro.
   3. Immergere la parte in oro funzionalizzata del filo nel flaconcino, assicurando che il filo-stopper è una misura a tenuta stagna per flaconcino. Sigillare con parafilm.
      Nota: L'uso di tubo 5ml è consigliato per consentire una corretta corrispondenza tra il filo-stopper e il flaconcino.
   4. Incubare per 30 min a RT in un rotatore del tubo (0-120 angolo).
   5. Sciacquare il filo tre volte in 1 soluzione di PBS × utilizzando 3 diversi flaconcini puliti.
2. Fissazione e permeabilizzazione
   Attenzione: L'Acetone è una sostanza infiammabile che può irritare le vie respiratorie. Utilizzare solo materie plastiche resistente all'acetone o contenitori di vetro (senza PVC o PVDF).
   Nota: Eseguire questi passaggi sotto una cappa chimica.
   1. Asciugare il filo.
   2. Fissare le cellule immergendo il filo nella soluzione di 100% di acetone per 10 min a RT. uso una provetta da 5 mL.
      Nota: Il filo-stopper non deve venire a contatto con il fissativo.
   3. Asciugare il filo per 5 minuti a TA.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il filo deve essere conservato a-20 ° C. Quando si imballa il filo per l'archiviazione a lungo termine, posizionare il filo-stopper vicino all'estremità funzionalizzati e inserire con cura il filo del tubo di vetro di stoccaggio, avendo cura di non per danneggiare la punta funzionalizzata. Chiudere il vetro di deposito e conservare (orizzontalmente o verticalmente) a-20 ° C.
3. 1 ° giorno di immunofluorescenza
   Nota: Questa fase comporta un'incubazione di O/N (~ 16 h).
   1. Lavare due volte in 1 soluzione di PBS × utilizzando provetta da 5 mL.
   2. Incubare il filo in tampone di diluizione dell'anticorpo per 30 min a RT utilizzando provetta da 5 mL.
   3. Preparare 150 µ l di anticorpo mix con una diluizione di anticorpo primario monoclonale coniugato con fluorocromo in tampone di diluizione dell'anticorpo, come specificato nel foglio dati. Ad esempio, l'anticorpo EpCAM-FITC è stato utilizzato con un 01:20 diluizione.
   4. Usare una punta di p200 per eseguire incubazione, come segue: estrarre il filo dal filo-tappo e inserire delicatamente il filo attraverso il foro più grande della punta. Inserire per primo il lato interessante e tirare lentamente il filo attraverso il foro più piccolo fino a quando la parte in oro è appena oltre il foro più grande.
   5. Rilasciare delicatamente 150 µ l della miscela dell'anticorpo (ad esempio anti EpCAM_FITC anticorpo 01:20 diluito) verso la punta. Per evitare il rischio di formazione di bolle, roteare delicatamente il filo fino a quando la parte funzionalizzata è completamente immerso.
   6. Sigillare il foro della punta. Avvolgere nella pellicola di laboratorio intorno al foro può aiutare.
   7. Incubare in verticale O/N (~ 16 h) al buio a 4 ° C.
4. 2 ° giorno di immunofluorescenza
   1. Bloccare l'incubazione dell'anticorpo lavando il filo due volte in 1 × PBS.
   2. Re-inserire il filo nel suo filo-tappo.
      Nota: Negozio in 1 X PBS a 4 ° C in un 5 mL fiala fino a quando il saggio FISH è eseguito.
5. 3D del DNA-pesce giorno 2
   Attenzione: Devono prestare particolare attenzione alle alte temperature della camera umida e strumenti.
   1. Impostare l'ibridazione forno e forno a calore secco (~ 3 h prima di iniziare il protocollo del DNA-FISH). Impostare il forno di ibridazione a 75 ° C, impostare il forno a calore secco a 37 ° C e raffreddare la soluzione SSC × 0,4 (pH = 7,0 ± 0,1) a 4 ° C.
      Nota: Lo stato di pH del buffer di pesce è fondamentale e deve essere 7,0 ± 0,1.
   2. Lavare 3 volte il filo in soluzione di SSC × 0,4 ghiacciata.
      Nota: Tenere il filo al buio per evitare fluorocromo photobleaching durante le procedure seguenti.
   3. A secco per 10 min al buio sotto la cappa.
   4. Vortice e spin la sonda per 5 s.
   5. Goccia 10 µ l di sonda in bicchiere microprovette. Coprire con la pellicola di laboratorio.
   6. Girare le microprovette come segue: avvolgere i conetti in messo assorbente, cartaceo a secco in una provetta da 50 mL e girare brevemente.
   7. Posizionare il filo secco in provetta e inserire il filo-stopper. Sigillare con cemento di gomma.
      Attenzione: I due passaggi successivi prevedono temperature elevate.

Utilizzando la procedura descritta sopra di esso è possibile eseguire un test Immuno-DNA FISH su CTCs (o altre cellule equivalente) arricchita dal filo funzionalizzato. Prima di impostare questo protocollo, la compatibilità delle due tecniche è stata determinata (immuno-fluorescenza con pesce) su supporti standard 2D. Sono stati selezionati due differenti linee cellulari di NSCLC esprimendo EpCAM (tenuti a rispettare per il filo accoppiato con gli anticorpi contro EpCAM). Essi hanno un diverso status ALK, che è utile per testare le diverse condizioni di partenza. Il primo, NCI-H1975, hanno geni ALK wild type (WT), mentre il secondo, NCI-H3122, è caratterizzato da traslocazioni di ALK.

Un sistema di rilevamento rottura-apart del gene ALK per il saggio FISH è stato utilizzato. Il sistema è costituito da due sonde, uno (arancione) ibridazione nella regione prossimale all'interno di ALK 2p23 e uno (verde) ibridando distale di ALK. Su supporti 2D, Immuno-DNA pesce fornito segnali ben definiti per l'anticorpo e la sonda (Figura 2). In particolare, entrambi cellula ha mostrato la localizzazione in membrana EpCAM ben definito. Inoltre, la sonda segnali apparivano luminoso e nitido: cellule NCI-H1975 hanno mostrato sovrapposizione sonde arancione e verde, confermando lo status di wildtype del gene ALK (Figura 2a, b). Al contrario, le cellule NCI-H3122 hanno mostrato segnali sovrapposti e singoli punti verdi, riflettendo una delezione del gene ALK (Figura 2C, sviluppo). Quando il saggio FISH Immuno-DNA è stato eseguito sul 3D supporto filo funzionalizzato, anticorpo e sonda segnali erano generalmente meno definiti rispetto al supporto 2D. La macchiatura di EpCAM era visibile. ALK sonda segnali erano meno definito ma riflette ancora lo stato previsto di ALK (Figura 3). Risultati hanno mostrato che la colorazione di immunofluorescenza non ha interferito con DNA FISH segnali. Le sonde ibridate in particolare con i loro obiettivi. Varietà di cellula NCI-H3122 ha mostrato una condizione del gene ALK aberrante (Figura 3b), in contrasto con NCI-H1975, con un gene ALK wild-type (Figura 3a).

Figura 1 : Funzionalizzati filo, disposizione schematica delle sonde pausa-apart ALK, schema di modelli attesi di riarrangiamento di ALK e speciale titolare. (un) Red scatole evidenziare le tre parti principali del filo: funzionalizzati punta, filo-tappo e punta ONU-funzionalizzato. La punta funzionalizzata è la parte più delicata del filo e non deve essere toccata durante la movimentazione per evitare il distacco delle cellule o danni. (b) le sonde, verde e rosse rispettivamente legano sequenze a Monte e a valle dei loci del gene ALK (a sinistra). Sulla destra, sono mostrati esemplificativo modelli di accordi di ALK. Segnali di co-localizzazione di rosso e verde sulle cellule normali; separati i segnali verdi e rossi indicano un'interruzione di cromosoma gene ALK (traslocazione del gene ALK) e un arancio-verde colocalizzazione segnale (aberrante delle cellule-1). Un segnale rosso e due segnali verdi indicano la perdita di un segnale rosso, suggerendo una traslocazione cromosomica e un'omissione (aberrante delle cellule-2). (c) filo titolare; nelle caselle rosse evidenziano le aree dove la cura è necessaria quando si maneggia il filo durante l'analisi in microscopia. Il filo può subire un'analisi a 360 ° ruotando il rotatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Saggio Immuno-DNA FISH su supporto 2D (vetrino coprioggetti). (a, b) NCI-H1975 cellule debolmente positivo per EpCAM. EpCAM FITC segnali sono stati apprezzabili. Le sonde arancione e verde del ALK pausa-apart sovrappongono, confermando lo stato WT del gene ALK nella linea cellulare NCIH1975. Visualizzati da più di due segnali accoppiati le cellule erano presenti a causa di loro aneuploide. (c, d) Nella linea cellulare EpCAM-esprimendo NCIH3122 alta, segnali di immunofluorescenza erano luminosi, che è stata accentuata in giunzioni della cellula-cellula. PESCE analisi confermate delezioni del gene ALK, tipico di questa linea cellulare. Le frecce rosse indicano singole sonde verde (senza sonde arancione corrispondente), riflettendo la delezione del gene ALK. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Pesce Immuno-DNA test usando il filo funzionalizzato come supporto 3D. (una) rappresentante immagine delle cellule NCI-H1975 sul filo. Anche se la forma 3D delle cellule sul filo rendono difficile da acquisire immagini completamente a fuoco, EpCAM segnale è ben visibile in tutte le cellule. immagine (b), rappresentante delle cellule NCI-H3122 sul filo. ALK sonde hanno mostrato omissione del gene (frecce rosse), come già visto sul supporto 2D. I segnali di fondo visibile sono stati molto probabilmente a causa della presenza dello strato di polimero. Tuttavia, non ha colpito significativamente l'analisi identificazione o fluorescenza delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Ricette di soluzioni.

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.