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Articolo metodologico

Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

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DOI:

10.3791/56973

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8 maggio 2018

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1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo la metodologia per l'analisi clonale di cellule staminali ematopoietiche precursori durante lo sviluppo embrionale murino. Combiniamo Indice ordinamento delle singole cellule della regione di aorta-gonade-Mesonefro embrionale con co-coltura delle cellule endoteliali e trapianto per caratterizzare le proprietà fenotipiche e potenziale di attecchimento dei precursori ematopoietici singoli.

Abstract

La capacità di studiare la genesi di cellule staminali ematopoietiche (HSC) durante lo sviluppo embrionale è stata limitata dalla rarità dei precursori HSC nell'embrione precoce e la mancanza di saggi che funzionalmente identificare il potenziale di multilineage attecchimento a lungo termine di individuali presunti precursori HSC. Qui, descriviamo la metodologia che consente l'isolamento e la caratterizzazione dei precursori HSC funzionalmente validati a livello di singola cellula. In primo luogo, utilizziamo Indice ordinamento per catalogare il parametro fenotipico preciso di ciascuna cella individualmente ordinato, utilizzando una combinazione di marcatori fenotipici arricchire per precursori HSC con ulteriori indicatori per l'analisi sperimentale. In secondo luogo, è co-coltivata con lo stroma vascolare nicchia dalla regione dell'aorta-gonade-mesonephros (AGM), che sostiene la maturazione dei precursori HSC-di capacità di integrazione funzionale HSC con attecchimento multilineare, a lungo termine potenziale in ogni cella di indice ordinato saggi di trapianto. Questa metodologia consente la correlazione di proprietà fenotipiche dei precursori hemogenic clonale con il loro potenziale di attecchimento funzionale o altre proprietà quali profilo trascrizionale, fornendo un mezzo per l'analisi dettagliata del precursore HSC sviluppo a livello di singola cellula.

Introduzione

Clonali studi hanno rivelato eterogeneità nelle proprietà dell'attecchimento a lungo termine di HSCs adulto, fornendo informazioni nuovi sottotipi di HSC e cambiamenti nel comportamento HSC durante invecchiamento1. Tuttavia, studi simili di HSCs embrionali e loro precursori sono stati più impegnativo. Durante lo sviluppo embrionale precoce, HSCs derivano da una popolazione di precursori noto come endotelio hemogenic in un processo transitorio di cui al come l'endoteliale a transizione ematopoietiche2. Il primo HSC, definiti dalla loro capacità di fornire attecchimento multilineare robusto, a lungo termine dopo trapianto in destinatari adulti condizionati, non vengono rilevati fino a dopo giorno embrionale 10.5 (e 10.5) nell'embrione murino, a bassissima frequenza3 . Durante il loro sviluppo, precursori di HSC (pre-HSC) derivanti dall'endotelio hemogenic devono essere sottoposti a maturazione prima di acquisire la proprietà di HSC adulto che consentono per efficiente attecchimento nel trapianto saggi4,5 , 6. oscurando lo studio rari HSC origine, una moltitudine di progenitori ematopoietici con degli eritrociti, mieloidi e linfoidi potenziale sono già individuati prima l'emergere di HSC da pre-HSC7,8. Così, distinguendo pre-HSC da altri progenitori ematopoietici richiede metodi clonally isolare cellule e fornire loro i segnali sufficienti per la loro maturazione per HSC, per rilevare le loro proprietà di attecchimento in saggi di trapianto.

È state descritte una serie di approcci che consentono il rilevamento di pre-HSC di maturazione sia ex vivo o in vivo di HSC. Ex vivo metodi hanno dipendeva da coltura di tessuti embrionali, come la regione AGM, dove il primo HSC vengono rilevati in sviluppo9. Sulla base di questi metodi, protocolli che incorporano la dissociazione, l'ordinamento e ri-aggregazione dei tessuti AGM hanno permesso la caratterizzazione delle popolazioni ordinati contenenti precursori di HSC durante lo sviluppo da E9.5 per E11.5 in para-aortica Splanchnopleura (P-Sp) / AGM regioni4,5,10; Tuttavia, questi approcci non sono suscettibili di analisi di alto-rendimento dei precursori a livello di singola cellula necessari per l'analisi clonale. Allo stesso modo, maturazione in vivo da trapianto in topi neonati, dove il microambiente è presunta per essere più adatto per il supporto delle precedenti fasi di precursori HSC, ha permesso anche gli studi delle popolazioni ordinati dal sacco vitellino e AGM / P-Sp (P-Sp è la regione di precursore per l'AGM) con caratteristiche di pre-HSC, ma questi metodi anche non riescono a fornire una piattaforma robusta per singola cella analisi11,12.

Gli studi da Rienzi et al hanno dimostrato che quello stroma Akt-attivata delle cellule endoteliali (EC) può fornire un substrato di nicchia per il supporto dell'adulto HSC auto-rinnovamento in vitro13,14,15. Abbiamo recentemente hanno determinato che la CE Akt attivato derivato dalla regione AGM (AGM-CE) fornisce una nicchia adatta in vitro per la maturazione dei precursori hemogenic, isolato più presto E9 in sviluppo, per HSC adulto-capacità di integrazione, così come la successiva auto-rinnovamento di generato HSC16. Dato che questo sistema utilizza una semplice 2-dimensionale co-coltura, è facilmente adattabile per analisi clonale del potenziale HSC di precursori hemogenic individualmente isolato.

Recentemente abbiamo segnalato un approccio di saggiare le potenzialità HSC di precursori hemogenic clonale combinando Indice ordinamento dei precursori hemogenic individuali da embrioni murini con AGM-CE co-cultura e successiva analisi funzionale nel trapianto analisi di17. Indice di ordinamento è una modalità di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) che registra (indici) tutti i parametri fenotipici (cioè, parametri di forward scatter (FSC-A), side scatter (SSC-A), fluorescenza) di ciascuna cella individualmente ordinato tale che questi caratteristiche possono essere correlati in modo retrospettivo per successiva analisi funzionale seguendo l'ordinamento. FACS software registra sia informazioni fenotipiche per ogni cella e la posizione/pozzetto della piastra 96 pozzetti in cui è stato disposto. Questa tecnica è stata utilizzata precedentemente elegantemente per identificare eterogeneità nell'adulto HSC, determinare parametri fenotipici che ulteriormente arricchiscono per il sottoinsieme di attecchimento a lungo termine di HSC e correlano parametri fenotipici di HSC con trascrizionale Proprietà presso la singola cella livello18,19. Qui, forniamo metodologia dettagliata di questo approccio che consente l'identificazione di parametri univoci fenotipici e contributi di lignaggio di pre-HSC durante le prime fasi dello sviluppo embrionale.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Fred Hutchinson Cancer Research Center.

1. preparazione di monostrati AGM-CE per la co-cultura

  1. 24 h prima della dissezione AGM e ordinamento, fare filtro sterilizzare e terreni di coltura AGM-CE.
  2. Aggiungere la gelatina di 0,1% in acqua (100 µ l/pozzetto) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti aspirato la gelatina e lasciare il piatto in una cappa di coltura del tessuto con il coperchio rimosso fino a quando i pozzi sono asciutti.
  3. Dissociare la strati monomolecolari AGM-CE e la piastra per piastre da 96 pozzetti.
    Nota: Mantenere l'AGM-CE, preparato come descritto in precedenza16, in terreni di coltura AGM-CE. Per coerenza, linee cellulari AGM-CE dovrebbero essere congelate appena sufficienti numeri sono ottenuti (generalmente passaggio 1-3) e utilizzate in un numero definito di passaggio (in genere il passaggio 5-12) per gli esperimenti di co-coltura. Linee cellulari AGM-CE sono derivate da C57BL/6J (CD45.2) AGM. Vedi la Tabella materiali per tutte le composizioni multimediali.
    1. Aspirare i media dalla cultura AGM-CE in un pallone da2 di 75 cm e aggiungere 5 mL di PBS. Aspirare la PBS e aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina (Vedi Tabella materiali).
    2. Incubare a 37 ° C per 2-4 minuti fino a quando la maggior parte delle cellule sono sollevamento fuori la piastra. Aggiungere 7 mL di terreno di coltura di AGM-CE e dispensare 8 - 10 volte con una pipetta 10ml per preparare la sospensione di singole cellule e trasferire in una provetta da 15 mL.
    3. Girare a 300 x g per 5 min, rimuovere il supernatante, risospendere in terreni di coltura di 10ml AGM-CE e stimare il numero di cellulare con un emocitometro. Diluire le cellule ad una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL in terreni di coltura AGM-CE.
  4. Aggiungere 100 µ l AGM-CE cella sospensione (1 x 104 celle) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti gelatinizzata. Posto in un 37 ° C, 5% CO2 coltura tissutale incubatore durante la notte per consentire alla AGM-CE di allegare e formano un monostrato confluente.
    Nota: Distribuire uniformemente le cellule stromal AGM-CE c'è limitata crescita eccessiva o cella agglutinamento per ottima co-coltura.
  5. Preparare il monostrato di AGM-CE per AGM co-culture.
    1. La mattina seguente, preparare i supporti di privo di siero AGM.
    2. Usando una pipetta multicanale 12-pozzetti, rimuovere il supporto di cultura AGM-CE da AGM-CE e aggiungere 200 µ l/pozzetto di media privo di siero AGM senza citochine per lavare qualsiasi supporto contenente siero residuo.
    3. Rimuovere il supporto e aggiungere 200 µ l/pozzetto di media privo di siero AGM con citochine. Lavorare velocemente quando si rimuove e aggiungendo il supporto in modo che lo strato endoteliale non è compromessa; ad esempio, rimuovere e aggiungere nuovamente una riga media in un momento. Posizionare le piastre da 96 pozzetti in coltura tissutale incubatore a 37 ° C fino a quando le cellule embrionali sono pronte per l'ordinamento.

2. preparazione della sospensione singola cella da tessuti embrionali murini

  1. Sezionare l'AGM da accoppiamenti temporizzati.
    1. Impostare accoppiamenti temporizzati per la generazione di tessuti embrionali dell'età desiderata.
    2. Raccolta embrioni da femmine gravide al coitum dell'alberino di 9.5-11.5 giorni (dpc), a seconda della fase di pre-HSC per essere analizzati.
      Nota: Tessuti embrionali vengono raccolte da topi C57BL/6J (CD45.2) come descritto in precedenza e precisamente in fasi somite basata su conteggio16. Ci siamo concentrati sull'analisi delle popolazioni della regione di AGM embrionali e suo precursore, il P-Sp, tra E9.5 a E11.5, basata sulla stadiazione somite.
    3. Sezionare l'AGM da embrioni20.
      Nota: Protocolli dettagliati per la dissezione dell'AGM da embrioni murini sono stati pubblicati da altri20. In alternativa, vitellino o altri tessuti pretesi di avere attività pre-HSC potrebbero anche essere analizzati da questo metodo.
  2. Dissociare i tessuti embrionali dissecati.
    1. Raccogliere i tessuti dissecati in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di PBS con 10% FBS sul ghiaccio. Gravità stabilirsi tessuti, aspirare il PBS/FBS e quindi immediatamente aggiungere 1 mL di 0,25% collagenosi e posto in bagnomaria a 37 ° C per 25 min.
    2. Aggiungere 1 mL di PBS/10% FB e dispensare circa 20 - 30 volte con una punta di pipetta da 1 mL per ottenere una sospensione di singola cellula. Aggiungere un ulteriore 8 mL di PBS/10% FBS e cellule di centrifugare a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante.

3. anticorpo macchiatura delle cellule embrionali Murine

  1. Preparare il tampone bloccante per la macchiatura dell'anticorpo.
    1. Aggiungere 10 µ g/mL anti-mouse CD16/CD32 (blocco del recettore (FcR) di Fc) e 1 µ g/mL DAPI (1 mg/mL di brodo in H2O) a 1 mL di PBS con 10% FBS.
    2. Elaborare in una siringa da 3 mL e passare attraverso un filtro per siringa 0,22 µm per sterilizzare. Risospendere il pellet cellulare dai tessuti embrionali murini dissociati (dal punto 2.2.2) in 500 µ l blocco buffer e incubare in ghiaccio per 5 min.
  2. Preparare il mix di anticorpo17.
    1. Aggiungere il blocco di FcR 10 µ g/mL a 1 mL di PBS con 10% FBS e 10 µ l di ogni anticorpo di anti-VE-caderina fluorocromo-coniugate (CD144, vedere la Tabella materiali) e dell'anticorpo anti-EPCR fluorocromo-coniugate (CD201, Vedi Tabella materiali). Utilizzare una diluizione finale di 1: 100 di anticorpi, se non diversamente indicato basata sulle raccomandazioni del produttore o secondo titolazioni.
      Nota: Questa combinazione di anticorpo viene utilizzata per la definizione di cancelli per l'ordinamento, come descritto di seguito (punto 4.2). L'ordinamento in base il co-espressione di VE-caderina ed EPCR consente un arricchimento significativo per la parte di cellule derivate da AGM che contiene attività di precursore HSC, come descritto in precedenza17.
    2. Aggiungere altri anticorpi fluorocromo-coniugate per ulteriore analisi fenotipica dei singoli precursori indice ordinato.
      Nota: Questi anticorpi non sono necessariamente utilizzati per la definizione di cancelli per l'ordinamento. In questo protocollo di campione, abbiamo incluso PE-coniugato anti-CD41 anticorpo e l'anticorpo coniugato FITC anti-CD45 per analizzare l'espressione relativa di questi marcatori ematopoietici, che evolvono durante l'emersione di pre-HSC dall'endotelio hemogenic4 ,5,16,17. Altri markers di interesse possono essere incluse come desiderato. Campioni colorati con controlli di fluorocromo-coniugate dell'isotipo dell'anticorpo vengono utilizzati per definire gate di negativi e positivi per l'analisi.
    3. Redigere il mix di anticorpo in una siringa da 3 mL e passare attraverso un filtro per siringa 0,22 µm per sterilizzare. Aggiungere 500 µ l della miscela dell'anticorpo alla sospensione di cellule in tampone bloccante, pipetta per mixare e incubare in ghiaccio per almeno 15-20 min.
  3. Lavare le cellule marcate.
    1. Aggiungere 8 mL PBS/10% FBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, aspirato e risospendere le cellule a pellet con 1 mL PBS/10% FBS.
    2. Rimuovere grumi di cellule pipettando sospensione delle cellule attraverso un tappo filtro di cella μm 35 su una provetta da 5 mL. Lavare il filtro cella con un ulteriore 3 mL PBS/10% FBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, aspirare, risospendere in 500 µ l PBS/10% FBS e metterli su ghiaccio fino al FACS.

4. Indice ordinamento dei precursori Hemogenic singolo 96-pozzetti con lo Stroma AGM-CE per la co-cultura

  1. Preparare la macchina di FACS per modalità di piastra e allineare per l'ordinamento per piastre da 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore. Selezionare la modalità singola cella e indice ordinamento nel software per impostazioni di maschera di massima purezza e per consentire l'acquisizione di parametri di indice per ogni cella ordinato.
  2. Acquisire un campione di cellule dall'anticorpo macchiato campioni per impostare le porte per l'ordinamento.
    1. Caricare il campione di cellule macchiato sulla macchina FACS e acquisire le cellule alla minima portata. Plot FSC-A versi SSC-A e selezionare un cancello che include celle di varie dimensioni (Figura 1B) (che si basa sull'osservazione che attività di pre-HSC è identificato in cellule di profili di diverse dimensioni a AGM17). Trama: FSC-A versi FSC-W e SSC-A versi SSC-W e selezionare cancelli per escludere doppietti. Poi tracciare FSC-A versi DAPI a cancello cellule vive (negative per DAPI) (Figura 1B).
    2. Trama PECy7 (o il fluorocromo pertinente per la macchia di VE-caderina) contro PerCP (o il fluorocromo pertinente per la macchia EPCR). Le cellule che sono positive per VE-caderina (che comprende una popolazione mista di cellule endoteliali come progenitori ematopoietici e pre-HSC da AGM) e che hanno alta espressione EPCR (che arricchisce per pre-HSC dal P-Sp/AGM17) del cancello. Questa è la porta finale che verrà utilizzata per indicizzare sorta singole cellule in fase 4.3 (Figura 1B).
    3. Trama fluorocromi aggiuntivi utilizzati per la colorazione.
      Nota: A seconda la sottopopolazione per essere analizzati, porte aggiuntive possono essere impostate in base sulla rilevazione di altri marcatori incluso per la macchiatura delle celle. Tuttavia, l'ordinamento indice permette di registrare i parametri fluorescenti per ogni cella ordinato tale che questi parametri possono essere analizzati in modo retrospettivo. Così, ulteriori gating non è necessario a questo punto. Per tutte le impostazioni di FACS, campioni macchiati con gli anticorpi singoli devono essere utilizzati per regolare la compensazione, per tenere conto di ricaduta nell'emissione dei fluorocromi sovrapposti e con gli anticorpi di controllo isotipo, al conto per una colorazione di fondo e determinare cancelli di negativo/positivo.
  3. Indice di ordinare le celle AGM.
    1. Posto una piastra a 96 pozzetti preparata con lo stroma di AGM-CE in media senza siero AGM con citochine (dal punto 1.5.3) nel blocco piastra del sorter FACs. Caricare l'esempio e iniziare l'acquisizione del campione. Selezionare la modalità di ordinamento/singola cella di indice e iniziare sortingsingle cellule individuali 96-pozzetti. Utilizzare il più basso tasso di flusso per ridurre al minimo la sollecitazione di taglio sulle cellule embrionali.
    2. Garantire che tutti gli eventi vengono registrati durante l'ordinamento di indice. Ciò consentirà di enumerazione del numero totale delle cellule analizzate nel cancello ordinamento relativo per l'effettivi numeri ordinato ai singoli 96-pozzi, come non tutti gli eventi registrati verranno ordinati per pozzi.
    3. Una volta che le cellule sono state ordinate per un'intera piastra a 96 pozzetti, posizionare la piastra in un incubatore di coltura del tessuto a 37 ° C, impostato al 5% CO2. Ripetere per piastre aggiuntive richieste per ogni esperimento.
    4. Cellule di co-coltura individualmente ordinato a 96 pozzetti contenenti AGM-CE (dal punto 4.3) fino a 7 giorni (5 giorni per le celle filtrate dagli embrioni E11-11.5, 6 giorni da embrioni E10-10.5, 7 giorni da embrioni E9-9.5). Visualizzare colonie ematopoietiche di varie dimensioni e morfologie con un microscopio invertito a 100 ingrandimenti (Figura 2B) dopo il periodo di co-coltura.
      Nota: I media non ha bisogno di essere cambiato durante il periodo di co-coltura. Ordinato hemogenic precursori inizialmente possono integrare il livello di AGM-CE con una morfologia simile a CE e non possono essere inizialmente distinto dallo stroma AGM-CE (Figura 2A). Tuttavia, seguenti 24-48h in co-coltura, piccola, arrotondate cellule ematopoietiche o mazzi delle cellule possono essere rilevati. Alla fine di co-coltura (5-7 giorni), diverse colonie di cellule ematopoietiche possono essere visualizzati nel sottoinsieme di 96-pozzi che ha ricevuto un'ordinata delle cellule con potenziale ematopoietico clonale. Se visivamente ispezionati pozzetti contengono più di una colonia distinto, quindi in questo esempio viene escluso dall'analisi a valle per escludere campioni che potrebbero aver ricevuto più di una cella ordinata per pozzetto.

5. analisi della progenie ematopoietici clonali dopo co-coltura

  1. Cloni di raccolto da ogni 96 pozzetti per analisi al FACS.
    1. Vigorosamente dispensare a dissociare le cellule ematopoietiche da strati endothelial usando una pipetta multicanale con punte di pipetta 200 µ l. Cercate di non dissociare lo strato endoteliale. Rimuovere 100 µ l (~ 50% del campione) per analisi fenotipica di ematopoietico progenie di FACS.
    2. Versare in un piatto fondo V 96 pozzetti e centrifugare a 300 x g per 2 min agglomerare le cellule. Rimuovere il supporto scorrendo media dalla piastra con un unico movimento rapido, mentre la piastra è invertita (Scorri la piastra).
    3. Inserire le celle rimanenti 100 µ l nell'originale piastra a 96 pozzetti in un uso di incubatorfor di 37 ° C nel dosaggio successivo attecchimento (passaggio 6).
  2. Incubare le cellule con gli anticorpi adatti per analisi ematopoietico.
    1. Risospendere il pellet cellulare in ciascun pozzetto di una carena a V-96 pozzetti con 50 µ l di PBS/2% FBS contenente 10 µ g/mL FcR blocco e 1 µ g/mL DAPI. Incubare la piastra a 4 ° C per 5 min.
    2. Aggiungere 50 µ l di PBS/2% FBS contenente il blocco di FcR 10 µ g/mL e un mix di anticorpo per analisi HSC contenente PE-Cyanine7-coniugato anti-VE-caderina, PerCP-coniugati anti-CD45, PE-coniugato anti-EPCR, APC-coniugato anti-Sca1 e FITC Coniugato anti-Gr1 e anti-F4/80 (ogni anticorpo a diluizione finale di 1: 100 se non diversamente indicato basato sulle raccomandazioni del produttore o secondo titolazioni). Incubare la piastra a 4 ° C per almeno 20 min.
  3. Rimuovere l'anticorpo non legato con diluizioni sequenziale e analizzare le cellule.
    1. Aggiungere 200 µ l/pozzetto PBS/2% FBS e centrifugare a 300 x g per 2 min agglomerare le cellule. Quindi, scorri la piastra per scartare il surnatante e aggiungere 200 µ l PBS/2% FBS ad ogni pellet cellulare e centrifugare a 300 x g per 2 min agglomerare le cellule.
    2. Scorri a piastra per scartare il surnatante e aggiungere 50 µ l/pozzetto PBS/2% FBS per l'analisi. Procedere per analizzare le cellule di FACS utilizzando un citometro a flusso dotato di un lettore di piastra.
      Nota: Acquisire un volume fisso di cellule (ad es., 35 µ l del totale 50 µ l utilizzato per risospensione) per enumerare i sottoinsiemi della progenie ematopoietico.
  4. Analizzare i dati di FACS per ciascun pozzetto contenente ematopoietiche progenie alla schermata per le colonie che contengono potenziali HSC (Figura 3).
    1. Cancello in primo luogo la popolazione di CD45 positiva che è negativa per gli indicatori mieloidi Gr1 e F480. Non cancello le cellule che ancora esprimono bassi livelli di VE-caderina. Cellule dallo strato AGM-CE che sono interrotti durante la vendemmia delle colonie ematopoietiche sono VE-caderina positivo e negativo di CD45.
    2. Gate CD45+VE-Cad- / lowGr1 cellule F4/80– –più avanti il sottoinsieme che esprimono alti livelli di EPCR e Sca1 (Figura 3A -C).
      Nota: In studi precedenti, colonie carente di cellule con CD45+VE-Cad- / lowGr1––F4/80 Sca1CiaoEPCRCiao fenotipo (Figura 3D) riproducibile non è riuscito a fornire rilevabile attecchimento multilineare sangue periferico in topi irradiati destinatario17 (dati non mostrati); così, queste colonie non devono essere inclusi nell'analisi successivo trapianto nel passaggio 6.

6. analisi delle proprietà di Engraftment di singoli cloni e correlazione con proprietà fenotipiche delucidato da indice di ordinamento

  1. Il giorno della (se possibile) o la mattina seguente l'analisi fenotipica nel passaggio 5, ri-sospese le restanti cellule µ l 100 da ogni 96 pozzetti contenenti colonie ematopoietiche dopo co-coltura (dal passaggio 5.1) pipettando vigoroso utilizzando una punta di pipetta 200 µ l.
  2. Preparare e aggiungere celle di salvataggio intero midollo osseo del ceppo Congenici B6. SJL-PtprcunPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) topi adulti16,17.
    1. Contare le cellule nucleate del midollo osseo in soluzione turchi sotto un emocitometro. Diluire a una concentrazione di 5 x 105 nucleate cellule/mL in PBS con 2% FBS.
    2. Aggiungere 100 µ l di cellule del midollo osseo di salvataggio (5 x 104) ad ogni pozzetto contenente ematopoietiche progenie per analisi di trapianto e Miscelare pipettando.
  3. Progenie di trapianto dei singoli cloni in un unico irradiati letalmente destinatario Congenici ceppo B6. SJL-PtprcunPepcbtopo adulto di /BoyJ (CD45.1 B6).
    1. Letalmente irradiano lo stesso numero di topi B6 CD45.1 come il numero di cloni per iniettare individualmente la progenie di un singolo clone (utilizzando cGy 1.000 da una fonte di cesio).
    2. Disegnare 200 sospensione totale delle cellule di µ l (questo include le cellule dal clone così come cellule del midollo osseo di 5 x 104 B6 CD45.1 soccorso) in una siringa di insulina ½ mL con ago 29 G ½ pollice.
    3. Letalmente irradiare B6 CD45.1 destinatari adulti 2-24 h prima all'iniezione.
    4. Utilizzando un dispositivo di ritenuta di plastica del mouse che consente l'accesso di coda, iniettare tramite il volume di 200 µ l della vena della coda contenente entrambe le cellule da ogni clone e 5 x 104 B6 CD45.1 del midollo osseo adulto le cellule soccorso per aiutare nella sopravvivenza destinatario.
    5. Marchio auricolare e pesare i topi destinatari e controllare il loro peso/salute a intervalli regolari (ad esempio, 3 - 4 volte / settimana post trapianto di irradiazione, o per individuali e istituzionali delle procedure operative standard) per garantire una buona salute.
  4. Eseguire analisi di engraftment di sangue periferico ad intervalli regolari (ad es., 2, 16, 24 settimane) dopo trapianto.
    1. Rimuovere il 50-100 µ l di sangue tramite retro-orbitale sanguinare o un altro metodo di locazione sangue eticamente approvati.
    2. Aggiungere 3 mL di tampone di lisi (16,6 g NH4Cl, 2 g NaHCO3 e mg 74,4 EDTA a L 2 H2O) al sangue e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare a 300 x g per 5 min, aspirato e risospendere il pellet con 2 mL PBS/2% FBS. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
    3. Risospendere il pellet con blocco FcR di 150 µ l PBS/2% FBS contenente 10 µ g/mL e 1 µ g/mL DAPI e versare 1/3 del volume da un contenente controlli di isotipo 50 µ l per donatore e lignaggio, 1/3 ad un anticorpo contenente 50 µ l per donatore e isotype controlli per lignaggio e 1/3 ad un pozzo contenente 50 µ l anticorpi per rilevare donatore e del lignaggio.
      Nota: Gli anticorpi per il rilevamento di attecchimento multilineare: APCeFluor780-coniugato anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-coniugati anti-CD45.1, FITC Coniugato anti-CD3, PE-coniugato anti-F4/80, PerCP-coniugato anti-Gr1 e APC-coniugato anti-CD19, o isotype pertinenti controlli.
    4. Identificare cloni con attecchimento a lungo termine per valutare il contributo di sangue periferico da FACS nel tempo di CD45.2 (donatore)-derivato cellule ematopoietiche mieloidi (Gr1 e/o F4/80 positivo), delle cellule di B (CD19 positiva) e cellule T (CD3 positivi) (Figura 4A -B).
      Nota: Engraftment ematopoietico può essere analizzato anche da CD45.2 (donatore)-derivato contributo alle popolazioni ematopoietiche da tessuti raccolte da midollo osseo, milza, timo e peritoneo, o a seguito di trapianto secondario delle cellule del midollo osseo nei topi di B6 CD45.1 per analizzare seriale engraftment proprietà17.
  5. Correlare il proprietà fenotipiche di ogni clone come determinato dall'indice iniziale singola cella ordinamento con le sue proprietà di attecchimento. Utilizzando software di analisi di flusso, caricare i parametri di ordinamento per ogni cella di indice ordinato (correlato al 96-pozzo a cui è stato risolto). Mappa dati funzionali su diagrammi di flusso per valutare le proprietà fenotipiche delle singole cellule in relazione alla loro uscita funzionale (ad esempio, attecchimento a lungo termine, multilineare) (Figura 4).

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Risultati

Figura 1A Mostra un schema di disegno sperimentale. Una volta tessuti P-Sp/AGM sono dissecati, riuniti e dissociate in collagenasi, sono macchiati con gli anticorpi al VE-caderina ed EPCR indice dell'ordinamento. Pre-HSC sono arricchiti in cellule ordinate alla VE-caderina+EPCRalta (Figura 1B). È possibile includere in modo retrospettivo analizzare parametri fenotipici aggiuntivi, che vengono registrati per ...

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Discussione

Lo studio della Genesi HSC durante lo sviluppo embrionale necessita di mezzi per rilevare potenziali dei precursori hemogenic ancora manca la competenza per fornire a lungo termine multilineare ricostituzione ematopoietica nei destinatari adulti trapiantati HSC. In questo protocollo, presentiamo un'analisi clonale dei precursori embrionali hemogenic da co-stromal coltura su nicchia vascolare ECs da AGM, che sostiene la maturazione dei precursori di HSC, con successiva analisi funzionale in saggi di trapianto. Incorporazi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Andrew Berger, Stacey Dozono e Brian Raden nel Fred Hutchinson flusso Cytometry nucleo per assistenza con FACS. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione di istituti nazionali di salute NHLBI UO1 #HL100395, accessorie collaborativo Grant #HL099997 e NIDDK concedere #RC2DK114777. Brandon Hadland è supportato da di Alex Lemonade Stand della Fondazione e Hyundai Hope su ruote Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreni di coltura AGM-EC
Materiali per la coltura di cellule endoteliali
TrypLE ExpressGibco12605-028Da utilizzare per dissociare i monostrati AGM-EC
Gelatina 0,1% in acquaStemCell Technologies7903Da utilizzare per far aderire i monostrati AGM-EC alla plastica
Piastre per coltura tissutale a 96 pozzettiCorning3599Da utilizzare per la co-coltura di monostrati AGM-EC e cloni selezionati
per l'indice Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)Gibco14190-144Da utilizzare per la dissezione e la colorazione FACS
Flaconi filtranti da 500 mlFisher Scientific9741202Da utilizzare per filtrare in modo sterile Terreni di coltura endoteliali
AGM-EC (500 ml)
Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)Gibco12440-053400 ml di
siero fetale bovino HycloneFisher ScientificSH30088.03100 ml di
penicillina streptomicinaGibco15140-1225 ml di
eparinaSigmaH314950 mg disciolta in 10 ml di terreno
L-glutammina (200 mM)StemCell Technologies71005 ml
Mitogeno endoteliale (ECGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)Aggiungere 10 ml di terreno per sciogliere e aggiungere
Materiali per l'indice AGM sort
Collagenasi (0,25%)StemCell Technologies7902Utilizzare per la dissociazione dei tessuti embrionali
Siringa da 3 mlBD Biosciences309657Utilizzare per filtrare sterili le soluzioni anticorpali per FACS
0,22 e micro; M filtro a siringaMilliporeSLGP033RSUtilizzare per filtrare sterile le soluzioni anticorpali per FACS
Provetta in polistirene da 5 ml con tappoCorning352235Utilizzare per rimuovere i grumi cellulari prima del FACS
DAPI (preparato come stock da 1 mg/ml in H2O)Millipore268298Utilizzare per escludere le cellule morte dal tipo
anti-topo CD16/CD32 (blocco FcR)BD Biosciences553141Utilizzare per bloccare la colorazione non specifica dei recettori Fc
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7eBioscience25-1441-82Colorazione
ratto IgG1 kappa Controllo dell'isotipo, PE-Ciana7eBioscience25-4301-81Controllo dell'isotipo per CD144 PE-Cianina7
Anti-topo CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710eBioscience46-2012-80Colorazione
ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80Controllo dell'isotipo per CD201 PerCP-eFluor710
Anti-topo CD41 PEBD Biosciences558040Colorazione
ratto IgG1 kappa Controllo dell'isotipo, PEBD BiosciencesControllo dell'isotipo per CD41 PE
Anti-topo CD45 FITCeBioscience11-0451-85Colorazione
ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, FITCeBioscience11-4031-81Controllo dell'isotipo per CD45 FITC
AGM-terreni privi di siero (10 ml)
X-Vivo 20Lonza04-448Q10 ml di
fattore di cellule staminali murine ricombinanti (SCF)Peprotech250-0310 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 100 ng/ml
di FLT3 ricombinante umano (FLT3L)Peprotech300-1910 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 100 ng/ml
di trombopoietina umana ricombinante (TPO)Peprotech300-182 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 20 ng/ml
di interleuchina murina ricombinante 3 (IL3)Peprotech213-132 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 20 ng/ml
Materiali per la colorazione di cellule co-coltivate
96 pozzetti, fondo a VCorning3894Utilizzare per l'analisi FACS
Anticorpi per l'analisi di cloni selezionati in Index co-coltivati con cellule endoteliali
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-0451-82Colorazione
ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, PE-Cianina5.5eBioscience35-4031-80Controllo dell'isotipo per CD45 PerCP-Cianina5.5
Anti-topo CD201 (EPCR) PEeBioscience12-2012-82Colorazione
ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, PEeBioscience12-4031-81Controllo dell'isotipo per CD201 PE
Anti-topo Ly-6A / E (Sca-1) APCeBioscience17-5981-83Colorazione
ratto IgG2a kappa Controllo dell'isotipo, APCeBioscience17-4321-81Controllo dell'isotipo per Ly-6A/E APC
Anti-topo F4/80 FITCeBioscience11-4801-81Colorazione
ratto IgG2a kappa Controllo dell'isotipo, FITCeBioscience11-4321-41Controllo dell'isotipo per F4/80 FITC
Anti-topo Ly-6G/C (Gr1) FITCBD Biosciences553127Colorazione del
controllo dell'isotipo IgG2b kappa di ratto, FITCBD Biosciences556923Controllo dell'isotipo per Ly-6G/C e CD3 FITC
Materials per l'iniezione della vena caudale per trapianto
1/2 ml siringhe da insulina con aghi da 29G 1/2" BDBiosciences309306Utilizzare per l'iniezione della vena caudale per il trapianto
Anticorpi per l'analisi del sangue periferico dopo translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCPBiolegend108426Colorazione
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCPBiolegend400629Controllo dell'isotipo per Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PEeBioscience12-4801-82Colorazione
Controllo dell'isotipo di ratto IgG2a kappa, PEeBioscience12-4321-80Controllo dell'isotipo per F4/80 PE
Anti-topo CD3 FITCBD Biosciences555274Colorazione
Anti-topo CD19 APCBD Biosciences550992Colorazione del
ratto IgG2a kappa Controllo dell'isotipo, APCBD Biosciences553932Controllo dell'isotipo per CD19 APC
Anti-topo CD45.1 (A20) PE-Cianina7eBioscience25-0453-82Colorazione
ratto IgG2a kappa Controllo isotipico, PE-Cianina7eBioscience25-4321-81Controllo isotipo per CD45.1 PE-Cianina7
Anti-topo CD45.2 (104) APC-eFluor780eBioscience47-0454-82Colorazione
IgG2a kappa Controllo isotipico, APC-eFluor780eBioscience47-4321-80Controllo isotipo per CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II con software DIVABD Biosciences
BD FACSCanto II con lettore di piastreBD Biosciences
EmocitometroFisher ScientificS17040Per contare le cellule
Pipetta multicanaleFisher Scientific14-559-417Per
software di analisi FACSFlowJo/BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
filtrante di del del 553925 del piastra a del del del del di per celle di dispensazione

Riferimenti

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