Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.
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Articolo metodologico
Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up
In questo articolo
Sommario
Abstract
Leucemia mieloide acuta (AML) è un eterogeneo e se non trattata, la malattia mortale. È la causa più comune di mortalità per leucemia-collegato in adulti. Inizialmente, AML è una malattia delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) caratterizzata da arresto di differenziazione, conseguente accumulo delle cellule di scoppio di leucemia e ha ridotto la produzione di elementi funzionali ematopoietici. Eterogeneità si estende alla presenza di cellule staminali leucemia (LSC), con questa dinamica cella vano in evoluzione per superare varie pressioni di selezione imposto durante il trattamento e la progressione della leucemia. Per definire ulteriormente la popolazione di LSC, l'aggiunta di CD90 e CD45RA permette la discriminazione di HSCs normali e di progenitori multipotenti all'interno dello scompartimento CD34 + CD38-cella. Qui, descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di diversi markers putativi di LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) su cellule primarie di scoppio di AML umano mediante citometria a flusso multiparametrica. Inoltre, mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti. Questo metodo di rilevazione e quantificazione di putativi LSC può essere utilizzati per il follow-up clinico della risposta di chemioterapia (cioè., malattia residua minima), come residuo LSC può causare la ricaduta AML.
Introduzione
Leucemia mieloide acuta (AML) è la più comune causa di mortalità per leucemia-collegato. Inizialmente, AML è una malattia clonale di cellule staminali ematopoietiche (HSC) caratterizzata da arresto di differenziazione, conseguente accumulo delle cellule di scoppio e ha ridotto la produzione di elementi funzionali ematopoietici. Recentemente, clonale eterogeneità della popolazione cellulare blast è stata stabilita essenzialmente utilizzando strategie di sequenziamento (NGS) prossime generazione e mostrando l'esistenza di sviluppo intra-clonale di cellule di tumore1.
Eterogeneità si estende alla presenza di cellule sta....
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Protocollo
Seguiamo gli standard europei per l'uso di animali per scopi scientifici. Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale (n. 3097-2015120414583482v3).
1. preparazione del campione
- Raccogliere midollo osseo (2 mL) da de novo AML in provette contenenti l'acido etilendiamminotetracetico dell'anticoagulante (EDTA) ad una concentrazione di 1,8 mg / mL di midollo osseo.
- Eseguire Ficoll separazione, una separazione di gradienti di densità per isolare le cellule mononucleari da globuli rossi e granulociti, come seguito. Diluire il midollo osseo in 3 volumi di soluzione salina tampone fosfato (PBS: 137mm NaCl,....
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Risultati
Qui presentiamo un metodo per determinare le popolazioni di cellule progenitrici in campioni normali e maligne del midollo osseo umano. Abbiamo raccolto della milza e del midollo osseo da un successo PDX ed eseguita la citometria a flusso multiparametrica come descritto sopra. Abbiamo confrontato diverse sottopopolazioni delle cellule di scoppio tra il campione diagnostico del paziente e il corrispondente PDX e particolarmente, il vano di CD34 + CD38-progenitore, in particolare arricchite nel presunto LSC. Abbiamo trovat.......
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Discussione
Una valutazione accurata e riproducibile di membrana o marcatori citoplasmatici mediante citometria a flusso è necessario che le impostazioni dello strumento vengono verificate ogni giorno per allineamento ottico, corretto funzionamento del sistema fluidico, sensibilità ottica e standardizzazione usando le perle di calibrazione.
Rilevazione di popolazioni di cellule di scoppio in AML con CD90 e CD45RA attraverso l'analisi di citometria a flusso multiparametrica è un metodo relativamente sempli.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte il francese Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (centro nord), Fondation de France (Comitato di leucemia), Oncolille SIRIC e francese National Cancer Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| Tampone di lisi dei globuli rossi (10x) | Ozyme | BLE420301 | Soluzione di lisi dei globuli rossi A : 8,29 g di NH4Cl + 0,037 g di Na2EDTA in 100 mL di H2O sterile e soluzione di lisi dei globuli rossi B: 1 g di KHCO3 in 100 mL di H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγ cnull (NSG) topi | JACKSON LABORATORY | Codice prodotto: 005557 | |
| PBS | Gibco di life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – Tampone di separazione MACS | Tampone MACS Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coltro | B13647 | |
| Set di flusso | Beckman Coulter | A63492 | |
| Controllo del flusso | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| Kit di selezione dell'EP umano EasySep | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnete | Tecnologie delle cellule staminali | 18551 |
Riferimenti
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One.
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Ristampe e permessi
