Articolo metodologico

Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

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DOI:

10.3791/56969

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28 agosto 2018

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1Department of Biochemistry, Purdue University

In questo articolo

Sommario

L'editing genomico mirato nel sistema modello Danio rerio (pesce zebra) notevolmente è stata facilitata dall'emergere di approcci basati su CRISPR. Qui, descriviamo un protocollo semplificato, robusto per la generazione e l'identificazione degli alleli di assurdità CRISPR-derivato che incorpora l'analisi di mobilità dell'eteroduplex e identificazione delle mutazioni mediante sequenziamento di nuova generazione.

Abstract

Caratterizzazione dei cluster, regolarmente intervallate, breve, palindromi ripetere (CRISPR) sistema di Streptococcus pyogenes ha consentito lo sviluppo di una piattaforma personalizzabile per generare velocemente le modifiche gene in un'ampia varietà di organismi, tra cui zebrafish. Editing basato su CRISPR genomico utilizza una sola guida RNA (sgRNA) per indirizzare un'endonucleasi CRISPR-collegata (Cas) ad un target di DNA (gDNA) genomica di interesse, dove l'endonucleasi Cas genera una rotture a doppio filamento (DSB). Riparazione di DSBs di piombo errori meccanismi per inserimenti e/o delezioni (indels). Ciò può causare mutazioni frameshift che spesso introducono un codone di stop prematuro all'interno la sequenza codificante, creando così un allele di proteina da null. Basato su CRISPR genoma ingegneria richiede solo pochi componenti molecolari e facilmente è stato introdotto negli embrioni di zebrafish di microiniezione. Questo protocollo descrive i metodi utilizzati per generare i reagenti CRISPR per il microinjection di zebrafish e identificare pesce espositrici trasmissione nella linea germinale dei geni CRISPR-modificato. Questi metodi includono trascrizione in vitro di sgRNAs, microiniezione di reagenti CRISPR, identificazione di indels indotto al sito di destinazione utilizzando un metodo basato su PCR chiamato un analisi di mobilità dell'eteroduplex (HMA) e la caratterizzazione dei indels utilizzando sia un basso rendimento e un potente sequenziamento di nuova generazione (NGS)-base di approccio che può analizzare i prodotti di PCR più raccolti da pesci eterozigoti. Questo protocollo è ottimizzato per ridurre al minimo il numero di pesci richiesto sia i tipi di attrezzature necessarie per eseguire le analisi. Inoltre, questo protocollo è progettato per essere favorevole per l'uso da personale di laboratorio di tutti i livelli di esperienza tra cui undergraduates, consentendo di questo potente strumento da impiegare economicamente da qualsiasi gruppo di ricerca interessato a condurre basati su CRISPR modifica genomica in zebrafish.

Introduzione

La conservazione di macchine molecolari attraverso eucarioti sottende il potere di utilizzare organismi modello per la ricerca. Molti di questi sistemi modello facilitare l'uso di approcci di genetica inversa come TNA knockouts genica mirata a caratterizzare il contributo di un prodotto del gene di un processo biologico o malattia di interesse. Tecniche di rottura del gene in organismi come zebrafish hanno storicamente invocata Introduzione mirata di mutazioni frameshift che derivano da riparazione imprecisa di DSBs1,2. Quando un DSB è stato introdotto nel genoma, la lesione del DNA è riparata attraverso una delle due vie che sono universalmente presenti in quasi tutti i tipi di cellule e organismi: non-omologo fine unirsi (NHEJ) e riparazione omologia-diretto (HDR)3,4 . L'imprecisione del macchinario NHEJ produce frequentemente indels di varie lunghezze5,6,7,8,9. Introduzione di mutazioni frameshift nella sequenza di codificazione di un gene in grado di produrre un codone di stop prematuro, che spesso rende il gene non funzionali.

Strategie di ingegneria genoma iniziali in zebrafish per promuovere indels includono meganucleases, nucleasi a dita di zinco e nucleasi di attivatore-come effettore trascrizione, tutti di cui utilizzato interazioni della DNA-proteina per impostare come destinazione una nucleasi a uno specifico genomica destinazione dove ha introdotto un DSB10,11,12,13,14,15. Tuttavia, queste tecnologie sono spesso difficili da applicare a causa la laboriosa e complessa ingegneria necessaria per generare una nucleasi che rivolge la sequenza di DNA di interesse. A differenza delle precedenti strategie, basate su CRISPR gene editing non si basa su interazioni proteina-DNA per il targeting. Invece, l'endonucleasi CRISPR-collegata (Cas) sono diretto tramite una guida di RNA che utilizza del nucleotide base pairing interazioni di destinare un sito genomico di interesse16,17,18,19 ,20,21. Grazie alla semplicità di progettazione di un RNA guida con la base desiderata interazioni per bersagliandola di accoppiamento è relativamente facile per indirizzare l'endonucleasi di Cas per il luogo desiderato. Il tipo sistema di II CRISPR in particolare è stato ampiamente sviluppato per applicazioni di editing del genoma a causa di diverse caratteristiche vantaggiose, compreso l'uso di una singola nucleasi Cas multidominio (Cas9) che richiede l'interazione con il DNA per stimolare attività endonucleasica e uso di una singola guida RNA (sgRNA) per scegliere come target e le cognate di sequenza di DNA18. I requisiti di sequenza necessari per il targeting del sgRNA cognata sono ben compreso19, e il sgRNA desiderato è facilmente generato da trascrizione in vitro . La semplicità e la robustezza dell'approccio CRISPR/Cas9 facilita enormemente la modificazione genetica mirata in zebrafish e una vasta gamma di altri organismi.

La maggiore capacità di intraprendere l'editing genomico mirato in zebrafish come risultato lo sviluppo di reagenti a base CRISPR ha significativamente aumentato la possibilità di studiare processi emblematici di organismi vertebrati come sviluppo del sistema nervoso centrale sistema. Il genoma di zebrafish contiene ortologhi del 70% dei geni codificanti per proteine trovati il genoma umano, nonché l'84% dei geni associati a malattie in esseri umani22. Zebrafish sviluppo esibisce parecchie qualità chiave che migliorano l'utilizzo in studi di genetica inverso: gli embrioni vengono deposte in grandi frizioni, sviluppano esternamente dalla madre che li rende suscettibili di genetica manipolazione di microiniezione e zebrafish adulto sessualmente maturi entro 3 mesi dell'età, permettendo per propagazione rapida di righe desiderate23.

Sono disponibili numerosi protocolli che descrivono una varietà di approcci per generare e identificare CRISPR-derivato indels in zebrafish24,25,26,27,28,29 ,30,31. Tuttavia, molte di queste procedure sono tempo intensivo, richiedono l'accesso all'apparecchiatura costosa e può essere difficile per i laboratori con limitata esperienza in campo. I passaggi descritti nel presente documento forniscono una semplice, robusta ed economica CRISPR/Cas9-strategia per ingegnere zebrafish knockout linee. Questo protocollo descrive l'uso di un kit altamente efficiente per sintetizzare sgRNAs usando i oligonucleotides del DNA (oligos), simile ad altri approcci che sono stati precedentemente descritto32. Il protocollo descritto include due passaggi in particolare che semplificano notevolmente l'analisi delle linee CRISPR-mutato: dettagliata uso della PCR-basata HMA33 determinare facilmente la presenza di modificazioni del genoma e l'analisi di sequenziamento di eterozigote zebrafish rapidamente e facilmente determinare la natura di più indels in modo economico. Inoltre, le istruzioni dettagliate sono incluse per selezione robusto, affidabile produzione e iniezione di guida RNAs. I passaggi descritti qui esemplificano un protocollo robusto, relativamente poco costoso che permette al personale di laboratorio con una gamma di competenze contribuire all'identificazione dei Ko del gene in zebrafish.

Protocollo

Questo studio è stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dal comitato di uso (numero di PACUC 31/08/11) e Purdue Animal Care.

1. progettazione dei Oligos specifiche dei modelli per la produzione di RNA Guida

  1. Seleziona la regione di destinazione di interesse per essere modificato nella regione codificante del gene. Questo dovrebbe essere vicino all'estremità 5' del gene a generare una proteina tronca, ma non così vicino che un codone di inizio di in-frame successivi consente la produzione di una proteina con un modesto troncamento del N-terminale.
    Nota: Un modo per escludere questa possibilità è per eseguire la scansione a valle regione codificante del gene per un frame in codone di inizio. Inoltre, utilizzando una guida RNA destinato al centro di un grande esone, consente di identificare gli iniettori di PCR per la segnatura successiva della indel risultante.
  2. Identificare potenziali siti di guida nella regione genomica di interesse utilizzando una guida selezione RNA programma (Vedi Tabella materiali)34,35,36. Impostare i dati del browser di Danio rerio e la sequenza di motivi adiacenti (PAM) protospacer a 5'-NGG-3 '.
    Nota: Ideale gRNA sequenze contengono un 5 ′-G nella prima posizione di gRNA per T7 efficiente trascrizione in vitro . Se nessuna guida accettabile viene trovata con una G nella posizione 5 ′, la base di 5 ' di un'altra guida può essere modificata per un G o un G possono essere aggiunti sull'estremità 5 ' della Guida al RNA, ma questo può ridurre l'efficienza di taglio37. Per massimizzare l'efficienza di taglio, una sequenza di guida ottimale ha contenuto di GC 40-80% (superiore è meglio) e contiene un G a 20° posizione, adiacente al PAM, ma non è obbligatorio38. Un esempio di una sequenza di destinazione ideale: 5 ′ - G (N)18 G-3 ′ - NGG (NGG è il PAM). Oltre ad analizzare i risultati dal programma di selezione di RNA guida per identificare ottima guida RNAs come descritto sopra, si dovrebbe prestare attenzione per evitare guida RNAs con probabili effetti fuori bersaglio forti che complicare notevolmente dell'analisi a valle. In particolare, guida RNAs con probabili effetti fuori bersaglio che rientrano nelle regioni codificanti dovrebbe essere esclusi, e i siti fuori bersaglio totali preveduti devono essere ridotto al minimo.
  3. Dall'output dello strumento Progettazione guida RNA, escludere la sequenza di PAM (5 ′-NGG-3 ′); esso non viene utilizzato per il targeting, ma comprende la sequenza di riconoscimento per la scissione Cas9.
  4. Per i restanti 20 nucleotidi (nts), aggiungere la sequenza del promotore T7 e la sequenza di sovrapposizione (regione complementare a un oligo di impalcatura usata per sintetizzare integrale sgRNAs fornito con il kit di trascrizione consigliati in vitro ) nell'ordine indicato qua sotto per ottenere un oligo nt 54: sequenza del promotore T7: 5 ′-TTCTAATACGACTCACTATA-3 '; Guida di RNA sequenza 5 ' - G (N)18 G-3 ′; Sequenza di sovrapposizione: 5 ′-GTTTTAGAGCTAGA-3 '
  5. Identificare gli iniettori di PCR che fiancheggiano il sito di taglio previsto (Cas9 fende 3 nt a Monte della sequenza PAM) ad una distanza di 50 – 150 paia di basi (bp) ogni dal taglio utilizzando software web-based (Vedi Tabella materiali).
    Nota: Questi saranno usati in un passaggio successivo per la misura di efficienza di taglio. Se nessun primer idonei vengono identificati utilizzando questi vincoli, potrebbe essere necessario considerare un altro sito di RNA di guida.
  6. Ordine di 54 oligonucleotidi di nt per produrre la guida primer di RNA e PCR per l'analisi dei siti di destinazione (Vedi Tabella materiali).
    Nota: Come un controllo positivo facoltativo, può essere utile per produrre un sgRNA un gene necessario per la produzione di pigmento per verificare le prestazioni del presente protocollo utilizzando un fenotipo visual facilmente ha ottenuto di targeting (vedere la Figura 1 per risultati rappresentativi). Un obiettivo comune è il gene della tirosinasi, utilizzando l'oligo (Guida sequenza di RNA è sottolineato)39: 5 ′-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3 '

2. preparazione del CRISPR-reagenti per il Microinjection di embrione

  1. Ordinare proteica Cas9 commercialmente disponibili (Vedi tabella materiali).
    Nota: Iniezione di Cas9 mRNA può anche essere utilizzato per generare indels in zebrafish40,41, tuttavia microiniezione di embrioni di zebrafish con Cas9 proteina ha dimostrato di essere più efficiente32,42.
    1. Sospendere la proteina Cas9 nel buffer fornito per generare una soluzione di 1 mg/mL. Conservare la soluzione in aliquote di iniezione-pronto in provette per PCR a-80 ° C per ridurre al minimo il numero di cicli di gelo-disgelo. Per generare un 5 µ l di soluzione iniezione, 2 µ l di 1 mg/mL Cas9 soluzione è utilizzata, pertanto il Cas9 può essere aliquotati in 2 aliquote µ l utilizzando striscia-provette per PCR.
  2. Sintetizzare il sgRNA utilizzando la trascrizione in vitro di sgRNA kit (Vedi Tabella materiali). Eseguire la trascrizione in vitro secondo le istruzioni del produttore.
    Nota: Mantenere la RNasi-free tecnica durante tutte le fasi di preparazione soluzione sintesi, clean-up e iniezione. Ad esempio, utilizzare guanti monouso e modificarli frequentemente, usare tubi e suggerimenti che sono certificate RNAsi-libere e pulite le superfici e le pipette con soluzioni disponibili in commercio per decontaminare labware (Vedi Tabella materiali).
  3. Purificare il sgRNA sintetizzato utilizzando una precipitazione di acetato di ammonio usando tecnica RNAsi-libera.
    Nota: In alternativa, sgRNAs può essere purificato usando una varietà di commercialmente disponibile basata su colonne RNA ripulire kit per un costo relativamente modesto.
    1. Aggiungere 25 µ l di acetato di ammonio di 5m e vortice a mescolare accuratamente.
      Nota: Soluzione di acetato di ammonio è disponibile in commercio (Vedi Tabella materiali), o una soluzione di 5 M può essere fatta in casa aggiungendo 385,4 mg di acetato di ammonio di grado molecolare a 1 mL di acqua RNAsi-libera e conservata a-20 ° C.
    2. Aggiungere 150 µ l di etanolo di nucleasi-free di prova di 200 per ogni campione. Luogo la reazione in un congelatore-80 ° C per un minimo di 20 min.
      Nota: I campioni possono essere conservati durante la notte a-80 ° C, ma non aumenterà in modo significativo il rendimento di RNA totale.
    3. Centrifugare i campioni alla massima velocità (> 16.000 x g) in una microcentrifuga di 4 ° C per 20 min.
    4. Rimuovere con attenzione il sovranatante pipettando lentamente il liquido, assicurando che la pallina del RNA non è disturbata.
    5. Aggiungere 1 mL di etanolo al 70% (creato diluendo privo di nucleasi di etanolo in acqua RNAsi-libera) e mescolare delicatamente il tubo capovolgendo più volte per lavare il residuo sale dal tubo.
    6. Ripetere il passaggio di centrifugazione per 7 min.
    7. Rimuovere il surnatante pipettando prima la maggior parte della soluzione utilizzando una pipetta P1000, quindi utilizzare una pipetta P200 per rimuovere quante più soluzioni possibili senza perturbare il pellet. A secco la pallina del RNA in uno spazio pulito, come una cappa a flusso laminare o da una banco superiore, facendo attenzione a evitare la contaminazione di RNasi, per 15 minuti o fino a quando nessun altro liquido gocce sono visibili nel tubo.
    8. Risospendere il pellet in 30 µ l di acqua RNAsi-libera, quantificare il prodotto (ad esempio utilizzando uno spettrofotometro) e aliquota la soluzione per l'archiviazione a lungo termine in un congelatore a-80 ° C.
      NOTE: Intervallo di concentrazioni tipiche da 800 – 2.500 ng / µ l.
  4. (OPZIONALE) Verificare che il full-length RNA è stato generato utilizzando urea/pagina. In alternativa, è possibile utilizzare un gel dell'agarosi per verificare se il RNA è intatto.
    Nota: Tuttavia, se utilizzando un gel dell'agarosi è necessario eseguire una maggiore quantità di gRNA visualizzare il RNA, e la lunghezza non può essere determinata con precisione. Quando si analizza l'efficienza di taglio di destinazione dopo l'iniezione di reagenti nel pesce, se c'è poca o nessuna taglio presente il sgRNA dovrebbe essere controllato per degradazione.
    1. Eseguire il cast di un gel di poliacrilammide di 8% in TBE con 40% poliacrilammide (19:1) e 8 M urea tecnica RNAsi-libera per le soluzioni e le attrezzature43.
      Nota: Materiali disponibili in commercio possono essere utilizzati per pulire l'attrezzatura (Vedi Tabella materiali).
    2. Dopo il gel è completamente solidificato (circa 30 min), equilibrare il gel inserendolo in TBE tampone di corsa e l'esecuzione di elettroforesi per 30 min a 5 V/cm.
    3. Mix 300 – 500 ng di sgRNA con un volume uguale di caricamento del gel di RNA: 2x tingere (Vedi Tabella materiali). Utilizza un P1000, cancellare i pozzi di eventuali detriti pipettando tampone di corsa in ogni bene diverse volte. Le soluzioni di caricare ed eseguire il gel a 10 V/cm per 2,5 h.
      Nota: Un marcatore lane qui è utile per visualizzare la lunghezza del RNA ma non è obbligatorio; generalmente è evidente se completo lunghezza RNA è stato sintetizzato (Figura 2).
    4. Visualizzare le bande utilizzando un acido nucleico macchia (Vedi Tabella materiali).
      Nota: sgRNA bande dovrebbero apparire come una singola banda, considerando che spalmando indica la degradazione di RNA (Figura 2).

3. microiniezione di CRISPR-componenti negli embrioni di Zebrafish

  1. Impostare allevamento serbatoi la notte prima dell'iniezione inserendo il numero desiderato di maschi e femmine (in genere 2 femmine e maschi di 1 o 2) in una vasca di allevamento con un divisore in posto44.
  2. Preparare una piastra di microiniezione con 1,5% di agarosio 1 x E3 Media (Vedi Tabella materiali) con blu di metilene di 0.01% (fungicida) da versare 35 mL di agarosio fuso in 10 cm di Petri e appoggialo delicatamente con una muffa di plastica per creare depressioni a forma di Cuneo nella soluzione, toccando lo stampo per eliminare bolle d'aria.
  3. Consentire l'agarosio impostare e memorizzare il piatto con una piccola quantità di supporti e avvolti in film di paraffina per evitare che la piastra secchino a 4 ° C.
    Nota: Piastre di iniezione sono riutilizzabili per diverse settimane, fino a quando i pozzi diventano deforme o secca, o la piastra comincia a crescere muffa.
  4. La mattina di stampaggio ad iniezione, scongelare sgRNA purificato e proteine Cas9 su ghiaccio. Ricordarsi di gestire tutti i materiali con i guanti per evitare la contaminazione di RNAsi e usare tubi e suggerimenti RNAsi-libera.
  5. Generare un 5 µ l di soluzione di iniezione combinando proteine Cas9 e sgRNA in un rapporto di 2:1 di Cas9:sgRNA per ottenere le concentrazioni finali di 400 pg/nL Cas9 proteina e 200 pg/nL sgRNA. Incubare la soluzione Cas9/sgRNA a temperatura ambiente per 5 minuti consentire il Cas9 e sgRNA formare un complesso ribonucleoproteico. Aggiungere 0,5 µ l di soluzione al 2,5% wt/vol rosso fenolo (Vedi Tabella materiali), e RNAsi-libera dell'acqua ad un volume finale di 5 µ l.
    Nota: La forza ionica della soluzione ha dimostrata di influenzare la solubilità della Cas9/sgRNA complesso, che pertanto l'aggiunta di KCl può aumentare l'efficienza di taglio di sgRNAs che presentano basso indel formazione28.
  6. Rendere un ago per iniezione tirando un bicchiere di 1,0 mm capillare con l'estrattore micropipetta. Tagliare la punta dell'ago appena fatto utilizzando un nuovo lama di rasoio o una pinza per ottenere un'apertura angolata che facilmente lesionare il corion e il sacco vitellino.
  7. Inserire l'ago in un micromanipolatore collegato a un microinjector con la fonte di aria attivata. Microscopio ottico utilizzando l'ingrandimento adatto per la calibrazione determinata per l'apparecchio in particolare, è necessario regolare la pressione di iniezione fino a quando l'ago costantemente espelle una 1 soluzione di nL in una capsula Petri riempito con olio minerale.
    Nota: La qualità dell'ago è critica. Prima di effettuare ulteriori esperimenti45è acquistata padronanza di pratica producendo un ago e iniettare il sacco vitellino di embrioni fino a quando si tratta di abilità.
  8. Rimuovere il divisore e permettono al pesce di razza per circa 15 min.
    Nota: Tempi più lunghi di allevamento produrrà più embrioni, tuttavia l'iniezione deve essere completata mentre gli embrioni sono nella fase 1-cella per massimizzare le possibilità che il taglio Cas9 si verificherà presto e quindi diminuzione mosaicismo genetico. Gli embrioni possono essere iniettati nelle fasi successive (2 – 4 fasi delle cellule), ma forse questo può diminuire la velocità di trasmissione di germline dell'allele modificata.
  9. Raccogliere le uova utilizzando un colino e sciacquateli in 10 cm di Petri utilizzando 1 x E3 media con blu di metilene di 0,0001%. Esaminare la salute delle uova sotto al microscopio ottico, rimuovendo eventuali uova non fertilizzate e detriti.
  10. Mettere da parte 10 – 15 embrioni come controllo in una capsula Petri separata, con etichetta uninjected.
  11. Utilizzando una pipetta di trasferimento, allineare delicatamente le uova sulla piastra iniezione riscaldato a temperatura ambiente.
  12. Sotto un microscopio di dissezione a 2,5 X ingrandimento, iniettare 1 nL della soluzione nel sacco vitellino di ogni embrione per iniettare un totale di 400 pg di proteina Cas9 e 200 pg di sgRNA.
    Nota: Per aumentare il taglio se necessario, aumentare la concentrazione finale della proteina di Cas9 a 800 pg/nL e di sgRNA a 400 pg/nL della soluzione di iniezione; Tuttavia, questo può anche aumentare il taglio fuori bersaglio e/o diminuire la salute dell'embrione. L'efficienza di taglio può essere aumentato anche iniettando direttamente il cellulare46. Tuttavia, iniezione nel sacco del tuorlo è tecnicamente meno esigenti e dà taglio sufficiente per produrre pesce con trasmissione nella linea germinale alta (> 70% della prole contenente un allele modificato).
  13. Tornare embrioni iniettati in una capsula Petri correttamente etichettati, coprirli con 1 x E3 media con blu di metilene e metterli in un incubatore di embrione impostato a 28 ° C.
  14. A 24 h dopo fertilizzazione (hpf), controllare la salute degli embrioni iniettati, rimozione di individui morti o in modo anomalo sviluppo e cambiare il supporto (Vedi Figura 3). Controllare il tasso di sopravvivenza contro il controllo uninjected.
    Nota: Quando un gene non essenziali, a meno di 10% letalità di targeting è previsto rispetto al controllo uninjected. Se si osservano i livelli elevati di mortalità nelle popolazioni iniettato di guida rispetto al controllo uninjected, può indicare che il gene bersaglio è essenziale per lo sviluppo, o gli effetti fuori bersaglio sono portano a sviluppo guasta. Riducendo la quantità di iniezione CRISPR-reagenti può essere necessario o generazione di un nuovo sgRNA con effetti ridotti fuori bersaglio può essere richiesto.
  15. Riporre gli embrioni nell'incubatore e continuare a crescere gli embrioni a 72 hpf, cambiando il media giornaliera per mantenere la salute dell'embrione.

4. analisi dell'efficienza di formazione di Indel utilizzando un HMA

  1. Raccogliere due insiemi di cinque embrioni dalle piastre iniettate cresciuto fino a 72 hpf in microcentrifuga e raccogliere una serie di cinque embrioni da un controllo uninjected.
  2. Anestetizzare gli embrioni con l'aggiunta di 0,004% MS-222 (tricaina) e attendere 2 min.
  3. Per estrarre il gDNA, delicatamente pipettare i media fuori ogni set di embrione e 45 µ l di NaOH di 50 mM. Incubare gli embrioni a 95 ° C per 10 min.
  4. Rimuovere gli embrioni dalla fonte di calore e raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere 5 µ l di 1 M Tris-HCl pH = 8 e vortexare vigorosamente i campioni (5 – 10 s). Centrifughi la soluzione a velocità massima (> 16.000 x g) in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 3 min. trasferire il surnatante in una provetta pulita, con etichetta e conservare il gDNA a-20 ° C del DNA per fino a 6 mesi.
    Nota: Frammenti del DNA di circa 900 bp e minore volontà essere generata attraverso l'uso di questo protocollo.
  5. Impostare una reazione di PCR µ l 50 utilizzando 2 µ l del gDNA preparato da ciascun campione (tra cui un controllo uninjected) seguendo le istruzioni incluse con la polimerasi, utilizzando i primers precedentemente progettati che fiancheggiano il sito di taglio previsto.
  6. Purificare la PCR prodotti utilizzando una PCR pulizia kit (Vedi Tabella materiali), eluire i campioni in 30 µ l di tampone di acqua o di eluizione e quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro.
  7. Reanneal tutti i 30 µ l di ciascun prodotto PCR purificato inserendo i tubi in un rack galleggiante in un bagno di acqua bollente (circa 150 mL in un becher da 500 mL). Dopo 3 minuti, spegnere la fonte di calore e consentire le soluzioni raffreddare a temperatura ambiente, circa 1 h.
    Nota: Questo passaggio prima denatura il DNA e quindi permette le ciocche per reanneal in modo casuale per generare possibili dell'eteroduplex bande o DNA double-strand non corrispondente che contiene polimorfismi creato da CRISPR-mutagenesi e quindi hanno un'alterata mobilità elettroforetica rispetto al omoduplici. L'ultimo ciclo di PCR o programma di rampa-down nel termociclatore utilizzabile anche per reanneal prodotti47,48, ma uso del bagno bollente può produrre una migliore risoluzione dei prodotti dell'eteroduplex.
  8. Aggiungere 5 µ l di 6x loading dye (Vedi Tabella materiali) per le soluzioni PCR reannealed.
  9. Eseguire il cast un gel di poliacrilammide/TBE 15% utilizzando 30% poliacrilammide (29: 1). Dopo il gel ha impostato, è necessario inserirlo in un apparecchio di elettroforesi con tampone di corsa TBE. Utilizzando un P1000, deselezionare i pozzi di eventuali detriti come sali residui o gel frammenti che possono ostruire i pozzetti pipettando delicatamente buffer su e giù nei pozzetti più volte.
  10. Carico 500 ng di reannealed prodotti di PCR e carico un controllo (esempio da pesce uninjected) accanto a ciascun set di campioni sgRNA. Esegua il gel a 150 V per 2,5 h o fino a quando la parte anteriore della tintura è nella parte inferiore del gel.
  11. Visualizzare le bande usando una macchia di acido nucleico (ad es., il bromuro di etidio o SYBR green (Vedi Tabella materiali)).
  12. Esaminare il modello di band per ogni controllo e iniettato CRISPR pool di embrioni.
    Nota: L'aspetto di più bande che eseguito più lentamente nell'iniettato contro uninjected corsie indica la formazione di prodotti di romanzo dell'eteroduplex (Figura 4). La presenza di romanzo dell'eteroduplex DNA indica che indels sono stati generati tramite l'iniezione di CRISPR. Riduzione dell'intensità di banda omoduplex nelle soluzioni iniettate di circa il 50% o maggiore è generalmente sufficiente a provocare la trasmissione nella linea germinale sufficiente. Inoltre, bande supplementari sono a volte identificati nel pesce uninjected e non dovrebbero essere considerati bande dell'eteroduplex quando osservato nel pesce iniettato.
  13. Scegliere le iniezioni con efficienze di taglio più alte rispetto al controllo uninjected per ogni destinazione; gli embrioni da queste iniezioni possono essere utilizzati per crescere pesci per cercare indels causando codoni di stop prematuri.
    Nota: Per il taglio altamente efficiente (riduzione della banda omoduplex di circa > 50% di intensità), 20 – 30 pesci adulti di screening dovrebbe essere sufficiente per ottenere la trasmissione nella linea germinale.
    Per sgRNAs che generano meno taglio, pesci più adulti possono essere necessaria per aumentare la probabilità di individuare i pesci che presentano la trasmissione nella linea germinale di alleli modificati contenente un codone di stop prematuro. Se indel formazione non è osservata può essere necessario riprogettare la sgRNA a una diversa regione del gene. Se nessuna formazione di banda dell'eteroduplex è osservata, la sgRNA può hanno degradato, e la qualità di sgRNA dovrebbe essere verificata utilizzando un gel di urea/pagina.

5. identificazione e propagazione delle linee di Knock-out

  1. Per identificare un potenziale pesce padre fondatore, eseguire clip coda di pesce adulto F0 (cresciuto fino a circa 2,5-3 mesi) per identificare la presenza di indels. Anestetizzare il pesce in 0,62 mM tricaina (Vedi Tabella materiali), quindi utilizzare una lama di rasoio affilata, pulita per rimuovere circa 1/2-3/4 della pinna caudale.
  2. Posizionare la coda in 45 µ l di NaOH di 50 mM e restituire il pesce ad un serbatoio di recupero. Eseguire l'estrazione gDNA come descritti (passi 4.2 – 4,4). Una volta che il pesce viene riattivato il comportamento normale di nuoto, riposizionare il pesce sul fluire acqua sistema finché non viene identificata la natura della indel.
    Nota: È fondamentale per garantire che i singoli pesci sono identificabili e possono essere abbinati in modo appropriato i risultati delle clip coda.
  3. Come descritto (passaggi 4.5 – 4,9), eseguire un HMA gDNA la clip coda per determinare se il pesce è stato modificato tramite l'iniezione di CRISPR (Figura 5). Per identificare un pesce fondatore, allevare gli adulti che presentano bande dell'eteroduplex da gDNA coda di pesce selvaggio-tipo. Raccogliere gli embrioni e farle crescere a 72 hpf.
  4. A 72 hpf, raccogliere 10 embrioni e posizionare ogni embrione in un singolo tubo. Eseguire un'estrazione gDNA come descritto sopra (punti 4.2 – 4,4) utilizzando 11.25 µ l di NaOH di 50 mM e 1.25 µ l di 1 M Tris pH = 8.
  5. Ripetere la PCR ed elettroforesi individuare bande dell'eteroduplex come descritto sopra (passaggi 4.7 – 4,13) per determinare se indel alleli sono stati passati questa generazione (Figura 6).
  6. Basato sulla trasmissione percentuale osservata in embrioni singoli usando l'HMA, crescere una media di 20 – 30 embrioni ottenuti dalla croce per ogni CRISPR-linee di interesse all'età adulta.
    Nota: Questo numero può essere aumentato o diminuito a seconda della frequenza di trasmissione nella linea germinale.
  7. Eseguire i clip di coda di pesce adulto F1 per identificare la presenza di indels come descritti (passi 5.1 – 5.2). Come descritto (passaggi 4.5 – 4,11), eseguire un HMA gDNA la clip coda per determinare se il pesce trasporta un indel (Figura 7).
  8. Per i pesci che contengono una banda dell'eteroduplex, preparare il DNA per l'analisi di sequenziamento.
    1. Eseguire PCR utilizzando nuovi primer per amplificare un prodotto di PCR di 300 – 600 bp centrata intorno al sito di taglio.
    2. Utilizzare un kit di purificazione di PCR per ripulire il DNA ed eluire in 30 µ l. esaminare il DNA su un gel di agarosio per garantire una banda singola è presente.
      Nota: Alcune bande di eteroduplex possono essere presenti su gel di agarosio e appare come un piccolo striscio o doppia banda appena sopra il prodotto di PCR presso la dimensione prevista.
  9. I prodotti di PCR utilizzando Sanger di sequenza se vengono analizzati da uno a tre indels, sequenziamento e determinare la sequenza di indel utilizzando un tool di bioinformatica49. In caso contrario, la determinazione della sequenza di più prodotti PCR usando l'analisi di NGS (Vedi Tabella materiali) sono più economico.
  10. Determinare se un codone di stop prematuro è stato ottenuto analizzando la sequenza utilizzando uno strumento di bioinformatica (Vedi Tabella materiali).
  11. Mettere il pesce contenente desiderato allele del mutante in un nuovo serbatoio con etichette appropriate.
  12. Gli iniettori di PCR per indel specifici alleli per genotipizzazione future esigenze di design. Questi iniettori dovrebbero estendersi la sequenza mutata e non amplificare la sequenza wild-type.
  13. In croce eterozigote zebrafish per generare una popolazione segregating che conterrà linee di knock-out del 25%.

Risultati

Gli approcci sperimentali descritti nel presente protocollo consentono una produzione efficiente e conveniente di zebrafish knock-out linee utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9. Le figure seguenti sono state incluse in questo articolo per facilitare l'interpretazione e la risoluzione dei problemi dei risultati ottenuti utilizzando questo protocollo. Dopo il successo della produzione e microiniezione di CRISPR-reagenti, gli embrioni di zebrafish possono essere analizzati per fenotipi palesi e per formazione di indel utilizzando HMA. Un controllo utile per visualizzare il successo dell'esperimento della CRISPR è l'uso di sgRNA descritto nel passaggio 1.5 per indirizzare il gene produttrici di pigmento tirosinasi. Formazione di indel indotta da Cas9 a tirosinasi si traduce in perdita di pigmentazione e facilmente è segnato da 48 hpf (Figura 1). Un altro utile controllo affinché la preparazione dei CRISPR-reagenti per iniezione ha avuto successo, è quello di verificare che Full-Length (120 nt) sgRNA è stato sintetizzato utilizzando un gel di poliacrilammide denaturante (Figura 2, Lane 1 e 2). Se il RNA è stato degradato potrebbe apparire come una sbavatura, ad esempio Lane 3 (Figura 2) Mostra RNA degradato che non è adatto per l'iniezione.

Per analizzare la frequenza di formazione di indel di geni presi di mira da CRISPR-Cas9 che non si traducono in fenotipi evidenti quali tirosinasi, HMA analisi è un metodo semplice e affidabile. sgRNA/Cas9 embrioni iniettati analizzati usando HMA risultati nella formazione di bande dell'eteroduplex e riduzione dell'intensità della banda omoduplex (Figura 4). La presenza di bande dell'eteroduplex è ulteriormente utilizzata nel presente protocollo per identificare potenziali fondatore pesce da embrioni iniettati e come adulti (Figura 4 e Figura 5), per analizzare l'efficienza di trasmissione germinale di un fondatore ( Figura 6) e per verificare la presenza di un indel in un pesce di F1 eterozigote (Figura 7). I pesci eterozigoti che contengono un indel sono candidati per NGS per identificare la natura della indel e per determinare se un codone di stop prematuro è presente nella regione codificante del gene target.

figure-results-1
Figura 1 : Embrioni di Zebrafish presentano un difetto di pigmento quando iniettato con un sgRNA targeting tirosinasi nella fase uno-cell. Uninjected (A) Wild-type, embrione alle 48 hpf e (B) iniettato embrione alle 48 hpf. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2 : Trascrizione in vitro di sgRNA utilizzando sintesi kit. I oligos sono stati sintetizzati utilizzando trascrizione in vitro secondo le istruzioni del kit di sintesi sgRNA. 500 ng di RNA è stato eseguito su un gel di urea/pagina come descritto. sgRNA caricato nelle corsie 1 e 2 viene illustrata una fascia corrispondente per l'intera lunghezza, intatto 120 nt RNA. Il sgRNA in vicolo 3 Mostra un campione di RNA degradato che non è adatto per l'iniezione.

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Figura 3 : Confronto della salute del 24 embrioni iniettati hpf. Un embrione vivente (A) sviluppato a 24 hpf, è facilmente distinguibile da un embrione che ha interrotto lo sviluppo (B). Gli embrioni che assomigliano a (B) o che hanno drasticamente alterato funzioni per (A), come la curvatura spinale o alterato testa e lo sviluppo dell'occhio dovrebbe essere rimosso dal piatto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4 : Analisi di mobilità dell'eteroduplex di sgRNA-Cas9 microiniettati embrioni di zebrafish. Piscine di 5 embrioni per esempio sono stati raccolti a 72 hpf e gDNA è stata estratta. L'analisi dell'eteroduplex è stata eseguita come descritto, i campioni sono stati caricati ugualmente con 500 ng di DNA. Corsie: M = 100 bp segnapunti; 1 = controllo uninjected; 2 = iniezione campione 1; 3 = iniezione campione 2. Banda dimensioni attese = 98 bp.

figure-results-5
Figura 5 : Analisi di mobilità dell'eteroduplex di gDNA estratta dalla coda di un adulto CRISPR-iniettato zebrafish. Gli embrioni che sono stati iniettati con un sgRNA e Cas9 della proteina sono stati coltivati fino all'età adulta (3 mesi). Pesce B e C presentano bande dell'eteroduplex e successivamente sono stati allevati per identificare indels germline trasmessi; pesce A non è stato usato in analisi successiva perché non presenta una banda positiva dell'eteroduplex. Corsie: 1 = controllo di selvaggio-tipo; 2 = pesce A; 3 = pesce B; 4 = pesce C. previsto la taglia = 98 BP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6 : Analisi di mobilità dell'eteroduplex di singoli embrioni generati da allevamento un zebrafish CRISPR F0-iniettato ad un pesce selvaggio-tipo per identificare germline trasmessi indels. Zebrafish sono stati accoppiati e sono stati raccolti gli embrioni di F1 coltivati per embrioni singolo h. 72 e l'analisi dell'eteroduplex eseguita come descritto. Corsie: 1 = controllo di selvaggio-tipo; 2-10 = un singolo embrione di F1 per corsia. Questo gel viene illustrato che 7 su 10 embrioni mostrano una banda positiva dell'eteroduplex, che indica la velocità di trasmissione germinale del 70% la indel. Banda dimensioni attese = 98 BP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7 : Analisi di mobilità dell'eteroduplex di videoclip per adulti F1 zebrafish coda. Pesci adulti di F1 sono stati segnati da HMA per identificare indels. Pesce che ha esibito una banda positiva dell'eteroduplex erano PCR amplificato e sottoposti ad analisi di sequenziamento ampia per determinare la natura della mutazione. Corsie (A): 1 = controllo di selvaggio-tipo; 2 = pesce (4 bp delezione, 1 mancata corrispondenza di bp). (B) questi F1 pesce sono stati identificati dal fondatore stesso e ancora mostrare differenti dell'eteroduplex patterning, che indica la trasmissione nella linea germinale di alleli multipli modificati da un singolo fondatore. Corsie: 1 = controllo di selvaggio-tipo; 2 = pesce B (mancata corrispondenza di bp 7, 4 bp inserimento), 3 = pesce C (omissione di bp 4, 4 bp mancata corrispondenza). Ciascuno di questi indels creato un codone di stop prematuro nella sequenza di codificazione del gene dell'obiettivo, come determinato da NGS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo descrive la produzione di knockout del gene nel sistema modello vertebrati zebrafish utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Un numero di protocolli precedentemente è state descritte per intraprendere ingegneria CRISPR-mediata del genoma in zebrafish15,25,26,50,51,52. Questo protocollo si basa su precedenti sforzi combinando una serie di tecniche sperimentali semplici ma riproducibile coerente, in particolare HMA e NGS di più pesci eterozigoti, per creare un semplice, economico e sperimentalmente robusto protocollo per mutagenesi CRISPR-mediata in zebrafish che è adatto per i laboratori con personale con una gamma di esperienza e formazione, nonché a laboratori didattici.

Consigli per la progettazione e sintesi di guida che RNAs sono inclusi in questo protocollo. Una considerazione importante nella Guida di progettazione di RNA è la minimizzazione degli effetti fuori bersaglio. Diversi algoritmi di previsione sono stati sviluppati per consentire CRISPR-agli utenti di accedere agli strumenti di calcolo con facile da usare interfacce grafiche che consentono di stimare sia l'attività della guida sulla destinazione e la possibilità di effetti fuori bersaglio34, 35,36. Un vantaggio specifico del sistema zebrafish è abbassato i tassi di effetti fuori bersaglio perché la Cas9 è iniettato in embrioni e quindi espressione è transitoria, che ha dimostrato nei topi per provocare una riduzione fuori bersaglio effetti53. Tuttavia, sono stati dimostrati effetti fuori bersaglio per accadere in zebrafish54. Un modo per controllo per effetti fuori bersaglio è a fenotipo fondatore zebrafish che sono stati generati da due RNA guida indipendente che utilizzano lo stesso gene, in quanto queste guide sarebbe molto probabile che influiscono su diversi siti fuori bersaglio. Un metodo alternativo per ridurre al minimo gli effetti fuori bersaglio che non è descritto in questo protocollo è l'utilizzo di un mutato Cas9 che genera rotture del singolo filo al bersaglio del DNA, che sono riparate con alta efficienza. Abbinamento del DNA Nick nelle immediate vicinanze di un altro che sono complementari all'opposto strands risultati nella formazione di indel efficace al luogo desiderato e minimizza gli effetti fuori bersaglio55,56.

Oltre ad avere diversi tassi di effetti fuori bersaglio, sgRNAs diversi possono avere diversi tassi di mutagenesi del target desiderato57,58,59. Questo protocollo utilizza HMA per analizzare l'efficienza di mutagenesi di un determinato sgRNA utilizzando dell'eteroduplex band formazione33,40. Bande dell'eteroduplex vengono creati tramite l'ibridazione di filamenti di DNA PCR-generato che contengono disadattamento e può essere facilmente risolto utilizzando l'elettroforesi del gel. A differenza di altri metodi comunemente usati per misurare indel formazione, quali le endonucleasi T7 dosaggio o alta risoluzione sciogliere analisi25,26, HMA non richiede un enzima costoso per tagliare il DNA non corrispondente e non richiede complicate analisi di PCR si fondono le curve. Soprattutto, anche utilizzando HMA per verificare i tassi alti di indel formazione nella popolazione iniettata consente al ricercatore di ridurre al minimo il numero di pesci necessari per la successiva produzione di linee di knock-out, che riduce il costo di identificazione di una mutazione con il caratteristiche desiderate.

La relativa facilità di generazione basato su CRISPR indels consente la creazione di alleli multipli di geni multipli in una sola volta. Software web-based è disponibile per l'analisi delle singole mutazioni eterozigoti pesce utilizzando Sanger sequenziamento di prodotti PCR49. Nel caso in cui sono analizzati tre o più alleli mutati CRISPR, NGS per caratterizzare la natura della indel è probabilmente più efficace in termini di costo per caratterizzare la natura di indel come questo approccio consente un pool di fino a 50 diversi alleli per essere caratterizzato in o NCE (Vedi Tabella materiali)60,61,62. Tale economia di scala probabilmente sarebbe particolarmente utile in un ambiente di laboratorio dello studente non laureato.

In sintesi, questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la generazione riproducibile CRISPR-reagenti di alta qualità (in particolare, sgRNA) tale che un minor numero di pesci adulti devono essere creati e analizzati per identificare con successo gli alleli del mutante di interesse, che riduce anche il tempo e il costo di generare le righe desiderate. D'importanza, questo protocollo è stato progettato tali che può essere applicato dai laboratori con risorse limitate per la produzione di zebrafish mutanti in maniera conveniente. Inoltre, abbiamo trovato che questo approccio è adatto per gli studenti universitari e così si espande le opportunità di istruzione e formazione di studenti universitari interessati a un'esperienza pratica in editing basato su CRISPR genomico.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R21CA182197 di J.O.), il Ralph W. e Grace M. Showalter Research Trust e dal Purdue scienze agrarie ed estensione per il programma di sviluppo economico (AgSEED). Dati di sequenziamento Sanger sono stati acquisiti da parte dell'impianto di Purdue Genomics Core supportati da P30 CA023168. Mary Witucki è stata sostenuta dal Purdue University Center per cancro ricerca estate Undergraduate Research programma supportato dalla Carroll County Cancer Association. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno di studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Ringraziamo Benjamin Carter, Ellen Denning e Taylor Sabato per fornire un feedback critico sul manoscritto. Ringraziamo il dipartimento di biochimica per il supporto di questo lavoro e il centro di ricerca di Zebrafish presso la Purdue University per la loro dedizione nella cura e nel benessere della nostra colonia di zebrafish. Infine, ringraziamo il Core genomica di Purdue e contributi di Phillip San Miguel per quanto riguarda i servizi NGS.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Software di analisi sgRNA CRISPOR. Software di
analisi sgRNABreaking-Cas
Software di analisi sgRNAChopChop
Primer 3PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
senza RNasihttp://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
acqua priva di RNasiQualsiasi marcaSintesi di RNA guida. Thermo Fisher e Qiagen trasportano entrambi acqua adatta.
Etanolo privo di RNASIQualsiasi marcaL'etanolo di grado di biologia molecolare è privo di Rnasi. Fischer, VWR vendono etanolo adatto.
Proteina Cas9PNA BioCP01Proteina Cas9 con segnale di localizzazione nucleare.
Targeting specifici di oligoIntegrated DNA Technologies (IDT)Sintetizzare RNA guida.
Primer PCR che fiancheggiano la guida Sito di taglio dell'RNATecnologie del DNA integrate (IDT)Utilizzo per analisi eteroduplex, prodotto da 100-300 bp.
Primer PCR che affiancano la guida Sito di taglio dell'RNATecnologie DNA integrate (IDT)Da utilizzare per il sequenziamento degli alleli CRISPR, prodotto consigliato da 300-600 bp.
Kit di sintesi EnGen sgRNANew England BioLabsE3322RNA guida per la trascrizione in vitro.
10X TBEThermo FisherB52Tampone privo di RNasi per l'elettroforesi degli acidi nucleici.
6X Carico ColoranteNew England BioLabsB7025SCaricamento DNA per elettroferesi.
5M Acetato di ammonioThermo FisherAM9071Reagente di pulizia per la purificazione degli RNA guida.
Etanolo (200 proof, senza nucleasi)Qualsiasi marcaReagente per la pulizia per la purificazione degli RNA guida. I materiali di grado molecolare sono privi di RNasi.
Acqua senza nucleasiQualsiasi marcaPer la sintesi e la purificazione di RNA guida.
ThermoFisher10328011elimina la contaminazione da RNasi da superfici, attrezzature, vetreria.
Scala del DNA, 100 bpNew England BioLabsN0467SStandard di peso molecolare per l'elettroforesi su gel del DNA.
Scala del DNA, 1 kbNew England BioLabsN0552SStandard di peso molecolare per l'elettroforesi su gel del DNA.
Scala di RNANew England BioLabsN0364SMarcatore di RNA a singolo filamento per verificare che l'intero sgRNA sia stato sintetizzato
TEMEDThermo Fisher17919Casting in gel di poliacrilammide.
Persolfato di ammonio (APS)Sigma-AldrichA3678Fusione di gel di poliacrilammide.
40% Poliacrilammide (19:1)BioRad161-0154Fusione di gel di poliacrilammide denaturante.
UreaSigma-AldrichU5378-100GFusione di gel di poliacrilammide denaturante.
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo FisherR0641Guida di caricamento dell'RNA su gel denaturante per elettroforesi.
Bromuro di etidioSigma-AldrichE1510-10MLVisualizzazione degli acidi nucleici.
SYBER GreenThermo FisherS7563Metodo alternativo al bromuro di etidio per la rilevazione del dsDNA in gel di agarosio o poliacrilammide.
MicrocentrifugaEppendorf5424Pulizia dell'RNA, purificazione PCR.
MyTaq PolimerasiBiolineBIO-21105Per l'amplificazione del DNA mediante PCR.
ThermocyclerAmplificazione PCRdi qualsiasi marca
SpettrofotometroQualsiasi marcaNanoDrop o prodotto correlato per quantificare la quantità di DNA/RNA.
Terreni embrionaliE3 Terreni realizzati in casaper l'allevamento di embrioni e la produzione di piastre di iniezione. Ricetta: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Metilene BlueSigma-AldrichM9140Aggiunto a 1x terreno E3 per prevenire la crescita fungina sugli embrioni.
Piastra di PetriThermo FisherFB0875711ZConservare gli embrioni, piastra di iniezione fusa.
AgarosioDenvilleCA3510-8Piastra di iniezione per fusione, gel di agarosio.
Stampo per microineccitazioneStrumenti di scienza adattivaTU-1Per creare pozzetti per trattenere gli embrioni durante l'iniezione.
Rosso fenoloSigma-AldrichP0290 Colorante per la visualizzazione dell'iniezione.
Olio mineraleSigma-AldrichM5904-5MLPer calibrare il volume di iniezione dell'ago.
Pipette di trasferimento QualsiasimarcaMoving embryos.
Lama di rasoioThermo Fisher11295-10Taglio dell'ago per iniezione, taglio della coda di pesce adulto.
IncubatriceQualsiasi marcaMantenimento degli embrioni a 28,5 oC.
Estrattore per pipette VerticleDavid Kopf Instruments700CGeneate aghi per iniezione. Istruzioni aggiuntive per l'estrazione dell'ago: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
Tubi capillariSutter InstrumentsBF100-58-10Geneate aghi per iniezione.
Punte per microloaderEppendorf930001007Caricare la soluzione negli aghi per iniezione.
MicroiniettoreWorld Precision InstrumentsPV 820Iniezione di embrioni.
Microscopio dissezionatoreLeicaIniezione di embrioni.
30% Poliacilammide (29:1)BioRad161-0156Colata di gel eteroduplex.
MS-222 (Tricaina)Sigma-AldrichA-5040Anestetizzare il pesce zebra per il taglio della coda e l'estrazione di gDNA da embrioni. Ricetta: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
MicroondeQualsiasi marcaPiastra di iniezione per colata, gel di agarosio.
ScalaQualsiasi marcaPiastra di iniezione per colata, gel di agarosio.
GuantiQualsiasi marcaPer tutti gli aspetti del protocollo.
N2Qualsiasi marcaPer espellere il liquido dal capillare per l'iniezione di embrioni.
1.000 µ L  suggerimentiQualsiasi marcaPer tutti gli aspetti del protocollo.
200 µ L tipsQualsiasi marcaPer tutti gli aspetti del protocollo.
10 µ L tipsQualsiasi marcaPer tutti gli aspetti del protocollo.
Provette per strisce PCRQualsiasi marcaPer tutti gli aspetti del protocollo.
Micropipettedi qualsiasi marcaPer tutti gli aspetti del protocollo.
Piattaforma di sequenziamento NGS: WideseqSe il tuo istituto non offre questo servizio, visita: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (costo esterno: $ 35).
Software per l'analisi di sequenzePer il sequenziamento Sanger di pesci eterozigoti. Visita: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Software per l'analisidelle sequenze SnapGene Viewer, Sequence Scanner per l'analisi del sequenziamento NGS.
http://crispor.tefor.net/ . https://omictools.com/breaking-cas-tool. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/Tecnica .

Riferimenti

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