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Articolo metodologico

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

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DOI:

10.3791/56943

⸱

21 marzo 2018

 ,  ,  , 
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

In questo articolo

Sommario

L'ottenimento di DNA genomico di alta qualità dai tessuti del tumore è un primo passo essenziale per analizzare le alterazioni genetiche mediante sequenziamento di nuova generazione. In questo articolo, presentiamo un metodo semplice e rapido per arricchire le cellule del tumore e ottenere DNA intatto dal tocco impronta campioni citologici.

Abstract

È fondamentale per determinare lo stato mutazionale nel cancro prima amministrazione e trattamento di farmaci a bersaglio molecolare specifici per malati di cancro. In ambito clinico, formalina-fisso tessuti di paraffina (FFPE) sono ampiamente utilizzati per i test genetici. Tuttavia, FFPE DNA generalmente è danneggiata e frammentato durante il processo di fissazione in formalina. Di conseguenza, FFPE DNA non è a volte adeguata per test genetici a causa della bassa qualità e quantità di DNA. Qui presentiamo un metodo di citologia di impronta di tocco (TIC) per ottenere il DNA genomico da cellule tumorali, che può essere osservato sotto un microscopio. I numeri di cellulare delle cellule di morfologia e cancro possono essere valutati utilizzando campioni di TIC. Inoltre, l'estrazione del DNA genomico da campioni TIC può essere completato entro due giorni. Totale quantità e qualità di TIC DNA ottenuto utilizzando questo metodo era superiore a quella del DNA FFPE. Questo metodo rapido e semplice permette ai ricercatori per ottenere alta qualità DNA per test genetici (ad es., analisi di sequenziamento di prossima generazione, digital PCR e PCR quantitativa in tempo reale) e di abbreviare i tempi per riportare i risultati.

Introduzione

Prossima generazione tecnologia di sequenziamento ha fornito i ricercatori significativi progressi nell'analisi delle informazioni sul genoma in variazioni genetiche, malattia mendeliana, predisposizione ereditaria e cancro 1,2,3 . Il Cancer Genome Atlas (TCGA) e International Cancer Genome Consortium (ICGC) hanno perseguito l'identificazione delle alterazioni genetiche in parecchi tipi di comuni tumori4. Centinaia di cancro essenziali driver geni è stati identificati correttamente, e alcune di queste molecole sono presi di mira per droga sviluppo1,5,6.

In ambito clinico, FFPE esemplari sono comunemente usati per la diagnosi patologica e la prova molecolare per varie malattie, compreso il cancro. Tuttavia, durante il processo di fissazione in formalina, cross-linking del DNA-proteine o DNA-DNA si verifica e viene indotta la frammentazione del DNA. Così, i campioni del DNA FFPE non sono sempre adatti per l'analisi genetica a causa della bassa qualità e la quantità di DNA7,8,9. Inoltre, ci vogliono diversi giorni per preparare i campioni FFPE e abilità tecnica è necessario preparare accuratamente le sezioni. Pertanto, è auspicabile sviluppare un metodo semplice e rapido per ottenere alta qualità DNA intatto.

La citologia è un metodo alternativo per la diagnosi patologica. Preparazione del campione citologico è un più semplice, meno costoso e più rapido approccio rispetto al FFPE preparazione10. La tecnica TIC è stata eseguita il linfonodo sentinella e marginali tessuti da pazienti di cancro al seno per la diagnosi rapida intraoperative per alcuni anni11,12. Tuttavia, ci sono pochi rapporti che hanno esaminato se il DNA genomic di alta qualità può essere estratto dai campioni TIC e utilizzato per la successiva analisi genetica. Campioni citologici sono comunemente macchiati con colorazione di Giemsa o di Papanicolaou (Pap), e precedentemente abbiamo segnalato che la quantità e la qualità del DNA estratto dagli esemplari TIC (soprattutto Giemsa-macchiata campioni) sono superiori a campioni ottenuti da FFPE tessuti13. Rispetto al Pap colorazione, colorazione Giemsa ha un vantaggio in che richiedono meno procedure di colorazione. In Pap colorazione, dopo i campioni sono stati fissati e macchiati, devono essere montati con montaggio medio (per esempio, Malinol) per distinguere i contenuti di esempio, come le cellule del tumore, le cellule normali e cellule infiammatorie sotto un microscopio. Se il campione di Pap è preparato senza la fase di montaggio, è quasi impossibile osservare le cellule al microscopio perché l'esemplare è asciugato. In confronto, colorazione Giemsa possono essere osservati nello stato secco, di conseguenza, il passo di montaggio non è necessario per la rapida valutazione cellulare. Per microdissezione, colorazione Giemsa è più adatto perché richiede campioni asciutti.

In questo rapporto, introduciamo un metodo semplice e rapido per preparare campioni TIC con colorazione Giemsa e dimostrare che il TIC è una fonte migliore per DNA rispetto agli esemplari FFPE.

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Protocollo

1. TIC preparazione rapida valutazione microscopica utilizzando vetro normale diapositive

  1. Eseguire la preparazione di TIC più presto possibile dopo il tessuto patologico clinico materiali sono disponibili. Se i campioni TIC non possono immediatamente essere preparati, conservare il materiale di tessuto rivestito con soluzione fisiologica inumidito garza sterile e conservare in frigorifero per evitare l'essiccazione dei tessuti.
  2. Preparare 5 mm3 tessuto materiale come tumori solidi (ad es., fegato, polmone e tessuti del seno) clinicamente ottenuto dalla chirurgia o l'endoscopia.
    1. Delicatamente strofinare il tessuto con garza sterile rivestito con soluzione fisiologica e rimuovere il sangue, se la superficie del tessuto ha un sacco di sangue.
    2. Per campioni microscopici come materiale di biopsia, mantenere il campione inumidito con garza sterile imbevuta di soluzione fisiologica.
  3. Tagliare e tagliare il tessuto normale con un coltello multiuso ed esporre la superficie della lesione tumorale, se le masse di tumore non sono grossolanamente visibile.
  4. Toccare la superficie del tumore degli esemplari resecati su una lastra di vetro normale parecchie volte con le mani guantate. Confermare visivamente che la zona toccata è oltre l'80% del normale vetrino.
  5. Leggermente premere il vetrino normale contro una diapositiva di membrana in polietilene naftalato (penna) e strofinare delicatamente 2 - 3 volte con le mani guantate. Confermare visivamente che le cellule sono trasferite dalla diapositiva vetro normale alla diapositiva di membrana di penna.
  6. Asciugare il vetro e la penna membrana diapositive per 5 min a temperatura ambiente.
  7. Macchia sul normale vetrino per esame citologico diretto. Immergere i vetrini con soluzione fissante per 5 s e quindi macchia con Giemsa colorazione soluzione per 15 s.
  8. Valutare e a schermo il contenuto del tumore e la cellularità della diapositiva vetro normale interamente con un microscopio per la valutazione rapida. Valutare le cellule del tumore sulla base di diversi criteri; ingrandimento nucleare, karyotype anormale, cromatina abbondante, ineguale distribuzione delle cellule, rapporto del componente componente/citoplasmico nucleare, dimensione delle cellule e polarità cellulare.

2. preparazione del penna membrana Slide Film per test genetici

  1. Se il campione presenta cellularità del tumore oltre il 60% di rapida valutazione microscopica (passo 1,8), tagliare la pellicola tumore-toccato le diapositive di membrana di penna per estrazione del DNA con un coltello e gloved mani. Trasferire la pellicola tagliata a un tubo del microcentrifuge sterile con un pincette e mani inguantate.
  2. Se la cellularità del tumore è stata determinata come basso (meno del 60% del contenuto del tumore) di rapida valutazione microscopica (passo 1,8), uso laser capture microdissection e ottenere i campioni del tumore.
    1. Eseguire Giemsa colorazione per valutare le cellule del tumore utilizzando protocolli standard.
    2. Tagliare la pellicola della diapositiva membrana PEM di microdissezione laser appropriato.
    3. Trasferire la pellicola tagliata a un tubo del microcentrifuge sterile con un pincette e mani inguantate.
    4. Conservare il tubo del microcentrifuge contenenti la pellicola a 4 ° C fino all'estrazione del DNA (il protocollo può essere sospesa qui).

3. DNA estrazione

  1. Eseguire l'estrazione del DNA dai campioni di tessuto TIC o FFPE utilizzando un kit di estrazione del DNA FFPE secondo le istruzioni del produttore con modifiche minori. Un equivalente kit è disponibile per la fase di estrazione del DNA FFPE.
  2. Aggiungere 180 µ l di tampone di lisi del tessuto (pH = 8,3) al tubo del microcentrifuge contenenti la pellicola con una pipetta manuale 200-µ l. Aggiungere 20 µ l di proteinasi K con una pipetta manuale 20-µ l e mescolare nel Vortex con un miscelatore vortex alla massima velocità (circa 2.500 giri/min) per 5 s.
  3. Incubare i campioni a 56 ° C per una notte con un'incubatrice di aria.
  4. Incubare i campioni FFPE e TIC a 90 ° C in un blocco di calore per 1 h e 10 min, rispettivamente. Brevemente girare giù per il tubo del microcentrifuge a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente con una mini centrifuga.
  5. Aggiungere 200 µ l di tampone di lisi per il campione con una pipetta 200-µ l e mescolare accuratamente nel Vortex alla massima velocità per 5 s.
  6. Aggiungere 200 µ l di etanolo (96-100%) con una pipetta 200-µ l e mescolare nel Vortex alla massima velocità per 5 s. brevemente rotazione verso il basso il tubo del microcentrifuge a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente con una mini centrifuga.
  7. Trasferire con cautela l'intero lisato alla colonna di spin con una pipetta di 1.000-µ l e centrifugare a 6.000 x g per 1 min a 25 ° C.
  8. Posizionare la colonna di spin in un tubo pulito 2-mL collezione con le mani guantate e gettare la provetta di raccolta contenente il flusso continuo in un box di plastica smaltimento.
  9. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio per la colonna di spin con una pipetta di 1.000-µ l e centrifugare a 6.000 x g per 1 min a 25 ° C.
  10. Posizionare la colonna di spin in un tubo pulito 2-mL collezione con le mani guantate e gettare la provetta di raccolta contenente il flusso continuo in un box di plastica smaltimento.
  11. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio per la colonna di spin con una pipetta di 1.000-µ l e centrifugare a 6.000 x g per 1 min a 25 ° C.
  12. Gettare la provetta di raccolta contenente il flusso continuo in un box di plastica smaltimento. Posizionare la colonna di spin in un tubo del microcentrifuge pulito 1,5 mL con le mani guantate e centrifugare a 20.000 x g per 3 min a 25 ° C per asciugare la membrana.
  13. Sistemare la colonna di spin in un tubo di associazione DNA-basso con mano guantata.
    1. Aggiungere 40-50 µ l di tampone di eluizione al centro della membrana con una pipetta 100-µ l.
    2. Incubare a temperatura ambiente per 5 min e centrifugare a 20.000 x g per 1 min a 25 ° C.
    3. Conservare i campioni di DNA a-20 ° C fino al passaggio successivo (il protocollo può essere sospesa qui).

4. stima della qualità del DNA da PCR quantitativa in tempo reale

  1. Preparare il mix master in una microcentrifuga sterile con una pipetta, come segue: 10 µ l di 2 x Real-Time PCR Master Mix, 1 µ l di 20 x RNasi P Primer-sonda Mix (dimensione amplicone: 87 bp) e 8 µ l di acqua sterile priva di nucleasi.
  2. Preparare il mix master secondo in una microcentrifuga sterile come segue: 10 µ l di 2 x Real-Time PCR Master Mix, 1 µ l di 20 x RNasi P Primer-sonda Mix (amplicone dimensioni: 268 bp) e 8 µ l di acqua sterile priva di nucleasi.
  3. Effettuare diluizioni seriali del DNA genomico di controllo umano (fornito nel kit) 4 volte per una curva standard a cinque punti e di determinare l'assoluta di concentrazioni di DNA13.
  4. Aggiungere 19 µ l dei due preparati mix master (preparata al punto 4.1 e 4.2) in pozzetti separati di una piastra di reazione ottico a 96 pozzetti con una pipetta 20-µ l.
  5. Aggiungere 1 µ l di DNA FFPE o TIC DNA per separare i pozzetti contenenti la miscela di reazione con una pipetta 2-µ l. Aggiungere 1 µ l di acqua priva di nucleasi in un pozzo separato contenente la miscela di reazione per il nessun controllo del modello.
  6. Tenere il lato non adesivo di una pellicola adesiva ottico e togliere il film protettivo dal centro del film. Dolcemente trascinare l'applicatore sopra la pellicola e sigillare la pellicola sopra la piastra a 96 pozzetti.
  7. Mescolare delicatamente la piastra a 96 pozzetti utilizzando un mixer di piastra a 96 pozzetti per 10 s a temperatura ambiente a 2.000 giri/min. Centrifugare la piastra brevemente a 1.000 x g per 3 min a temperatura ambiente.
  8. Accendere l'in tempo reale strumento di PCR ed inserire la piastra a 96 pozzetti. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando il seguente protocollo: 95 ° C per 20 s, seguita da 45 cicli di 95 ° C per 1 s e 60 ° C per 20 s. curva di utilizzo"standard" e "modalità veloce".
  9. Valutare la frammentazione del DNA con il rapporto del DNA (quantificazione relativa; RQ) ottenuta per l'amplicone lungo (268 bp) per l'amplicone breve (87 bp). RQ è il valore medio del valore medio lungo il amplicon del amplicon breve13.

5. preparazione della prossima generazione sequenziamento biblioteca

  1. Preparare la libreria di sequenziamento per il sequenziamento di nuova generazione secondo le istruzioni del produttore.
  2. Preparare il mix master di PCR multiplex in una microcentrifuga sterile per campione come segue: 4 µ l di soluzione di reazione di PCR Multiplex, 4 µ l di 5 x piscina primer, µ l di ≤ 6 FFPE DNA (1-100 ng), o TIC: 5x e aggiungere acqua priva di nucleasi fino a 20 µ l.
    1. Aggiungere il mix master di PCR multiplex a una provetta PCR e mescolare delicatamente toccando il tubo.
    2. Brevemente girare giù per il tubo del microcentrifuge a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente con una mini centrifuga.
  3. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando il seguente protocollo: 99 ° C per 2 min, seguiti da 20 cicli di 99 ° C per 15 s e 60 ° C per 4 min e tenendo un passo 10 ° C. Si sono fermati brevemente la provetta PCR con una mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente.
    Nota: Determinare il numero di cicli in base al numero di coppie di primer.
  4. Aprire il coperchio del tubo PCR e aggiungere 2 µ l di enzima di restrizione con una pipetta 2-µ l. Chiudere il coperchio del tubo PCR e mescolare delicatamente toccando il tubo PCR. Si sono fermati brevemente la provetta PCR con una mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente.
  5. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando il seguente protocollo: 50 ° C per 10 min, 55 ° C per 10 min, 60 ° C per 20 min, e che tiene un passo 10 ° C. Si sono fermati brevemente la provetta PCR con una mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente.
  6. Aggiungere il mix master di legatura di adattatore nell'ogni bene contenente gli ampliconi PCR digeriti con una pipetta come segue: 4 µ l di soluzione di legatura di adattatore, 0,5 µ l di codici a barre, 0,5 µ l di adattatore, 2 µ l di acqua priva di nucleasi e 2 µ l di DNA ligasi. Chiudere il coperchio della provetta PCR e mescolare delicatamente toccando. Si sono fermati brevemente la provetta PCR con una mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente.
  7. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando il seguente protocollo: 22 ° C per 30 min, 68 ° C per 5 min, 72 ° C per 5 min, e che tiene un passo 10 ° C.
  8. Purificare la biblioteca di sequenziamento con biglie magnetiche secondo le istruzioni del produttore.
  9. Trasferire la soluzione della libreria adattatore-legati nella provetta da 1,5 mL DNA basso-associazione. Aggiungere 45 µ l di biglie magnetiche nel tubo basso-associazione del DNA per la purificazione dist 1. Mescolare delicatamente toccando il tubo e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  10. Posizionare il tubo di associazione DNA-basso in un rack magnetico, quindi incubare per 2 min a temperatura ambiente fino a quando la soluzione è limpida. Attentamente e scartare il surnatante con una pipetta 200-µ l senza disturbare i branelli magnetici.
  11. Aggiungere 150 µ l di etanolo al 70% preparati al momento con una pipetta 200-µ l, quindi spostare il tubo lato a lato del magnete per lavare le perle. Con attenzione è possibile scartare il sopranatante senza disturbare i branelli magnetici.
  12. Ripetere il passaggio 5.11 per un secondo lavaggio.
  13. Brevemente rotazione verso il basso il tubo con mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente. Posizionare il tubo di bassa-associazione di DNA in un rack magnetico e scartare con attenzione le goccioline di etanolo con una pipetta 10-µ l.
  14. Aggiungere 50 µ l di TE basso nel tubo di basso-associazione di DNA contenente il pellet di biglie magnetiche per disperdere le perline. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
  15. Posizionare il tubo di bassa-associazione di DNA in un rack magnetico e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti fino a quando la soluzione è limpida.
  16. Trasferire il 50 µ l del surnatante nel nuovo tubo basso-associazione DNA e aggiungere 75 µ l di biglie magnetiche con una pipetta 100-µ l per la purificazione di 2nd . Mescolare delicatamente toccando il tubo e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  17. Posizionare il tubo di bassa-associazione di DNA in un rack magnetico, quindi incubare per 2 min a temperatura ambiente fino a quando la soluzione è limpida. Attentamente e scartare il surnatante con una pipetta 200-µ l senza disturbare i branelli magnetici.
  18. Aggiungere 150 µ l di etanolo al 70% preparati al momento con una pipetta 200-µ l, quindi spostare il tubo lato a lato del magnete per lavare le perle. Con attenzione è possibile scartare il sopranatante senza disturbare i branelli magnetici.
  19. Ripetere il passaggio 5,18 per un secondo lavaggio.
  20. Brevemente rotazione verso il basso il tubo con una mini centrifuga a 1.500 x g per 5 s a temperatura ambiente. Posizionare il tubo di bassa-associazione di DNA in un rack magnetico e scartare con attenzione le goccioline di etanolo con una pipetta 10-µ l.
  21. Aggiungere 50 µ l di TE basso nel tubo di basso-associazione di DNA contenente il pellet di biglie magnetiche per disperdere le perline. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
  22. Posizionare il tubo di bassa-associazione di DNA in un rack magnetico e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti fino a quando la soluzione è limpida.
  23. Trasferire il 45 µ l del supernatante contenente la libreria purificato nel nuovo tubo basso-associazione del DNA con una pipetta 100-µ l.

6. quantificare la concentrazione di biblioteca di PCR quantitativa in tempo reale

  1. Determinare la concentrazione di ogni libreria secondo istruzioni13 del produttore.
    1. Preparare una soluzione di diluizione 20 volte come segue: mescolare 2 µ l di libreria purificata e 38 µ l di acqua priva di nucleasi in un tubo di basso-associazione di DNA con una pipetta 2-µ l e 100-µ l.
    2. Memorizzare le librerie non diluite a-20 ° C fino al punto 7.3.
  2. Preparare una soluzione di diluizione 200 volte come segue: 5 µ l della biblioteca purificata diluita 20 volte (preparata al punto 6.1) e 45 µ l di acqua priva di nucleasi in un tubo di basso-associazione di DNA.
  3. Preparare una soluzione di 2,000-fold diluizione come segue: 5 µ l della biblioteca purificata diluita 200 volte (preparata al punto 6.2) e 45 µ l di acqua priva di nucleasi in un tubo di basso-associazione di DNA.
  4. Preparare il mix master di reazione come segue: Miscelare 10 µ l di soluzione di mix master: 2x e 1 µ l di soluzione di saggio di primer-sonda nel tubo del microcentrifuge sterile 20x con una pipetta, quindi miscelare toccando il tubo. 11 µ l di mix master reazione nei pozzetti di una reazione di 96 pozzetti ottico.
  5. Aggiungere 9 µ l della 2,000-fold biblioteca diluita, 9 µ l di ogni controllo standard o 9 µ l di acqua priva di nucleasi ad ogni pozzetto con una pipetta 10-µ l.
  6. Tenere il lato non adesivo ottico pellicola adesiva e togliere il film protettivo dal centro del film.
    1. Dolcemente trascinare l'applicatore sopra la pellicola e sigillare la pellicola sopra la piastra a 96 pozzetti.
    2. Mescolare delicatamente la piastra a 96 pozzetti utilizzando un mixer di piastra a 96 pozzetti per 10 s a temperatura ambiente.
    3. Centrifugare la piastra brevemente a 1.000 x g per 3 min a temperatura ambiente.
  7. Accendere l'in tempo reale strumento di PCR ed inserire la piastra a 96 pozzetti. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando il seguente protocollo: 50 ° C per 2 min, 95 ° C per 20 s, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 1 s e 60 ° C per 20 s. curva di utilizzo"standard" e "modalità veloce".
  8. Calcolare la concentrazione di libreria non diluito moltiplicando la concentrazione determinata con qPCR di 2.000.

7. sequenziamento di nuova generazione

  1. Pianificare la condizione di esecuzione e impostare il parametro run all'interno del software.
    1. Fare clic su [scheda piano] e [modello] e selezionare il metodo di esecuzione appropriato.
    2. Selezionare l'applicazione e il tipo di tecnica e fare clic su [Avanti].
    3. Selezionare la strumento kit di preparazione del campione (opzionale), tipo di libreria kit, modello kit, kit di sequenziamento, modalità di calibrazione di base, tipo di chip, set di sequenza (opzionale) e codici a barre di controllo e fare clic su [Avanti].
    4. Selezionare plug-in e fare clic su [Avanti].
    5. Selezionare il progetto e fare clic su [Avanti].
    6. Selezionare riferimento predefinito e il file letto dalla regione di destinazione.
    7. Digitare il nome di esempio, selezionare il codice a barre e fare clic su [Esegui piano].
  2. Eseguire la preparazione del modello e chip caricamento in uno strumento automatizzato secondo le istruzioni del produttore. Scongelare la cartuccia di reagente a temperatura ambiente per 45 min prima dell'uso.
  3. Diluire la libreria non diluita con acqua priva di nucleasi secondo la concentrazione di biblioteca calcolata nel passaggio 6.8 e rendere 20 pM librerie.
    1. Preparare una libreria in pool per il sequenziamento e archivio sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 25 µ l della biblioteca in pool con una pipetta µ l 100 sul fondo della provetta del campione. Utilizzare la libreria riunita all'interno di 48 h.
  4. Accendere e aprire il coperchio dello strumento automatizzato.
    1. Posizionare il chip di sequenziamento, adattatore chip, cartuccia di arricchimento, cartuccia con punta, piastra PCR, guarnizione del telaio PCR, tubo di recupero, cartuccia di soluzione e la cartuccia di reagente nella posizione appropriata dello strumento automatizzato.
    2. Toccare [Set up Run] e [passo passo] sullo schermo.
    3. Chiudere il coperchio e toccare [Start casella] sullo schermo.
    4. Dopo il ponte di scansione processo, toccare [Avanti] sullo schermo.
    5. Verifica il contenuto del display (tipo di kit, tipo di chip, chip piani di ID, ID campione,), impostare l'ora e toccare [OK] sullo schermo.
  5. Dopo aver terminato il caricamento di chip:
    1. Toccare [Avanti] sullo schermo e aprire il coperchio.
    2. Scaricate il chip di sequenziamento dall'alimentatore a chip con le mani guantate.
    3. Inserire il chip nel contenitore del chip, rap con parafilm e conservare a 4 ° C fino a quando la reazione di sequenziamento.
    4. Rimosso la cartuccia di arricchimento, piastra PCR, guarnizione del telaio PCR, tubo di recupero, cartuccia di soluzione e la cartuccia di reagente nella posizione appropriata dello strumento automatizzato con mano guantata.
    5. Trasferire una cartuccia vuota-suggerimento per la posizione della punta dei rifiuti dello strumento automatizzato con mano guantata.
    6. Toccare [Avanti] e chiudere il coperchio.
    7. Toccare [Start] e pulire lo strumento automatizzato di raggi ultravioletti per 4 min.
  6. Sciogliere una tavoletta di clorito di sodio in 1.000 mL di acqua ultrapura e filtro soluzione con un'unità di filtro del flusso filtro da 0,22 µm.
    1. Accendere lo strumento di sequenziamento.
    2. Toccare [Clean] e [Avanti] sullo schermo dello strumento sequenziamento.
    3. Pulire lo strumento di sequenziamento con 250 mL di soluzione di clorito di sodio sterilizzati con filtro e successivamente 250 mL di acqua ultrapura.
  7. Toccare [Initialize] e selezionare il kit di sequenziamento appropriato sullo schermo.
    1. Installare un mittente grigio nella posizione corretta con le mani guantate.
    2. Inizializzare lo strumento di sequenziamento con la soluzione di lavaggio (fornito nel kit), la soluzione di regolazione del pH (contenente 350 µ l di idrossido di sodio 100 mM) e la soluzione standard di pH (fornito nel kit).
  8. Aggiungere 20 µ l di dATP, dGTP, dCTP e dTTP nucleotidi (fornito nel kit) in provette da 50 mL (fornite nel kit) con una pipetta 100-µ l.
    1. Installare un mittente grigio nella posizione corretta con le mani guantate.
    2. Caricare il tubo da 50 mL e avvitare lo strumento di sequenziamento.
    3. Toccare [Avanti] sullo schermo per iniziare la fase di inizializzazione, che prende circa 25 min.
  9. Dopo aver completato la fase di inizializzazione:
    1. Toccare [Run] sullo schermo e selezionare lo strumento di preparazione di libreria appropriata.
    2. Eseguire la scansione del codice a barre bidimensionale del chip.
    3. Inserire il chip di sequenziamento nella posizione appropriata.
    4. Chiudere lo sportello di morsetto e strumento di chip.
    5. Toccare [controllo Chip], [successivo] e [OK] sullo schermo per avviare l'esecuzione di sequenziamento.
  10. Dopo la reazione di sequenziamento, trasferire i dati ed eseguire analisi dei dati della pipeline sul sequenziamento server13,17.

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Risultati

La figura 1 Mostra l'intero processo, dalla preparazione campioni TIC per estrazione del DNA. In particolare, la procedura richiede solo due giorni per ottenere il DNA di genomic dai campioni di TIC. Abbiamo valutato tutti gli effetti di deposito del tumore prima dell'elaborazione di diapositiva. Abbiamo trovato che le cellule del tumore erano attaccate su lastra di vetro quando gli esemplari del tessuto sono stati toccati immediatamente il vetrino, e quando ...

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Discussione

In questo studio, abbiamo presentato un metodo alternativo per l'ottenimento del tumore del DNA da campioni patologici clinici utilizzando le TIC. Preparazione di TIC è molto semplice e richiede meno tempo rispetto ai metodi FFPE, senza la necessità di strumenti speciali10. Tutte le procedure dalla preparazione TIC per estrazione del DNA possono essere completate entro due giorni (Figura 1). Questo metodo riduce così il tempo di turnaround per test genetici. In partic...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo tutto il personale medico ed accessorio dell'ospedale e i pazienti per acconsentire a partecipare. Si ringrazia Gabrielle White Wolf, PhD, dal gruppo di Esposito (www.edanzediting.com/ac) per la modifica di un progetto di questa relazione. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione per il progetto di ricerca del genoma della Prefettura di Yamanashi (Y.H. e modus operandi) e una sovvenzione da The YASUDA Medical Foundation (YH).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
FINE FROST white20 micro vetrinoscorrevole Matsunami Glass ind, LtdSFF-011
Arcturus PEN Membrana vetriniThermo Fisher ScientificLCM0522
Cyto Quick A soluzioneMuto Pure Chemicals20571
Cyto Quick B soluzioneMuto Pure Chemicals20581
May-Grunwald SoluzioneMuto Pure Chemicals15053
Soluzione GiemsaMuto Pure Chemicals15002
Kit di tessuti QIAamp DNA FFPEQiagen56404
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557
Kit di reagenti per la rilevazione di RNasi P TaqManThermo Fisher Scientific4316831
TaqMan Assay da FFPE DNA QC Assay v2Thermo Fisher Scientific4324034
MicroAmp Piastra di reazione ottica veloce a 96 pozzetti Thermo Fisher Scientific4346907
Pellicola adesiva ottica MicroAmpThermo Fisher Scientific4311971
MicroMixer E36TITEC0027765-000
ViiA 7 Sistema PCR in tempo realeThermo Fisher ScientificVIIA7-03
Himac CF16RXIIHitachi-kokiCF16RII
Libreria ionica Kit di quantificazione TaqManThermo Fisher Scientific4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2Thermo Fisher Scientific4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermo Fisher Scientific4480442
Ion Xpress Adattatori per codici a barre 1-16 KitThermo Fisher Scientific4471250
Ion PGM Hi-Q View Kit di sequenziamento (200 base)Thermo Fisher ScientificA30044
Ion Chef SystemThermo Fisher Scientific4484177
Veriti 96-well Thermal CyclerThermo Fisher ScientificVeriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BCThermo Fisher Scientific4488150
Ion PGM SystemThermo Fisher ScientificPGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kitThermo Fisher ScientificA25591
Agencourt&commercio; AMPure&commercio; XP KitBeckman CoulterA63881
Supporto magnetico a 16 posizioniThermo Fisher Scientific4457858
Provette per microfuge antiaderenti prive di RNasi, 1,5 ml (provetta a basso legameThermo Fisher ScientificAM12450
Acqua priva di nucleasiThermo Fisher ScientificAM9938
MicroAmp& Piastre di reazione ottiche a 96 pozzettiThermo Fisher Scientific4306737
MicroAmp™ Pellicola adesiva trasparenteThermo Fisher Scientific4306311
Agencourt™ AMPure&commercio; XP KitBeckman CoulterA63881
Etanolo (99,5)Nacalai Tesque08948-25
Idrossido di sodio (10M)Sigma72068
DTU-NeoTAITEC0063286-000
E-36TAITEC0027765-000
ECLIPSE Ci-LNikon704354
Pipet-Lite LTS Pipetta Pipetta L-2XLS+METTLER TOLEDO17014393
Pipet-Lite LTS L-10XLS+METTLER TOLEDO17014388
Pipetta Pipet-Lite LTS L-20XLS+METTLER TOLEDO17014392
Pipetta Pipet-Lite LTS L-100XLS+METTLER TOLEDO17014384
Pipetta Pipet-Lite LTS L-200XLS+METTLER TOLEDO17014391
Pipetta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+METTLER TOLEDO17014382
petit-changeWAKENMODEL8864Mini centrifuga
petit-incubatorWAKENWKN-2290Incubatore ad aria
SensiCare Guanti da esame in nitrile senza polvere MEDLINESEM486802
Garza sterileOsaki11138
Frigorifero MediCoolSANYOMPR-312DCN-PJ
FEATHERFEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLADFEATHERNo.260
FEATHER SFEATHERFA-10
Vortex Genius 3IKA41-0458Miscelatore Vortex
PincetteNATSUMEA-5
microprovetta da 1,5 mLBIOBIKRC-0150
) FEATHER

Riferimenti

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