Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

Summary

Qui presentiamo la metodologia per l'analisi clonale di cellule staminali ematopoietiche precursori durante lo sviluppo embrionale murino. Combiniamo Indice ordinamento delle singole cellule della regione di aorta-gonade-Mesonefro embrionale con co-coltura delle cellule endoteliali e trapianto per caratterizzare le proprietà fenotipiche e potenziale di attecchimento dei precursori ematopoietici singoli.

Abstract

La capacità di studiare la genesi di cellule staminali ematopoietiche (HSC) durante lo sviluppo embrionale è stata limitata dalla rarità dei precursori HSC nell'embrione precoce e la mancanza di saggi che funzionalmente identificare il potenziale di multilineage attecchimento a lungo termine di individuali presunti precursori HSC. Qui, descriviamo la metodologia che consente l'isolamento e la caratterizzazione dei precursori HSC funzionalmente validati a livello di singola cellula. In primo luogo, utilizziamo Indice ordinamento per catalogare il parametro fenotipico preciso di ciascuna cella individualmente ordinato, utilizzando una combinazione di marcatori fenotipici arricchire per precursori HSC con ulteriori indicatori per l'analisi sperimentale. In secondo luogo, è co-coltivata con lo stroma vascolare nicchia dalla regione dell'aorta-gonade-mesonephros (AGM), che sostiene la maturazione dei precursori HSC-di capacità di integrazione funzionale HSC con attecchimento multilineare, a lungo termine potenziale in ogni cella di indice ordinato saggi di trapianto. Questa metodologia consente la correlazione di proprietà fenotipiche dei precursori hemogenic clonale con il loro potenziale di attecchimento funzionale o altre proprietà quali profilo trascrizionale, fornendo un mezzo per l'analisi dettagliata del precursore HSC sviluppo a livello di singola cellula.

Introduction

Clonali studi hanno rivelato eterogeneità nelle proprietà dell'attecchimento a lungo termine di HSCs adulto, fornendo informazioni nuovi sottotipi di HSC e cambiamenti nel comportamento HSC durante invecchiamento¹. Tuttavia, studi simili di HSCs embrionali e loro precursori sono stati più impegnativo. Durante lo sviluppo embrionale precoce, HSCs derivano da una popolazione di precursori noto come endotelio hemogenic in un processo transitorio di cui al come l'endoteliale a transizione ematopoietiche². Il primo HSC, definiti dalla loro capacità di fornire attecchimento multilineare robusto, a lungo termine dopo trapianto ....

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Fred Hutchinson Cancer Research Center.

1. preparazione di monostrati AGM-CE per la co-cultura

1. 24 h prima della dissezione AGM e ordinamento, fare filtro sterilizzare e terreni di coltura AGM-CE.
2. Aggiungere la gelatina di 0,1% in acqua (100 µ l/pozzetto) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti aspirato la gelatina e lasciare il piatto in una cappa di coltura del tessuto con il coperchio rimosso fino a quando i pozzi sono asciutti.
3. Dissociare....

Results

Figura 1A Mostra un schema di disegno sperimentale. Una volta tessuti P-Sp/AGM sono dissecati, riuniti e dissociate in collagenasi, sono macchiati con gli anticorpi al VE-caderina ed EPCR indice dell'ordinamento. Pre-HSC sono arricchiti in cellule ordinate alla VE-caderina⁺EPCR^alta (Figura 1B). È possibile includere in modo retrospettivo analizzare parametri fenotipici aggiuntivi, che vengono registrati per .......

Discussion

Lo studio della Genesi HSC durante lo sviluppo embrionale necessita di mezzi per rilevare potenziali dei precursori hemogenic ancora manca la competenza per fornire a lungo termine multilineare ricostituzione ematopoietica nei destinatari adulti trapiantati HSC. In questo protocollo, presentiamo un'analisi clonale dei precursori embrionali hemogenic da co-stromal coltura su nicchia vascolare ECs da AGM, che sostiene la maturazione dei precursori di HSC, con successiva analisi funzionale in saggi di trapianto. Incorporazi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Terreni di coltura AGM-EC
Materiali per la coltura di cellule endoteliali
TrypLE Express	Gibco	12605-028	Da utilizzare per dissociare i monostrati AGM-EC
Gelatina 0,1% in acqua	StemCell Technologies	7903	Da utilizzare per far aderire i monostrati AGM-EC alla plastica
Piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti	Corning	3599	Da utilizzare per la co-coltura di monostrati AGM-EC e cloni selezionati
per l'indice Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)	Gibco	14190-144	Da utilizzare per la dissezione e la colorazione FACS
Flaconi filtranti da 500 ml	Fisher Scientific	9741202	Da utilizzare per filtrare in modo sterile Terreni di coltura endoteliali
AGM-EC (500 ml)
Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)	Gibco	12440-053	400 ml di
siero fetale bovino Hyclone	Fisher Scientific	SH30088.03	100 ml di
penicillina streptomicina	Gibco	15140-122	5 ml di
eparina	Sigma	H3149	50 mg disciolta in 10 ml di terreno
L-glutammina (200 mM)	StemCell Technologies	7100	5 ml
Mitogeno endoteliale (ECGS)	Alfa Aesar	J64516 (BT-203)	Aggiungere 10 ml di terreno per sciogliere e aggiungere
Materiali per l'indice AGM sort
Collagenasi (0,25%)	StemCell Technologies	7902	Utilizzare per la dissociazione dei tessuti embrionali
Siringa da 3 ml	BD Biosciences	309657	Utilizzare per filtrare sterili le soluzioni anticorpali per FACS
0,22 e micro; M filtro a siringa	Millipore	SLGP033RS	Utilizzare per filtrare sterile le soluzioni anticorpali per FACS
Provetta in polistirene da 5 ml con tappo	Corning	352235	Utilizzare per rimuovere i grumi cellulari prima del FACS
DAPI (preparato come stock da 1 mg/ml in H2O)	Millipore	268298	Utilizzare per escludere le cellule morte dal tipo
anti-topo CD16/CD32 (blocco FcR)	BD Biosciences	553141	Utilizzare per bloccare la colorazione non specifica dei recettori Fc
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7	eBioscience	25-1441-82	Colorazione
ratto IgG1 kappa Controllo dell'isotipo, PE-Ciana7	eBioscience	25-4301-81	Controllo dell'isotipo per CD144 PE-Cianina7
Anti-topo CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710	eBioscience	46-2012-80	Colorazione
ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, PerCP-eFlour710	eBioscience	46-4031-80	Controllo dell'isotipo per CD201 PerCP-eFluor710
Anti-topo CD41 PE	BD Biosciences	558040	Colorazione
ratto IgG1 kappa Controllo dell'isotipo, PE	BD Biosciences	Controllo dell'isotipo per CD41 PE
Anti-topo CD45 FITC	eBioscience	11-0451-85	Colorazione
ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, FITC	eBioscience	11-4031-81	Controllo dell'isotipo per CD45 FITC
AGM-terreni privi di siero (10 ml)
X-Vivo 20	Lonza	04-448Q	10 ml di
fattore di cellule staminali murine ricombinanti (SCF)	Peprotech	250-03	10 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 100 ng/ml
di FLT3 ricombinante umano (FLT3L)	Peprotech	300-19	10 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 100 ng/ml
di trombopoietina umana ricombinante (TPO)	Peprotech	300-18	2 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 20 ng/ml
di interleuchina murina ricombinante 3 (IL3)	Peprotech	213-13	2 ml (100 mg/ml stock) Concentrazione finale 20 ng/ml
Materiali per la colorazione di cellule co-coltivate
96 pozzetti, fondo a V	Corning	3894	Utilizzare per l'analisi FACS
Anticorpi per l'analisi di cloni selezionati in Index co-coltivati con cellule endoteliali
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5	eBioscience	45-0451-82	Colorazione
ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, PE-Cianina5.5	eBioscience	35-4031-80	Controllo dell'isotipo per CD45 PerCP-Cianina5.5
Anti-topo CD201 (EPCR) PE	eBioscience	12-2012-82	Colorazione
ratto IgG2b kappa Controllo dell'isotipo, PE	eBioscience	12-4031-81	Controllo dell'isotipo per CD201 PE
Anti-topo Ly-6A / E (Sca-1) APC	eBioscience	17-5981-83	Colorazione
ratto IgG2a kappa Controllo dell'isotipo, APC	eBioscience	17-4321-81	Controllo dell'isotipo per Ly-6A/E APC
Anti-topo F4/80 FITC	eBioscience	11-4801-81	Colorazione
ratto IgG2a kappa Controllo dell'isotipo, FITC	eBioscience	11-4321-41	Controllo dell'isotipo per F4/80 FITC
Anti-topo Ly-6G/C (Gr1) FITC	BD Biosciences	553127	Colorazione del
controllo dell'isotipo IgG2b kappa di ratto, FITC	BD Biosciences	556923	Controllo dell'isotipo per Ly-6G/C e CD3 FITC
Materials per l'iniezione della vena caudale per trapianto
1/2 ml siringhe da insulina con aghi da 29G 1/2" BD	Biosciences	309306	Utilizzare per l'iniezione della vena caudale per il trapianto
Anticorpi per l'analisi del sangue periferico dopo translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP	Biolegend	108426	Colorazione
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP	Biolegend	400629	Controllo dell'isotipo per Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE	eBioscience	12-4801-82	Colorazione
Controllo dell'isotipo di ratto IgG2a kappa, PE	eBioscience	12-4321-80	Controllo dell'isotipo per F4/80 PE
Anti-topo CD3 FITC	BD Biosciences	555274	Colorazione
Anti-topo CD19 APC	BD Biosciences	550992	Colorazione del
ratto IgG2a kappa Controllo dell'isotipo, APC	BD Biosciences	553932	Controllo dell'isotipo per CD19 APC
Anti-topo CD45.1 (A20) PE-Cianina7	eBioscience	25-0453-82	Colorazione
ratto IgG2a kappa Controllo isotipico, PE-Cianina7	eBioscience	25-4321-81	Controllo isotipo per CD45.1 PE-Cianina7
Anti-topo CD45.2 (104) APC-eFluor780	eBioscience	47-0454-82	Colorazione
IgG2a kappa Controllo isotipico, APC-eFluor780	eBioscience	47-4321-80	Controllo isotipo per CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II con software DIVA	BD Biosciences
BD FACSCanto II con lettore di piastre	BD Biosciences
Emocitometro	Fisher Scientific	S17040	Per contare le cellule
Pipetta multicanale	Fisher Scientific	14-559-417	Per
software di analisi FACS	FlowJo/BD Biosciences		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo